李凱歌， 張明霞

(平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 平頂山 467000)

山菅蘭根為百合科山菅蘭屬植物山菅蘭Dianellaensifolia(L.)DC.的根，主要分布于浙江、廣州、河南、湖北等地[1]，其性涼，味甘辛，具有拔毒消腫的功效，外用治癰瘡膿腫、癬、淋巴結(jié)結(jié)核、淋巴結(jié)炎?，F(xiàn)代藥理作用表明，山菅蘭具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗衰老等作用[2]，其化學(xué)成分主要包括黃酮類、香豆素類、有機(jī)酸類、三萜類、揮發(fā)油類、甾萜類、糖類等[3]，但相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)山菅蘭根化學(xué)成分進(jìn)行研究，共鑒定出14個(gè)化合物，均為首次從該植物中分離得到，其中化合物7、11對(duì)OVCaR-3細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用。

1 材料

AV500-Ⅲ型超導(dǎo)核磁共振儀(德國(guó) Bruker公司)；Trap-SL1100型質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；柱色譜硅膠(100～200、300～400目，青島海洋化工廠有限公司)；UV-3000型暗箱式紫外分析儀(上海越眾儀器設(shè)備有限公司)；SephadeX LH-20凝膠(瑞典Pharmacia公司)；RFK51T型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；PLY412型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；MNTR45型電子天平(北京華衡科技有限公司)；NBT361型全自動(dòng)轉(zhuǎn)子離心機(jī)(上海趙迪生物科技有限公司)；HBS-ScanX型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，德國(guó)Biofroxx公司)；噻唑藍(lán)(MTT，上海源葉生物科技有限公司)；5-氟尿嘧啶(上海滬鼎生物科技有限公司)。人卵巢癌細(xì)胞株OVCaR-3(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)。所用試劑均為分析純。

