曾平,閆玉梅，郁紅禮,3,4,吳皓,3,4,陶興寶,謝雨薇,程硯秋,王彩霞,王賀鵬,陳勁松

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.精華制藥集團(tuán)股份有限公司，江蘇 南通 226000；3.江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023;4.國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心,江蘇 南京 210023;5.四川仟源中藥飲片有限公司,四川 廣漢 618304)

膽南星(Arisaema cum Bile)是天南星的常用炮制品之一,由制天南星的細(xì)粉與牛、羊或豬膽汁加工而成,或由生天南星細(xì)粉與牛、羊或豬膽汁發(fā)酵加工而成,具有清熱化痰、息風(fēng)定驚之功,臨床常用于治療中風(fēng)痰迷、癲狂驚癇等癥[1]?！侗静輩R言》有云:“如小兒驚風(fēng)驚痰,四肢搐搦,……非膽星不能療也”[2]?，F(xiàn)代臨床文獻(xiàn)亦顯示膽南星常用于治療小兒熱性驚厥[3]。熱性驚厥是兒童常見(jiàn)疾病,現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為該病發(fā)生與免疫炎癥過(guò)程密切相關(guān),炎癥因子大量釋放引起機(jī)體發(fā)熱,進(jìn)而引起下丘腦及海馬等腦區(qū)神經(jīng)元興奮,形成異常放電，導(dǎo)致熱性驚厥發(fā)生[4]。長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)發(fā)作的熱性驚厥可引起海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷，誘發(fā)腦內(nèi)炎癥反應(yīng),進(jìn)一步導(dǎo)致驚厥發(fā)作、神經(jīng)元細(xì)胞損傷等[5]。文獻(xiàn)顯示膽南星具有抗炎[6]、鎮(zhèn)靜[7]等藥理作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)膽南星具有顯著的抗驚厥作用[8],但其抗熱性驚厥藥效作用及其機(jī)制不明。本研究基于熱性驚厥發(fā)病機(jī)制構(gòu)建熱性驚厥小鼠模型[9],考察膽南星拮抗熱性驚厥模型小鼠腦組織損傷、炎癥的影響,為膽南星抗熱性驚厥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥與儀器

膽南星(四川仟源中藥飲片公司,批號(hào):190401);戊四氮(上海麥克林生化科技有限公司,貨號(hào):P815563-5g);丙戊酸鈉(上海源葉生物科技有限公司,貨號(hào):S60377-5g);阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,貨號(hào):68469);異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,貨號(hào):902-0000-522);COX-2、iNOS抗體(成都正能生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):R23971、340668);γ-氨基丁酸A型受體(GABAAR)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、β-actin、GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):12410-1-AP、16825-1-AP、23660-1-AP、10494-1-AP);電子體溫計(jì)[歐姆龍(大連)有限公司,貨號(hào):MC-246];干酵母(安琪酵母股份有限公司,批號(hào):CF20200324W2F33);液體石蠟(山東德新康醫(yī)療科技有限公司,批號(hào):200603);PGE2、cAMP ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號(hào):ml037542、ml057902)。

多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司,型號(hào):SpectraMax i3X)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司,型號(hào):ABI7500);組織研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司,型號(hào):Tiss-24);垂直凝膠電泳及電轉(zhuǎn)印儀(美國(guó)Bio-rad公司,型號(hào):Mini P-4);全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司,型號(hào):Tanon 5200);超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher公司,型號(hào):NanoDrop OneC)。

