白曉明，王麗非，洪斌

·新型冠狀病毒專欄·

抗SARS-CoV-2藥物研究進展

白曉明，王麗非，洪斌

過去二十年全球曾經(jīng)發(fā)生了兩次重大的冠狀病毒（coronavirus，CoVs）感染事件，分別是 2003 年暴發(fā)的嚴重急性呼吸窘迫綜合征（severe acute respiratory syndromes，SARS）和 2012 年暴發(fā)的中東呼吸綜合征（middle east respiratory syndrome，MERS）。2019 年，第三次冠狀病毒感染事件暴發(fā)，新型冠狀病毒 SARS-CoV-2 在全球大流行并造成了巨大的社會危害。最新數(shù)據(jù)顯示，SARS-CoV-2 已導致全球超過 5.2 億人感染，628 萬人死亡[1]。鑒于疫情的嚴重形勢，多個抗 SARS-CoV-2 藥物已被各國政府緊急批準臨床應用，如莫努匹韋、瑞德西韋、法匹拉韋、洛匹那韋/利托那韋等，世界衛(wèi)生組織（WHO）也將 7 種 SARS-CoV-2 疫苗納入緊急使用清單。遺憾的是，上述藥物的特異性和臨床治療效果并不理想，而新冠病毒不斷產(chǎn)生新的變異，導致目前廣泛使用的多種疫苗防治作用減弱，成為全球抗疫最為棘手的問題。為此，本文針對目前新冠病毒的研究現(xiàn)狀，綜述了 SARS-CoV-2 生物學特征、基于宿主/病毒的治療靶點和抗 SARS-CoV-2 藥物，希望能為抗 SARS-CoV-2 新型藥物的設計和開發(fā)提供新的思路。

1 SARS-CoV-2 的生物學特征

SARS-CoV-2 是一種正鏈 RNA 病毒，基因組從 5' 至 3' 分別為蛋白酶和復制酶編碼區(qū)（ORF1ab）、結構蛋白（S、E、M 和 N）編碼區(qū)、3' 非翻譯區(qū)（UTRs）和多聚（A）尾?；蚪M包含 14 個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）編碼 29 種蛋白質（圖 1）。蛋白酶和復制酶編碼區(qū)編碼兩種多聚蛋白 pp1a 和 pp1ab，多聚蛋白被病毒 nsp5 基因編碼的3C樣蛋白酶（3C-like protease，3CLpro）白（或稱主蛋白酶）和nsp3 基因編碼的木瓜蛋白酶樣蛋酶（papain-like protease，PLpro）消化為 16 種非結構蛋白nsps1-16。非結構蛋白主要負責病毒基因組復制和轉錄，其中nsp12 是病毒RNA 依賴的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp），與輔因子 nsp7 和 nsp8 共同組裝成復制轉錄復合體（replication and transcription complex，RTC），在病毒基因組的轉錄和復制中發(fā)揮至關重要的作用。而結構蛋白編碼區(qū)主要編碼刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N）[2]。S 蛋白是同源三聚體蛋白，在病毒表面形成獨特的刺突結構類似皇冠[3]，介導病毒膜與宿主細胞膜的融合，是病毒侵入宿主的關鍵蛋白。S 蛋白可被宿主蛋白酶裂解為兩個功能域 S1 和 S2[4]。S1 亞基包含信號肽段（SP）和受體結合結構域（RBD），負責病毒與宿主細胞受體的結合；S2 包含兩個七肽重復區(qū)（heptad region，HR1/2）、一個中心螺旋和跨膜區(qū)，介導病毒包膜和細胞膜融合[5]。