山菅蘭根采自河南省平頂山市，經(jīng)平頂山學(xué)院夏西超教授鑒定為山菅蘭Dianellaensifolia(L.)DC.的根。

2 提取與分離

取干燥的山菅蘭根30.6 kg，粉碎后經(jīng)95%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏3.2 kg，超聲分散于水中，依次采用石油醚、二氯甲烷、丙酮、正丁醇萃取，減壓濃縮得石油醚部分浸膏212.4 g、二氯甲烷部分浸膏241.3 g、丙酮部分浸膏186.2 g、正丁醇部分浸膏204.1 g。取二氯甲烷部分，經(jīng)硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯(80∶20～40∶60～20∶80)梯度洗脫，得到8個(gè)流分Fr.B1～Fr.B8，F(xiàn)r.B3(9.5 g) 經(jīng)硅膠柱，以石油醚-丙酮(90∶10～70∶30～30∶70～10∶90)梯度洗脫，得到9個(gè)組分Fr.B3-1～Fr.B3-9，F(xiàn)r.B3-4(754 mg) 經(jīng)硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯(80∶20)洗脫，得化合物11(18 mg)；Fr.B3-6(976 mg) 經(jīng)硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯(60∶40)洗脫，得化合物3(25 mg)、7(29 mg)；Fr.B3-7(1 158 g) 經(jīng)硅膠柱，以石油醚-丙酮(60∶40)洗脫，得化合物6(31 mg)、10(27 mg)；Fr.B3-9(761 g) 經(jīng)Sephadex LH-20柱，以甲醇進(jìn)行洗脫，得化合物1(22 mg)、14(19 mg)。取丙酮部分浸膏，經(jīng)硅膠柱分離，以二氯甲烷-乙酸乙酯(85∶15～65∶45～45∶65～15∶85)梯度洗脫，得到8個(gè)流分Fr.C1～Fr.C8，F(xiàn)r.C2(11.2 g) 經(jīng)硅膠柱分離，以二氯甲烷-正丁醇(85∶15～65∶45～45∶65～15∶85)梯度洗脫，得到7個(gè)組分Fr.C4-1～Fr.C4-7，F(xiàn)r.C4-2(759 g) 經(jīng)硅膠柱分離，以乙酸乙酯-正丁醇(80∶20) 進(jìn)行洗脫，得化合物5(21 mg)、13(19 mg)；Fr.C4-5(639 g) 經(jīng)硅膠柱分離，以乙酸乙酯-正丁醇(70∶30)洗脫，得化合物2(18 mg)、8(25 mg)。Fr.C5(1 415 mg) 經(jīng)硅膠柱分離，以乙酸乙酯-正丁醇(85∶15～65∶45～15∶85)梯度洗脫，得到6個(gè)組分Fr.C5-1～Fr.C5-6，F(xiàn)r.C5-2(628 g) 經(jīng)硅膠柱分離，以乙酸乙酯-正丁醇(85∶15) 進(jìn)行洗脫，得化合物12(27 mg)。取正丁醇部分浸膏，經(jīng)硅膠柱分離，以乙酸乙酯-甲醇(85∶15～50∶50～15∶85)梯度洗脫，得到5個(gè)流分Fr.D1～Fr.D5。Fr.D2(736 g) 經(jīng)硅膠柱分離，以乙酸乙酯-甲醇(75∶25～50∶50～25∶75)梯度洗脫，得到7個(gè)組分Fr.D2-1～Fr.D2-7，F(xiàn)r.D2-4(1 513 g) 經(jīng)硅膠柱，以丙酮-甲醇(40∶60)洗脫，得化合物4(23 mg)；Fr.D2-6(847 g) 經(jīng)Sephadex LH-20柱，以甲醇進(jìn)行洗脫，得化合物9(22 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色油狀(甲醇)，ESI-MSm/z：177.3[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.61(1H，d，J=8.4 Hz，H-4)，6.27(1H，m，H-5)，5.82(1H，s，H-2)，5.33(1H，ddd，J=8.4，4.2，2.2 Hz，H-8)，4.61(1H，m，H-6)，3.02(1H，m，H-7b)，1.65(1H，m，H-7a)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：173.8(C-1)，111.6(C-2)，163.7(C-3)，122.6(C-4)，139.1(C-5)，66.2(C-6)，38.1(C-7)，78.3(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]基本一致，故鑒定為aquilegiolide。

化合物2：白色粉末(丙酮)，ESI-MSm/z：300.7[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.79(2H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-2，5)，7.51(2H，q，J=12.0，8.2 Hz，H-3，4)，4.03(4H，d，J=12.0 Hz，H-1′，1″)，2.03(2H，m，H-2′，2″)，0.94(12H，d，J=12.0 Hz，H-3′，3″，4′，4″)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：132.4(C-1)，130.1(C-2)，130.6(C-3)，130.9(C-4)，141.7(C-5)，139.2(C-6)，71.8(C-1′)，29.1(C-2′)，21.4(C-3′)，22.3(C-4′)，73.5(C-1″)，29.1(C-2″)，19.4(C-3″)，23.1(C-4″)，159.2(C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]基本一致，故鑒定為鄰苯二甲酸二異丁酯。

化合物3：白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：412.8[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.82(2H，dd，J=8.4，4.2 Hz，H-2，5)，7.71(2H，dd，J=8.4，4.2 Hz，H-3，4)，4.23(4H，ddd，J=8.4，4.2，2.2 Hz，H-2′，2″)，1.68(2H，m，H-3′，3″)，1.42～1.31(16H，m，H-4′，4″，5′，5″，6′，6″，8′，8″)，0.97～0.85(12H，m，H-7′，7′，9′，9′)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：131.9(C-1)，131.9(C-2)，130.2(C-3)，130.2(C-4)，131.9(C-5)，131.9(C-6)，171.3(C-1′)，70.3(C-2′)，39.7(C-3′)， 23.6(C-4′)，24.8(C-5′)，29.5(C-6′)，12.3(C-7′)，32.4(C-8′)，15.1(C-9′)，171.3(C-1″)，70.3(C-2″)，39.7(C-3″)，23.6(C-4″)，24.8(C-5″)，29.5(C-6″)，12.3(C-7″)，32.4(C-8″)，15.1(C-9″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致，故鑒定為鄰苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯。