膽南星水提物制備:取適量飲片于8倍量水中浸泡1 h,煮沸后小火煎煮30 min,放冷后,4 000 r·min-1離心5 min,取上清液;再次將殘?jiān)?倍量水煎煮,煮沸后小火煎煮20 min,放冷后,4 000 r·min-1離心5 min,取上清液,合并2次上清液,置于蒸發(fā)皿上揮至合生藥量0.5 g·mL-1。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠,雄性,體質(zhì)量22～24 g,購(gòu)自南京市青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng),許可證號(hào)：SCXK(蘇)2019-0002,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查,倫理號(hào):202005A022。SPF級(jí)屏障環(huán)境飼養(yǎng),自由飲水、進(jìn)食,室溫22～25 ℃,濕度40%～70%。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,先適應(yīng)性測(cè)量肛溫2 d,隨后對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)3 d的肛溫測(cè)量,每天2次。篩選測(cè)溫溫差≤0.5 ℃的小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,隨后按照隨機(jī)數(shù)表進(jìn)行分組。60只小鼠分為空白組,模型組,陽(yáng)性藥組(300 mg·kg-1丙戊酸鈉與200 mg·kg-1阿司匹林聯(lián)合給藥),膽南星低劑量組(0.5 g·kg-1)、中劑量組(1.0 g·kg-1)、高劑量組(2.0 g·kg-1)，每組10只。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水,空白組和模型組灌胃給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液,其余給藥組以20 mL·kg-1給予相應(yīng)藥物,每日1次,連續(xù)給藥7 d。末次給藥后除空白組外,其余各組皮下注射20%干酵母混懸液(10 mL·kg-1)致發(fā)熱模型,8 h后測(cè)量肛溫。隨即除空白組外,其余各組腹腔注射戊四氮溶液(60 mg·kg-1)。記錄30 min內(nèi)各組小鼠驚厥表現(xiàn),然后眼眶靜脈叢取血,離心取血清備用,同時(shí),分別在冰上解剖小鼠，取出腦組織、海馬組織及其他臟器,放于液氮中備用。

2.2 小鼠行為學(xué)觀察

驚厥行為學(xué)觀察[10]:記錄30 min內(nèi)小鼠的驚厥表現(xiàn)，驚厥判斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。驚厥潛伏期:末次腹腔注射戊四氮溶液至小鼠首次出現(xiàn)2級(jí)反應(yīng)。驚厥持續(xù)時(shí)間:首次出現(xiàn)2級(jí)反應(yīng)至末次出現(xiàn)2級(jí)反應(yīng)之間的時(shí)間。

表1 驚厥行為學(xué)表現(xiàn)判斷評(píng)級(jí)

2.3 HE染色

每組隨機(jī)選擇3只小鼠吸入異氟烷麻醉后,心臟灌流,首先注入一定體積生理鹽水進(jìn)行灌流,清除血液,待肝臟等器官轉(zhuǎn)呈灰白色后,緩慢注入4%多聚甲醛,待小鼠四肢僵硬,停止灌注,取下大腦,固定,備用。通過(guò)HE染色評(píng)估海馬神經(jīng)元損傷病理表現(xiàn)。

2.4 ELISA法檢測(cè)血清中cAMP、PGE2水平

血液室溫自然凝固20 min,于4 ℃、3 000 r·min-1離心20 min,收集上清,按試劑盒說(shuō)明書(shū)以ELISA法檢測(cè)血清中cAMP、PGE2水平。

2.5 Western blot法檢測(cè)小鼠腦組織COX-2、iNOS、GFAP、GABAAR蛋白表達(dá)水平

冰上稱取一定量腦組織置于含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的預(yù)冷RIPA中勻漿并離心,然后使用BCA法測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉后,將每個(gè)PVDF膜與一抗[兔抗COX-2(1∶1 000)、iNOS(1∶500)、GFAP(1∶5 000)、GABAAR(1∶1 000),鼠抗β-actin(1∶3 000)、GAPDH(1∶3 000)]在4 ℃下孵育過(guò)夜。次日洗滌PVDF膜,然后與相應(yīng)的二抗(1∶3 000)孵育2 h。洗滌PVDF膜后使用ECL試劑在曝光機(jī)下拍攝蛋白條帶,并使用Image J軟件分析數(shù)據(jù)。

2.6 qPCR法檢測(cè)小鼠海馬組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平

采用Trizol法從小鼠海馬組織中提取總RNA,使用Nano-Drop超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度。使用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix預(yù)混液制備樣品及擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性10 s,退火/延伸60 ℃ 34 s,共40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平,選擇β-actin作為內(nèi)參。引物序列見(jiàn)表2。