圖1 SARS-CoV-2 基因組結構及其結構蛋白組成

2 依賴于宿主/病毒的治療靶點和抗 SARS-CoV-2 藥物

2.1 病毒侵襲宿主細胞的相關靶點

SARS-CoV-2 通過 S 蛋白與宿主細胞受體 ACE2 結合啟動入侵過程，S 蛋白的水解活化需要跨膜絲氨酸蛋白酶（TMPRSS2）和弗林蛋白酶（furin）[6]參與。因此，S 蛋白、TMPRSS2、弗林蛋白酶和 ACE2 都是限制 SARS-CoV-2 侵入細胞的藥物作用靶點。

2.1.1 S 蛋白

2.1.1.1 靶向 S 蛋白的中和抗體藥物 截至 2021 年12 月，至少有 27 個國家的 274 家公司/機構正在開發(fā)抗體療法[7]，已有 25 個S 蛋白靶向性單克隆抗體進入臨床試驗，其中有 7 種單抗（巴尼韋單抗、埃特司韋單抗、卡斯瑞韋單抗、依米得韋單抗、索托韋單抗、西加韋單抗和替沙格韋單抗）獲得美國FDA批準使用或者緊急使用（表 1）。巴尼韋單抗（LY-CoV555）是全球首個治療新冠的單克隆抗體，以 S 蛋白的 RBD 為靶點[8]。II 期臨床結果顯示巴尼韋單抗減少病毒載量，降低新冠患者癥狀和住院率，F(xiàn)DA 批準用于治療中度癥狀的成人或兒童[9]。雖然巴尼韋單抗對突變毒株 B.1.1.7 有效，但對 B.1.351、P.1 和 B.1.617.2 無效[10-13]。索托韋單抗是 S309 單抗的衍生物，III 期臨床結果顯示索托韋單抗治療的患者（n = 291）住院（超過 24 h）或死亡的主要終點降低 85%。FDA 批準緊急使用 0.5 g 單劑量的索托韋單抗治療高風險發(fā)展為重癥的 12 歲或以上的兒童患者。REGN-COV2 是一種雙抗體雞尾酒療法，其中包含針對 S 蛋白 RBD 的單抗卡斯瑞韋單抗和依米得韋單抗。單獨使用兩種單抗的抑制d值大約為 0.04 nmol/L，PRNT50值為0.0374 nmol/L 和 0.0421 nmol/L[14]。臨床試驗數(shù)據(jù)顯示，REGN-COV2 可降低 70 % 死亡率和住院風險，非住院患者癥狀持續(xù)時間中位數(shù)從 14 d 縮短到 10 d。REGN-COV2 對 B.1.1.7（Alpha）、B.1.351（Beta）、P.1（Gamma）、B.1.429（Epsilon）和 B.1.526（Iota）均有效[15]。另一雙抗組合策略 AZD7442 是利用分離自新冠感染者的抗體替沙格韋單抗和西加韋單抗[16-17]。預防和暴露后預防的III 期臨床數(shù)據(jù)顯示 AZD7442 降低了 83% 感染風險，感染開始 3 d 內(nèi)給藥降低了 88% 的重癥或死亡風險[18]。

2.1.1.2 S 蛋白與宿主細胞 ACE2 融合抑制劑 由于 S 蛋白的HR1 和 HR2 結構域介導病毒與細胞膜融合，根據(jù)這兩個七肽重復序列可以設計抗病毒肽類抑制劑，阻斷膜融合。Xia 等[19]參考泛冠狀病毒融合抑制劑（EK1 肽）分別制備了 HR1 和 HR2 的類似肽（HR1P 和 HR2P），HR2P 抑制 IC50為 0.18 μmol/L。為了增加抗病毒效力并改善藥物動力學，Xia 等[20]通過聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和（或）氨基酸將膽固醇連接到 EK1 的 C 端合成了一系列脂肽，其中 EK1C4 能有效抑制 SARS-CoV-2 S 蛋白介導的細胞融合和假病毒感染，并在小鼠模型中可預防 HCoV-OC43 感染。Zhu 等[21]基于 HR2 序列開發(fā)了一種脂肽融合抑制劑 IPB02，抑制 S 蛋白 IC50為 0.025 μmol/L，單周期感染試驗中對 SARS-CoV-2 感染的抑制 IC50為 0.08 μmol/L。

