趙夢,劉卓雅,于嘉敏,王芮, 范銘婕,喬宏志,3

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中藥功效物質重點實驗室,江蘇 南京 210023;3.江蘇省中藥高效給藥系統工程技術研究中心,江蘇 南京 210023)

吳茱萸堿(Evodiamine,EVO)是蕓香科植物吳茱萸、石虎和疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實中的主要生物堿成分,具有抗腫瘤、抗胃潰瘍、抗炎、抗肥胖等多種藥理活性[1],但存在水溶性差、生物利用度低等弊端。為了克服上述問題,研究人員制備了脂質體[2-4]、脂質納米粒[5]等脂基新制劑,均顯示出對EVO成藥性的改善作用。

近年來,從多種植物鮮榨汁中分離到一種以脂質雙層為基本骨架,包含蛋白、核酸等活性成分的泡狀納米結構,被命名為細胞外囊泡樣納米粒(Extracellular vesicle-like nanoparticles,EVNs)[6]。EVNs保留了原植物的組成和活性功能,在腫瘤、腸炎、酒精肝、肺纖維化等疾病的治療方面有明顯療效[7]。此外,從EVNs提取的脂質還可用于裝載親疏水小分子藥物及核酸藥物等[8-10],發(fā)揮載體作用。例如將6-姜烯酚載入生姜EVNs來源脂質后,可減緩釋藥速度,提高生物利用度,用于治療結腸炎[11]。有報道顯示EVNs來源的脂質還具有特定的轉運趨向性,可以引導藥物到達特定的部位。例如生姜EVNs脂質中含有的磷脂酸與EVNs在腸道的積累相關,磷脂酰膽堿促進EVNs從腸道向肝臟轉移[12];用葡萄柚EVNs脂質制備的納米粒能攜帶JSI-124靶向抑制腫瘤生長[9]。

生姜是常見的藥食同源中藥，生姜來源的EVNs對結腸炎[13]、牙周炎[14]、酒精性肝損傷[15]等多種疾病有效。目前已有研究通過脂質譜學分析，證明生姜來源EVNs中含有多種脂質成分，例如磷脂酸(PA)、雙半乳糖甘油二酯(DGDG)、單半乳糖甘油二酯(MGDG)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰肌醇(PI)等[16]。本文以生姜來源EVNs為對象，提取其脂質用于EVO的裝載，將考察脂質提取條件、載EVO脂質體(EVO@Lipo)的工藝影響因素及體外釋藥行為，以期改善EVO成藥性，考察生姜EVNs來源脂質的載釋藥性能。

1 材料與方法

1.1 儀器

美的MJ-WJE2802D榨汁機(美的集團有限公司);Optima XP1超速離心機(美國Beckman Coulter公司);Regulus 8100掃描電子顯微鏡(日本日立公司);Eppendorf低溫臺式離心機(德國Eppendorf公司);NanoSight NS300納米顆粒跟蹤分析儀(英國Malvern公司);Zetasizer Nano-ZS90(英國 Malvern公司);BT 25S十萬分之一天平、Waters E2695 HPLC(美國Waters公司);THZ-C恒溫震蕩箱(蘇州培英公司);JY96-ⅡN超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);PB-10標準型pH計(德國Sartorius公司);DSC 214差示掃描量熱儀(德國耐馳);紅外分光光度計(美國Thermo公司);Milli-Q純水系統(美國Millipore公司)。

1.2 試劑

鮮生姜購于山東濰坊,經南京中醫(yī)藥大學中藥資源教研室胡楊老師鑒定為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖;甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙腈、二氯甲烷(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);8 000～14 000 Da透析袋、吳茱萸堿(上海源葉生物科技有限公司,吳茱萸堿分子量:303.36,批號:X26A8P34704,純度>98%);乙腈(色譜純,美國默克公司);10×PBS緩沖液干粉(pH 7.4,南京邁博生物科技有限公司);0.45 μm微孔濾膜(南京邁博生物科技有限公司);ODS-2 C18柱(江蘇漢邦科技有限公司)。