表2 目的基因的引物序列

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 膽南星水提物對(duì)熱性驚厥小鼠肛溫變化的影響

各組小鼠的基礎(chǔ)肛溫沒(méi)有顯著性差異。皮下注射20%干酵母混懸液造模8 h后,與空白組比較,模型組小鼠肛溫顯著升高(P<0.05),表明發(fā)熱小鼠模型造模成功。與模型組比較,陽(yáng)性藥組及膽南星高劑量組小鼠肛溫均顯著降低(P<0.05),表明膽南星具有解熱作用。見(jiàn)圖1。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,

3.2 膽南星水提物對(duì)熱性驚厥小鼠驚厥發(fā)作潛伏期、驚厥持續(xù)時(shí)間及腦組織GABAAR蛋白表達(dá)的影響

空白組與陽(yáng)性藥組未發(fā)生驚厥表現(xiàn)，模型組發(fā)現(xiàn)驚厥表現(xiàn)。與模型組比較,膽南星高劑量組可顯著延長(zhǎng)驚厥潛伏期(P<0.05),縮短驚厥持續(xù)時(shí)間(P<0.01),顯著上調(diào)腦組織GABAAR蛋白表達(dá)(P<0.05),表明膽南星具有抗驚厥作用,見(jiàn)圖2。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。±s,n=10。

3.3 膽南星水提物對(duì)熱性驚厥小鼠血清cAMP、PGE2水平的影響

ELISA結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組小鼠血清cAMP、PGE2水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,陽(yáng)性藥組及膽南星高劑量組小鼠血清cAMP、PGE2水平均顯著降低(P<0.01),表明膽南星發(fā)揮解熱作用的機(jī)制可能與抑制小鼠血清cAMP、PGE2等內(nèi)源性介質(zhì)釋放有關(guān)。見(jiàn)圖3。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01?！纒,n=6。

3.4 膽南星水提物對(duì)熱性驚厥小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的影響

HE染色病理切片結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組小鼠的腦組織海馬整體結(jié)構(gòu)異常,海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量異常,錐體細(xì)胞形態(tài)異常,可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞核固縮深染,排列不規(guī)整,表明長(zhǎng)時(shí)間的驚厥發(fā)作破壞了神經(jīng)元細(xì)胞的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。與模型組比較,膽南星高劑量組海馬神經(jīng)元形態(tài)明顯改善,錐體細(xì)胞表現(xiàn)正常,排列相對(duì)整齊,核仁清晰，表明膽南星能有效改善海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài),保護(hù)其免受驚厥誘發(fā)的神經(jīng)元損傷,具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用,見(jiàn)圖4。

注：藍(lán)色箭頭代表海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)。

3.5 膽南星水提物對(duì)熱性驚厥小鼠海馬組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)的影響

qPCR法結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,膽南星高劑量組小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05),表明膽南星可降低海馬組織炎癥因子釋放,具有拮抗腦組織炎癥的作用,見(jiàn)圖5。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01?！纒,n=3。

3.6 膽南星水提物對(duì)熱性驚厥小鼠腦組織iNOS、COX-2、GFAP表達(dá)的影響

Western blot分析結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組小鼠腦組織COX-2、iNOS、GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,膽南星高劑量組小鼠腦組織COX-2、iNOS、GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05),表明膽南星能夠下調(diào)相關(guān)蛋白的表達(dá),緩解腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生,降低腦組織損傷,見(jiàn)圖6。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01?！纒,n=3。

4 討論

膽南星功效為清熱化痰,息風(fēng)定驚,對(duì)《中國(guó)藥典》2020年版收載的含有膽南星中成藥的分析表明膽南星臨床主要用于治療小兒高熱驚風(fēng)、小兒支氣管炎、小兒風(fēng)熱感冒等疾病[1]。小兒急驚風(fēng)現(xiàn)代病理表現(xiàn)通常為熱性驚厥,由于炎癥反應(yīng)誘發(fā)的機(jī)體發(fā)熱及驚厥發(fā)生通常是熱性驚厥的發(fā)病機(jī)制之一[11]。