阿比多爾最初用于治療甲型流感和乙型流感病毒引起的上呼吸道感染。近年來的研究證實了其對 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的抑制作用[22]。阿比多爾可有效阻斷 SARS-CoV-2 S 蛋白的三聚體化[23]，導致宿主細胞中的 S 蛋白穩(wěn)定性顯著下降，最終被溶酶體降解。一項臨床研究發(fā)現(xiàn)給藥 14 d 后，洛匹那韋/利托那韋對照組有 15 例（44.1%）檢測到病毒，阿比多爾組新冠患者全部病毒轉陰，并且 RNA 檢測陽性持續(xù)時間短（< 0.01）[24]，表明阿比多爾具有發(fā)展為抗新冠藥物的潛力。

2.1.2 蛋白酶 S 蛋白的激活過程依賴宿主蛋白酶 TMPRSS2 和弗林蛋白酶，它們分別在 S2 位點和 S1/S2 位點裂解 S 蛋白，因此可以根據(jù) TMPRSS2 和弗林蛋白酶切割位點序列設計蛋白酶短肽抑制劑，并組合兩種序列來協(xié)同抑制。Bestle 等[25]發(fā)現(xiàn) TMPRSS2 抑制劑 MI-432 和 MI-1900 顯著抑制 SARS-CoV-2 在 Calu-3 細胞中增殖導致的細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），20 μmol/L 的 MI-432 和 50 μmol/L 的 MI-1900 處理細胞后感染病灶變小。TMPRSS2 抑制劑甲磺酸卡莫司他可阻斷 SARS-CoV 和HCoV-NL63 對 HeLa 細胞的感染[4]。Hoffmann 等[26]在細胞試驗中證實甲磺酸卡莫司他和其類似物甲磺酸萘莫司他可有效阻斷 SARS-CoV-2 進入 Calu-3 細胞，EC50分別為 87 nmol/L 和 5 nmol/L，目前有 5 個臨床試驗正在評估甲磺酸卡莫司他的療效。此外，溶酶體中的組織蛋白酶對病毒通過胞吞作用進入宿主至關重要，阿洛司他丁是組織蛋白酶 L（cathepsin L，CatL）的抑制劑，可阻斷 SARS-CoV 和 SARS-CoV- 2 假病毒的感染[27]。

表1 FDA 批準或緊急批準使用的抗體藥物

名稱公司劑量批準日期 巴尼韋單抗Eli Lilly/AbCellera700 mg2020.11.09 巴尼韋單抗/埃特司韋單抗Eli Lilly/AbCellera/Junshi700 mg/1400 mg2021.09.16 卡斯瑞韋單抗/依米得韋單抗Regeneron600 mg/600 mg2021.08.10 索托韋單抗Vir biotechnology/GlaxoSmithKline500 mg2021.05.26 西加韋單抗/替沙格韋單抗AstraZeneca/Vanderbilt University Medical Center150 mg/150 mg2020.12.08

弗林蛋白酶是一種前蛋白轉化酶（PC），可被酸性 pH 環(huán)境激活[28]。Ivanova 等[29]發(fā)現(xiàn)弗林蛋白酶抑制劑在細胞實驗中表現(xiàn)出對西尼羅病毒和登革病毒的抗病毒活性。一種弗林蛋白酶抑制劑（MI-1851）可以強烈抑制新冠病毒在 Calu-3 細胞中的復制，10 μmol/L 處理可以使病毒滴度降低96.67% ～ 99.47%。此外，MI-1851 與 TMPRSS2 抑制劑 MI-432 具有協(xié)同效應，聯(lián)合用藥使病毒滴度又降低 90% ～ 96.67%[25]。Cheng 等[30]發(fā)現(xiàn)弗林蛋白酶抑制劑 decanoyl-RVKR-chloromethylketone（CMK）和萘熒光素（圖 2）可以抑制蛋白裂解和合胞體形成?？瞻叻y定 IC50值分別為 0.057 μmol/L 和 9.025 μmol/L。CMK 的選擇性指數(shù)（selectivity index，SI）為 5567，萘熒光素的 SI 為 6.36。