1.3 EVNs分離和表征

采用差速離心法提取EVNs,將生姜清洗干凈,榨汁,汁液加入相同體積的1×PBS緩沖液(pH 7.4),置于離心管中4 000×g離心1 h,去除大塊組織,取上清,10 000×g離心1 h,離心后取上清,120 000×g超高速離心2 h,將下層沉淀用適量PBS分散得到EVNs,用濃度為8%、30%、45%、60%的蔗糖進行密度梯度離心,120 000×g超高速離心2 h,收集條帶,置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取EVNs稀釋后采用納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)測定粒徑,動態(tài)光散射儀(DLS)測定多分散系數(PDI)及Zeta電位,并將EVNs烘干,噴金鍍膜后,使用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察EVNs的形貌。

1.4 脂質提取和溶劑篩選

取1 mL EVNs(1×1010mL-1),加入有機溶劑3.75 mL,渦旋混勻后再加入有機溶劑和水各1 mL,混勻,22 ℃下2 000 r·min-1離心10 min[16],取有機層旋轉蒸發(fā)溶劑得到干燥脂膜,稱質量。以脂質與EVNs干質量的比值計算脂質提取率。

以脂質提取率、脂質體粒徑和濃度為指標,篩選脂質提取的最適溶劑。選取的有機溶劑分別為:三氯甲烷、乙醇-三氯甲烷、丙酮-三氯甲烷、甲醇-三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷、乙醇-二氯甲烷-乙醇、乙腈-二氯甲烷、乙腈-三氯甲烷、二氯甲烷-三氯甲烷,丙酮-二氯甲烷共11組,其中混合溶劑的比例均為2∶1。

1.5 EVO體外分析方法建立

1.5.1 色譜條件 色譜柱:ODS-2 C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(55∶45,v/v);檢測波長:225 nm;柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL·min-1;進樣量:20 μL。

1.5.2 專屬性考察 稱取處方量的脂質,制備空白脂質體(Lipo)及EVO@Lipo,取1 mL至10 mL容量瓶中,加入三氯甲烷-甲醇(1∶1,v/v)超聲破乳,并稀釋定容至10 mL,15 000 r·min-1離心15 min,取上清及EVO對照品溶液各20 μL進樣分析。

1.5.3 標準曲線 以甲醇為溶劑,制備濃度為1、5、10、20、100 μg·mL-1的EVO對照品溶液,15 000 r·min-1離心15 min,取上清按色譜條件測定,以藥物濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,制作標準曲線。

1.6 EVO@Lipo的制備與包封率測定

取0.2 mg EVO及脂質溶于甲醇-三氯甲烷中,超聲溶解,于37 ℃真空旋轉蒸發(fā)至溶劑揮干,形成干燥薄膜,向燒瓶中加入1 mL超純水,超聲水化,探頭超聲(工作1 s,間歇1 s),空白脂質體的制備方法除不加入EVO外,其余步驟與條件相同。

取1 mL EVO@Lipo溶液,過0.45 μm濾膜,取過膜后的液體1 mL,加入1 mL三氯甲烷-甲醇(1∶1,v/v)超聲破乳,置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋定容,隨后15 000 r·min-1離心15 min,取上清測定含量,得到其質量記為WLipo。取脂質體1 mL,加入1 mL三氯甲烷超聲破乳,置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋定容,15 000 r·min-1離心15 min,取上清測定含量,得到其質量記為WTotal。包封率(Encapsulation efficiency,EE%)按下式計算:

1.7 處方及制備工藝優(yōu)化

1.7.1 影響因素考察 由于本實驗脂質的組成由提取溶劑決定,故提取溶劑是本實驗重要的影響因素,除此之外,在脂質體的制備過程中,藥載比也是常見且重要的影響因素。經過前期的因素篩選,我們發(fā)現脂質體的制備過程中探頭超聲的條件會造成粒徑及粒子濃度的變化,因此我們對超聲過程的時間及功率進行單因素篩選,并對脂質體的粒徑及粒子濃度進行測定,觀察其變化。

1.7.2 正交試驗 為確定脂質體載藥的最優(yōu)條件,以提取溶劑、藥脂比、超聲條件3個因素設計L9(33)正交試驗,通過包封率進行篩選。

1.8 EVO@Lipo的表征

1.8.1 形貌 取EVO@Lipo稀釋后將其烘干,噴金鍍膜后,使用SEM觀察形貌。

1.8.2 粒徑、PDI、電位 取EVO@Lipo稀釋后采用NTA測定粒徑,DLS測定PDI及Zeta電位。

1.8.3 差示掃描量熱(DSC)分析 取EVO、Lipo、物理混合物及EVO@Lipo的凍干樣品置于坩堝內,測定0～300 ℃的DSC曲線。

1.8.4 傅里葉變換紅外光譜(FTIR) 取EVO、Lipo、物理混合物及EVO@Lipo的凍干樣品,KBr壓片后,在400～4 000 cm-1波數范圍內進行掃描分析。