熱性驚厥是兒童常見(jiàn)的一種驚厥性疾病,現(xiàn)代研究認(rèn)為該病發(fā)生與免疫炎癥過(guò)程密切相關(guān)。當(dāng)熱性驚厥發(fā)生時(shí),機(jī)體的炎癥反應(yīng)促進(jìn)cAMP、PGE2等炎癥介質(zhì)的釋放,進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)熱反應(yīng),可引起下丘腦及海馬等腦區(qū)神經(jīng)元興奮,異常放電導(dǎo)致驚厥發(fā)生[4]。文獻(xiàn)顯示,神經(jīng)元細(xì)胞的抑制和活化與驚厥的發(fā)生密切相關(guān),抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA與GABA受體結(jié)合后可抑制突觸后電位,進(jìn)而降低神經(jīng)元興奮性[12],隨即抑制驚厥的發(fā)生。此外,長(zhǎng)時(shí)間的熱性驚厥發(fā)作可引起海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷進(jìn)而誘發(fā)腦內(nèi)炎癥反應(yīng),同時(shí)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞,此時(shí)GFAP大量表達(dá)[13],活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可導(dǎo)致iNOS與COX-2的大量表達(dá),并且促進(jìn)大量炎癥因子釋放[14-15]。

本研究首次采用皮下注射20%干酵母混懸液再以戊四氮溶液為致驚劑構(gòu)建熱性驚厥模型[16-17]。相較于空白組,造模后的小鼠肛溫及驚厥發(fā)生相關(guān)指標(biāo)、小鼠腦組織炎癥因子水平都有顯著性差異(P<0.05),表明造模成功。與模型組比較,膽南星水提物高劑量組能有效延長(zhǎng)熱性驚厥的潛伏期(P<0.05),縮短驚厥持續(xù)時(shí)間(P<0.01),下調(diào)GABAAR蛋白的表達(dá)(P<0.05),同時(shí)降低模型小鼠肛溫(P<0.05),降低血清cAMP、PGE2水平(P<0.01),表明膽南星具有解熱、拮抗熱性驚厥的作用。HE染色病理切片觀察發(fā)現(xiàn),模型組海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變，受到損傷,膽南星組海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)未見(jiàn)明顯變化,表示膽南星能夠保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)元。同時(shí),模型組小鼠GFAP蛋白(主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞中)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05),膽南星高劑量組GFAP蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。GFAP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)激后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的最佳標(biāo)志物之一，星形膠質(zhì)細(xì)胞通常在神經(jīng)系統(tǒng)中作出反應(yīng)，表明膽南星具有抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用。高劑量膽南星能夠下調(diào)iNOS、COX-2蛋白的表達(dá)(P<0.05),同時(shí)下調(diào)海馬組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平(P<0.05),表明膽南星在發(fā)揮抗驚厥藥效的同時(shí)抑制了腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。由于腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生可提高驚厥發(fā)作易感性[18],膽南星拮抗熱性驚厥的作用一定程度可能與其抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)。上述研究表明,膽南星具有顯著的抗熱性驚厥、保護(hù)海馬神經(jīng)元免受損傷、抑制腦內(nèi)炎癥發(fā)生的作用。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)膽南星通過(guò)上調(diào)GABAAR蛋白發(fā)揮抗驚厥作用,其機(jī)制也可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)有關(guān),課題組后續(xù)將繼續(xù)對(duì)膽南星抗熱性驚厥機(jī)制開(kāi)展進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明膽南星具有抗熱性驚厥的藥效作用,但關(guān)于膽南星中的效應(yīng)物質(zhì)仍然有待深入探討。課題組前期研究表明膽南星中含有大量膽酸類成分[19],Sun等[20]研究發(fā)現(xiàn)膽酸類成分抗熱性驚厥的機(jī)制可能與抑制腦內(nèi)炎癥發(fā)生相關(guān)。因此,膽酸類成分是否作為膽南星拮抗腦組織炎癥反應(yīng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ),后續(xù)將基于本研究構(gòu)建的動(dòng)物模型及研究結(jié)果進(jìn)行深入研究。