2.1.3 血管緊張素轉換酶 2 重組人血管緊張素轉換酶 2（recombinant human angiotensin-converting enzyme 2，rhACE2）又稱 APN01，通過干擾 S 蛋白與宿主細胞 ACE2 受體的相互作用，阻斷 SARS-CoV-2 進入宿主細胞[31]。在 Vero E6 細胞中，rhACE2 可以將病毒載量降低 99.9% ～ 99.98%。人腎臟類器官和血管類器官經(jīng) rhACE2 處理后，顯著抑制 SARS-CoV-2 的入侵[32]。一項臨床研究表明 rhACE2（GSK2586881）治療可以改善急性呼吸窘迫綜合征患者的臨床指標，并且具有良好的耐受性[33]。氯喹和羥氯喹（圖 2）是傳統(tǒng)的抗瘧藥，它們對內(nèi)溶酶體和高爾基體的脫酸作用可能阻止 SARS-CoV-2 整合到宿主細胞中。氯喹還可以通過減少宿主細胞表面 ACE2 末端糖基化，干擾 S 蛋白與 ACE2 的結合來抑制病毒侵入[34]。氯喹和羥氯喹都被證明可阻斷 SARS-CoV-2 從初級內(nèi)體到內(nèi)溶酶體（endolysosomes，Els）的運輸[35]。氯喹能在低劑量下有效阻斷SARS-CoV-2 對Vero E6 細胞的感染，且 SI 值較高（EC50= 1.13 μmol/L，CC50> 100 μmol/L，SI > 88.50）。

2.2 病毒復制相關靶點

2.2.1 RdRp 目前用于新冠治療的 RdRp 抑制劑有莫努匹韋、瑞德西韋、法匹拉韋、利巴韋林和噴昔洛韋[36-37]等，均屬于 RdRp 核苷類抑制劑。在 E6 細胞模型中發(fā)現(xiàn)瑞德西韋的抗 SARS-CoV-2 IC50為 0.99 μmol/L[38]。早期的一項隨機臨床試驗結果表明接受瑞德西韋 5 d 治療的患者與標準治療相比，其臨床癥狀減輕。但是世衛(wèi)組織和美國國家過敏癥和傳染病研究所贊助的臨床研究最終結果都表明，瑞德西韋治療新冠患者并無明顯效果。因此，世衛(wèi)組織建議不對 SARS-CoV-2 患者使用瑞德西韋[39]。

圖2 SARS-CoV-2 進入宿主相關靶點的抑制劑

法匹拉韋是一種經(jīng)過修飾的吡嗪類似物（也稱為 6-氟-3-羥基-2-吡嗪羧酰胺，T-705），在日本被批準用于抗病毒的治療。法匹拉韋對感染新冠病毒的 Vero E6 細胞的抑制 EC50值為 61.88 μmol/L[40]。在臨床試驗中，法匹拉韋治療組的病毒清除中位時間更短（內(nèi)距 2.5 ～ 9.0 d），與對照組（利托那韋/洛匹那韋治療）（內(nèi)距 8.0 ～ 13.0 d）相比具有顯著差異（< 0.01），胸部 CT 改善率為 91.43%，顯著高于對照組62.22%[41]。另一項新冠肺炎的臨床試驗中，法匹拉韋和奧司他韋聯(lián)合治療，可以在 14 d 后顯著改善患者的臨床癥狀（62.5% vs 42.2%，= 0.0247）[42]。最新的研究還發(fā)現(xiàn)法匹拉韋可能通過誘導分子間或分子內(nèi)模板轉換，引發(fā) RNA 合成缺陷發(fā)揮抗病毒作用，此機制給藥物設計提供了新的方向[43]，但法匹拉韋在動物實驗中顯現(xiàn)出的血液毒性、肝臟毒性還有致畸性是不容忽視的[44]。