化合物4：黃色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：219.3[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：11.82(1H，s，6-OH)，6.21(1H，s，H-5)，5.34(1H，s，2-OH)，4.06(3H，s，H-8)，2.52(2H，s，H-10)，2.08(3H，s，H-9)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：109.1(C-1)，160.3(C-2)，106.1(C-3)，138.2(C-4)，109.2(C-5)，162.1(C-6)，173.1(C-7)，52.4(C-8)，71.2(C-9)，25.6(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]基本一致，故鑒定為2，6-dihydroxy-3，4-dimethylbenzoic acid methyl ester。

化合物5：白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：468.7[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.58(4H，brs，H-2，2′，6，6′)，4.81(2H，d，J=8.4 Hz，H-7，7′)，4.31(2H，dd，J=4.2，2.2 Hz，H-9a，9′a)，4.03(2H，d，J=8.4 Hz， H-9b，9′ b)，3.92(12H，s，3，3′，5，5′-OCH3)，3.80(6H，s，4，4′ -OCH3)，3.09(2H，s，H-8，8′)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：139.1(C-1)，103.6(C-2)，155.3(C-3)，139.1(C-4)，155.3(C-5)，103.6(C-6)，86.4(C-7)，56.1(C-8)，72.9(C-9)，139.1(C-1′)，103.6(C-2′)，155.3(C-3′)，139.1(C-4′)，155.3(C-5′)， 103.6(C-6′)，86.4(C-7′)，56.1(C-8′)，72.9(C-9′)，56.4(3-OCH3)，62.3(4-OCH3)，56.4(5-OCH3)，56.4(3′-OCH3)，62.3(4′-OCH3)，56.4(5′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致，故鑒定為yangambin。

化合物6：白色油狀物(甲醇)，ESI-MSm/z：177.3[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.61(1H，d，J=4.2 Hz，H-4)，6.27(1H，m，H-5)，5.83(1H，s，H-2)，5.35(1H，ddd，J=8.4，4.2，2.2 Hz，H-8)，4.62(1H，m，H-6)，3.09(1H，m，H-7b)，1.68(1H，m，H-7a)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：176.3(C-1)，113.5(C-2)，163.6(C-3)，122.3(C-4)，139.2(C-5)，65.2(C-6)，38.1(C-7)，78.1(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，故鑒定為aquilegiolide。

化合物7：白色膠體(甲醇)，ESI-MSm/z：111.4[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.37(1H，brs，-NH)，3.62(2H，ddd，J=8.4，4.2，2.2 Hz， H-6a)，3.51(1H，ddd，J=8.7，6.3，2.7 Hz，H-7)，2.73(1H，m，H-2)，2.58(2H，ddd，J=8.4，4.2，2.2 Hz，H-6b)，1.97(2H，d，J=7.5 Hz，H-3)，1.64(1H，m，H-8)，1.02(3H，d，J=8.4 Hz，H-10)，0.93(3H，d，J=8.4 Hz，H-9)，0.79(3H， d，J=8.4 Hz，H-1)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：23.1(C-1)，26.3(C-2)，46.5(C-3)，172.8(C- 4)，131.4(C-5)，42.8(C-6)，76.3(C-7)，29.7(C-8)，20.6(C-9)，18.9(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致，故鑒定為xylariamide。