1.9 體外釋放度測定

選擇膜透析法測定脂質體的體外釋放度[3]。釋放介質為30%乙醇的PBS溶液(pH 1.2、pH 6.8),精密吸取EVO及EVO@Lipo溶液各3份,置于處理好的透析袋中(Mw=8 000～14 000 Da),密封后置于100 mL釋放介質中,在37 ℃,100 r·min-1條件下恒溫震蕩。分別在0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h吸取透析液2 mL,并立即補充等量同溫度的釋放介質,保持藥物釋放處于漏槽狀態(tài)。隨后將樣品過0.45 μm的濾膜,取續(xù)濾液進行含量測定,計算累計釋放量Qn和釋放百分率F。

式中Cn為第n次取樣時的EVO濃度,Ci為第i次取樣時的EVO濃度,V0為釋放介質體積,Vi為每次取樣的體積,W為樣品中EVO總量。

1.10 數據分析

2 結果

2.1 EVNs的表征

2.1.1 形貌 如圖1所示,提取得到的EVNs形貌為不規(guī)則圓球狀,粒子大小為200 nm左右。

圖1 EVNs的SEM圖像

2.1.2 粒徑、PDI、Zeta電位 如表1所示,提取的EVNs平均粒徑為(230.4±3.3)nm,與SEM圖像中的結果一致。

表1 EVNs的粒徑、PDI及Zeta電位

2.2 EVO體外分析方法建立

2.2.1 專屬性 如圖2所示，EVO的HPLC圖譜中,脂質體在EVO出峰的位置沒有雜峰干擾,表明專屬性符合測試要求。

圖2 EVO及EVO@Lipo溶液的HPLC圖

2.2.2 標準曲線 標準曲線方程為Y=301 768X+81 082,R2=1,EVO在1～100 μg·mL-1峰面積與濃度呈現良好的線性關系。該測定方法及條件下,EVO的精密度重復性、回收率、穩(wěn)定性均符合要求。在液相條件下未檢出EVO,表明其在水中的溶解度極低。

2.3 EVO@Lipo處方工藝篩選

2.3.1 脂質提取溶劑篩選 如表2所示,三氯甲烷、甲醇-三氯甲烷、乙醇-二氯甲烷、二氯甲烷-三氯甲烷組脂質提取率大于5%,其中乙醇-二氯甲烷組提取率接近10%,其余各組脂質提取率均較低。制備得到的空白脂質體粒徑均處于100～200 nm,其粒子濃度也處于同一數量級1010。三氯甲烷、乙醇-三氯甲烷、甲醇-三氯甲烷、二氯甲烷、乙醇-二氯甲烷、丙酮-二氯甲烷組粒度RSD值小于0.02。

表2 不同提取溶劑下脂質提取率及空白脂質體粒徑

綜合以上指標的分析,可以優(yōu)先選用三氯甲烷、甲醇-三氯甲烷、乙醇-二氯甲烷3組進行后續(xù)實驗,乙醇-三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮-二氯甲烷3組作為備選。

2.3.2 超聲因素考察 結果見表3～4,當超聲時間改變時粒徑及粒子濃度變化較大,故選擇超聲時間為影響因素進行正交試驗,超聲功率選用60 W。

表3 超聲時間對粒徑的影響

表4 超聲功率對粒徑的影響

2.3.3 正交試驗 以A(脂質提取溶劑),B(藥脂比),C(超聲時間)為3個因素,進行L9(33)正交試驗,見表5。

表5 正交試驗因素

從表6中數據可得，極差分析證明，各因素對包封率的影響程度為：B>A>C，最佳實驗組合為A2B3C3，即以甲醇-三氯甲烷為脂質提取溶劑，藥脂比為1∶50，超聲總時長為15 min，經驗證，該處方的包封率為88.21%，藥物濃度為16.7 μg·mL-1。方差分析結果顯示3種因素對包封率的影響不顯著(表7)。