最新開發(fā)的抗病毒口服藥物莫努匹韋是一個 β-D-N4-羥基胞苷（NHC）前藥，酯鍵水解后得到 NHC。在 Vero細胞中，NHC 抗新冠病毒 IC50為 0.3 μmol/L，CC50>10 μmol/L，在 Calu-3 細胞中 IC50為 0.08 μmol/L[45]。在一項對輕度或中度新冠患者開展的 III 期臨床研究中，服用莫努匹韋患者中病重/病死率為 7.3%（28/385），相比于安慰劑組的 14.1%（53/377），莫努匹韋將病重/病死率降低了 50%（= 0.0012）。目前，莫努匹韋已經(jīng)在英國批準上市，用于治療重癥和住院風險較高的輕至中度成人新冠患者。

圖3 SARS-CoV-2 RdRp 抑制劑

在虛擬對接實驗中也發(fā)現(xiàn)了一些 RdRp 小分子抑制劑，如加利司韋、頭孢呋辛、替諾福韋、羥氯喹、替戈布韋、索非布韋和阿巴卡韋，均可作為潛在的 RdRp 酶抑制劑[46-47]。喹啉類藥物中，埃替拉韋和噁喹酸能夠干擾 RdRp 的聚合酶活性[48]。植物來源的多酚類化合物 EGCG、TF2a、TF2b 和 TF3 對 RdRp 具有穩(wěn)定的結合親和力和良好的藥代動力學特性[49]，顯示出一定的開發(fā)價值。細胞實驗中，索非布韋可抑制 Huh-2（人肝癌來源）和 Calu-3（II 型肺細胞來源）細胞中 SARS-CoV-2 的復制[50]。RdRp 各抑制劑的化學結構見圖 3。

2.2.2 3CLpro3CLpro作為阻礙 SARS-CoV-2 復制的治療靶點廣受關注[51]，目前已開發(fā)出一系列 3CLpro抑制劑，根據(jù)其結構可分為擬肽類抑制劑和非肽類抑制劑。Konno 等[52]設計合成了以苯并噻唑為彈頭基團的擬肽化合物 1 和 2（圖 4），對SARS-CoV-2 3CLpro的抑制常數(shù)（i）分別為 4.1 和 3.0 nmol/L。Dai 等[53]開發(fā)了一類新的醛基類擬肽抑制劑，其中化合物 3 和 4（圖 4）對 3CLpro的抑制活性 IC50分別為 0.053 和 0.04 μmol/L，并且在細胞實驗 EC50值分別為 0.42 和 0.33 μmol/L，有潛力成為新的抗 SARS-CoV-2 臨床候選藥物。Zhang 等[54-55]優(yōu)化 α-酮酰胺抑制劑得到化合物 5 對 SARS-CoV-2 3CLpro具有較強的抑制作用，并且藥代動力學特性良好。Hoffman 等[56]發(fā)現(xiàn)了一種潛在的小分子蛋白酶抑制劑 PF-00835231，在 Vero 細胞中病毒 CPE EC50值分別為 39.7 μmol/L（SARS-CoV-2 Washington strain 1）和 88.9 μmol/L（Belgium/GHB-03021/2020 strain），細胞試驗中 PF-00835231 與瑞德西韋聯(lián)用具有協(xié)同作用[57]。輝瑞公司開發(fā)了一種口服抗病毒候選藥物 PF-07321332，顯示出廣譜抗冠狀病毒活性并且具有良好的藥代動力學特性[58]。由 PF-07321332 和利托那韋組成的藥物Paxlovid，是首款獲 FDA 批準可緊急用于治療新冠病毒感染的口服藥物。臨床試驗數(shù)據(jù)顯示，該藥物可以降低 89% 的病重或死亡率。