化合物8：黃色粉末(丙酮)，ESI-MSm/z：453.4[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.93(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.85(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.62(1H，s，H-3)，6.19(1H，s，H-6)，4.92(1H，d，J=8.4 Hz，H-1″)，3.79(2H，m，H-6″)，3.56(1H，m，H-2″)，3.41(1H，s，H-4″)，3.17(2H，s，H-3″，5″)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：127.4(C-1)，163.5(C-2)，103.2(C-3)，183.6(C-4)，159.3(C-5)，97.6(C-6)，163.1(C-7)，105.4(C-8)，155.1(C-9)，103.7(C-10)，122.4(C-1′)，128.1(C-2′)，116.3(C-3′)，160.6(C-4′)， 116.3(C-5′)，128.1(C-6′)，72.8(C-1″)，71.3(C-2″)，79.1(C-3″)，68.2(C-4″)，82.4(C-5″)，60.8(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定為牡荊素。

化合物9：黃色油狀(甲醇)，ESI-MSm/z：217.6[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.13(2H，d，J=4.2 Hz，H-2，6)，6.82(2H，d，J=4.2 Hz，H-3，5)，4.91(1H，s，4-OH)，4.05(2H，q，J=8.4 Hz，9-OCH2CH3)，2.64(2H，t，J=8.4 Hz，H-7)，2.43(2H，t，J=8.4 Hz，H-8)，1.16(3H，t，J=8.4 Hz，9-OCH2CH3)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：131.5(C-1)，130.1(C-2)，116.2(C-3)，155.3(C-4)，116.2(C-5)，130.1(C-6)，33.4(C-7)，37.1(C-8)，174.6(C-9)，61.3(9-OCH2CH3)，15.7(9-OCH2CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，故鑒定為3-(4-羥苯基) -丙酸乙酯。

化合物10：黃色油狀(甲醇)，ESI-MSm/z：267.3[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.98(2H，d，J=4.2 Hz，H-2′，6′)，6.83(2H，d，J=4.2 Hz，H-3′，5′)，6.27(1H，brs，H-4)，6.15(2H，brs，H-2，6)，3.63(3H，s，5-OH3)，2.79(4H，m，H-α，α′)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：44.2(C-1)，107.5(C-2)，160.4(C-3)，98.7(C-4)，160.7(C-5)，108.1(C-6)，134.1(C-1′)，130.4(C-2′)，114.6(C-3′)，153.8(C-4′)，114.6(C-5′)，130.4(C-6′)，37.4(C-α)，37.6(C-α′)，54.9(5-OH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故鑒定為3，4′-二羥基-5-甲氧基聯(lián)芐。

化合物11：淡黃色粉(甲醇)，ESI-MSm/z：351.4[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：8.02(1H，d，J=8.4 Hz，H-4)，6.37(1H，d，J=8.4 Hz，H-4′)，6.08(1H，d，J=8.4 Hz，H-3)，5.65(1H，d，J=8.4 Hz，H-3′)，4.38(1H，dd，J=8.4，4.2 Hz，H-2″)，3.79(2H，m，H-3″)，1.52(3H，s，1″-CH3)，1.40(6H，s，2′-CH3)，1.22(3H，s，1″-CH3)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：125.7(C-1)，160.1(C-2)，111.3(C-3)，140.7(C-4)，1151.4(C-5)，100.2(C-6)，158.1(C-7)，114.3(C-8)，124.6(C-1′)，77.9(C-2′)，129.1(C-3′)，114.8(C-4′)，43.1(C-1″)，95.1(C-2″)，60.2(C-3″)，02.8(C-4a)，149.7(C-8a)，28.1(2′-CH3)，28.4(2′-CH3)，27.1(1″-CH3)，21.5(1″-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故鑒定為oxanordentatin。

化合物12：黃色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：184.7[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.86(1H，d，J=8.4 Hz，H-4)，7.53(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，6.82(1H，dd，J=4.2，2.2 Hz，H-6)，6.54(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.07(1H，d，J=8.4 Hz，H-3)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：125.3(C-1)，162.5(C-2)，114.6(C-3)，143.7(C-4)，130.4(C-5)，110.2(C-6)，159.4(C-7)，103.5(C-8)，110.5(C-4a)，157.1(C-8a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定為7-羥基香豆素。