表6 正交試驗分組及結果

表7 正交試驗方差分析

2.4 EVO@Lipo表征

2.4.1 形貌 SEM觀察顯示,EVO@Lipo的外觀呈球形,分散較均勻,無明顯聚集現象,粒徑約150 nm。見圖3。

圖3 EVO@Lipo的SEM圖像

2.4.2 粒徑、PDI、Zeta電位 制備得到的EVO@Lipo平均粒徑為(194.9±2.4)nm,PDI為0.22±0.01,證明其均一性良好,Zeta電位為(-35.3±1.16)mV，證明該體系穩(wěn)定。見表8。

表8 EVO@Lipo的粒徑、PDI及Zeta電位

2.4.3 DSC分析 如圖4可見,對DSC曲線進行分析,EVO的熔融吸熱峰位于286 ℃,Lipo在129 ℃出現吸熱峰;二者的物理混合物分別在126 ℃及274 ℃有2個吸熱峰,其中EVO吸熱峰的偏移可能暗示在加熱過程中有新相形成;EVO@Lipo的吸熱峰出現在139 ℃,且不存在EVO的吸熱峰,證明EVO可能以分子或無定型相態(tài)存在。

圖4 DSC曲線變化

2.4.4 傅里葉變換紅外光譜 如圖5所示，EVO的紅外光譜圖中,3 220 cm-1為N—H的伸縮振動吸收峰,1 700～1 600 cm-1之間的峰為苯環(huán)骨架伸縮振動峰,它們是苯環(huán)的特征振動,除此之外,1 629 cm-1為C=O的伸縮振動吸收峰;Lipo在3 374 cm-1及2 930 cm-1分別出現O—H伸縮振動及C—H伸縮振動吸收峰;在物理混合物中,1 629 cm-1為EVO的C=O伸縮振動吸收峰,2 931 cm-1為脂質的C—H伸縮振動吸收峰,基本是二者各自圖譜的疊加,而在EVO@Lipo中,EVO的N—H伸縮振動吸收峰為3 221 cm-1,C=O伸縮振動吸收峰移動至1 606 cm-1,C—H伸縮振動吸收峰移動至2 941 cm-1,證明EVO與脂質發(fā)生了相互作用。

圖5 紅外圖譜變化

2.5 體外釋放度實驗

如圖6所示,當pH為1.2和6.8時,對照品EVO在1 h時釋放度均到達50%,2 h時,釋放度分別達到76%和85%;而將其制備成脂質體后,在24 h內,其體外釋藥速度降低,說明將EVO制備成脂質體后,具有一定的緩釋作用。

圖6 EVO及EVO@Lipo在PBS中的累計釋放度

3 討論

EVNs具有蛋白脂質膜結構,被膜材料包裹的囊腔為活性分子的裝載提供了空間,具有廣泛的運載能力,可裝載親疏水藥物和核酸藥物等[8-9]。此外,借助其納米級特性,EVNs還可以改善藥物的滲透性和組織滲透性。EVNs通常以2種方式作為載體,一種是直接使用分離的EVNs進行藥物裝載,另一種方法是提取EVNs的脂質組分并重新組裝,或插入功能基團作為復合載體。目前囊泡類載體的載藥方法主要包括共孵育、電穿孔、超聲、凍融、皂苷增溶等[17]。除了直接將EVNs用作藥物載體,大多數會先提取EVNs的脂質后再進行載藥或工程化修飾,該過程去除了蛋白、核酸等水性成分,既有利于減少免疫原性,也避免制備載藥制劑過程因有機溶劑的加入導致蛋白等成分的沉淀。

EVO作為一種具有多種藥理活性的生物堿類化合物,存在水溶性差,生物利用度低等問題,可采用制劑學手段加以改善。在本文中,我們從生姜EVNs中提取脂質,制備載EVO的脂質體。通過不同提取溶劑的篩選,可以變換處方中的脂質組成,最終制備的載藥脂質體能增大EVO的溶解度,并使其在體外緩慢釋放,從不同pH條件下的溶出曲線看,EVO的釋放并未受pH變化影響。本研究為研發(fā)藥源性功能載體,以期協同增強EVO的藥效提供了參考方法。