化合物13：白色結(jié)晶(丙酮)，ESI-MSm/z：284.7[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.13(1H，s，H-12)，3.82(1H，s，H-5)，3.58(1H，d，J=8.4 Hz，H-9b)，3.02(1H，brd，J=8.4 Hz，H-1)，2.79(1H，d，J=8.4 Hz，H-9a)，2.37(1H，brd，J=8.4 Hz，H-3a)，2.19(1H，brd，J=8.4 Hz，H-2a)，2.07(3H，s，H-13)，1.62(1H，m，H-2b)，1.51(1H，m，H-3b)，1.28(3H，s，H-14)，1.06(3H，s，H-15)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：69.4(C-1)，26.1(C-2)，37.4(C-3)，65.2(C-4)，65.2(C-5)，191.8(C-6)，125.1(C-7)，160.4(C-8)，40.1(C-9)，60.3(C-10)，125.1(C-11)，138.4(C-12)，13.2(C-13)，19.1(C-14)，22.4(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故鑒定為zederone epoxide。

化合物14：棕色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：367.2[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：14.27(1H，s，6-OH)，6.37(1H，brs，H-3)，6.08(1H，d，J=4.2 Hz，H-5)，5.02(1H，d，J=4.2 Hz，H-1′)，3.91(3H，s，2-OCH3)，3.80(1H，m，H-6′a)，3.68(1H，m，H-6′b)，3.53～3.46(3H，m，H-2′，3′，5′)，3.24(1H，m，H-4′)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：105.2(C-1)，166.1(C-2)，91.6(C-3)，164.1(C-4)，97.1(C-5)，163.4(C-6)，204.5(C-7)，33.1(C-8)，100.2(C-1′)，72.9(C-2′)，76.8(C-3′)，70.2(C-4′)，77.1(C-5′)，59.4(C-6′)，55.8(2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定為annphenone。

4 抑制細(xì)胞增殖活性篩選

采用MTT法[18]檢測(cè)14個(gè)化合物的體外抗OVCaR-3細(xì)胞活性，采用5-氟尿嘧啶為陽(yáng)性對(duì)照藥物。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OVCaR-3細(xì)胞，稀釋為單細(xì)胞混懸液(密度為5×104/mL)，每孔取100 μL單細(xì)胞混懸液置于96孔板中，在37 ℃恒溫器中培養(yǎng)12 h。再分別加入5-氟尿嘧啶及化合物1～14(每個(gè)化合物均設(shè)置0.1、1.0、5.0、10.0、15.0 μg/mL質(zhì)量濃度梯度)，培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL MTT溶液進(jìn)行染色，培養(yǎng)12 h，移除上層清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，輕輕搖晃均勻。采用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算OVCaR-3細(xì)胞的抑制率和IC50值。結(jié)果，化合物7、11對(duì)OVCaR-3細(xì)胞增殖具有體外抑制作用，IC50值分別為9.14、9.03 μg/mL，其中質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的化合物11與5-氟尿嘧啶對(duì)OVCaR-3細(xì)胞增殖的抑制活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各化合物對(duì)OVCaR-3細(xì)胞增殖的體外抑制作用Tab.1 Inhibitory effects of various compounds on OVCaR-3 cell proliferation in

5 討論

文獻(xiàn)關(guān)于山菅蘭根化學(xué)成分的報(bào)道較少，本研究從中分離得到 14個(gè)化合物，均為首次發(fā)現(xiàn)，其中化合物7、11對(duì)OVCaR-3細(xì)胞增殖具有一定抑制作用。上述結(jié)果可豐富山菅蘭根成分資料庫(kù)，為相關(guān)抗腫瘤新藥的開(kāi)發(fā)提供參考。