圖4 SARS-CoV-2 蛋白酶抑制劑

3CLpro非肽類小分子抑制劑主要通過氫鍵、疏水鍵和范德華力與活性位點的殘基相互作用，發(fā)揮抑制作用[59]。Ramajayam 等[60]設計了一系列吡唑啉酮核心化合物，化合物 2p 對 SARS-CoV 3CLpro的 IC50為 5.5 μmol/L，2t 的 IC50為 6.8 μmol/L。Yang 等[61]通過虛擬篩選發(fā)現(xiàn) Z1244904919 和 Z1759961356 均能抑制 SARS-CoV-2 導致的 Vero E6 細胞病變效應，EC50分別為（4.98 ± 1.83）和（8.52 ± 0.92）μmol/L。另有學者利用雙胺支架合成了一系列 SARS-CoV 3CLpro抑制劑，構效關系研究表明，吡啶或三唑是抑制活性所必需的[61-62]，這一發(fā)現(xiàn)為非肽抑制劑的設計提供了新的思路。十氫異喹啉、八氫異色烯、不對稱芳二硫化物還有一些天然產(chǎn)物也表現(xiàn)出良好的抑制活性，可以進一步研究和修飾[59]。

2.2.3 PLproPLpro除了切割病毒多聚蛋白，還通過去除細胞蛋白中的泛素（Ub）和泛素樣蛋白干擾素誘導基因 15（ISG15）參與調(diào)節(jié)免疫反應，其抑制劑可以通過抑制病毒復制和促進抗病毒免疫雙重方式發(fā)揮作用[63]，因此 PLpro被公認為是具有潛力的抗病毒藥物靶點[64]。Fu 等[65]在體外實驗中證實了 GRL0617 對 PLpro的抑制 IC50為 2.1 μmol/L。在 Vero 細胞中，GRL0617 濃度在100 μmol/L 時病毒復制抑制率超過 50%，CPE 分析顯示 EC50為（21 ± 2）μmol/L。Rut 等[66]檢測了 SARS-CoV-2 PLpro在 P4-P2 位置的底物偏好，并開發(fā)出 VIR250 和 VIR251 選擇性地抑制 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 PLpro。Napolitano等[67]發(fā)現(xiàn)吖啶黃在 A549 ACE2+細胞和 Vero 細胞中抑制病毒復制的 IC50值分別為 86和 64 nmol/L。在 K18-ACE2 小鼠感染模型中，每天口服 100 mg/kg ACF 或肌肉注射5 mg/kg 都可以完全阻斷 SARS-CoV-2 對小鼠大腦的感染。一種以咪唑為基礎的化合物 YM-115[68]，可抑制 SARS CoV-2 PLpro蛋白酶活性，IC50為 2.47 μmol/L。二氫丹參酮 I[69]、tarloxotinib[70]、依布硒[71]抑制 PLpro的 IC50分別為8 μmol/L、300 nmol/L、2 μmol/L。而具有羥基或甲氧基的依布硒衍生物的 IC50值在納摩爾范圍內(nèi)[71]。在 Vero E6 細胞中，依布硒以 4 μmol/L的 EC50抑制 SARS-Co-V2 復制[72]。

3 總結和展望

自 2019 年新冠疫情暴發(fā)以來，新冠的大流行已經(jīng)對人類的健康造成了極大的威脅，同時也對全球的經(jīng)濟發(fā)展造成了巨大的影響。兩年來持續(xù)的新冠疫情時刻提醒我們，目前針對冠狀病毒感染的治療手段仍然非常有限。在疫情早期，研究者通過已有藥物的再利用、計算模擬設計和改造抑制劑等手段，縮短了藥物開發(fā)的時間并降低了成本，但獲得的藥物往往在臨床試驗中表現(xiàn)不佳，例如洛匹那韋、利托那韋、瑞德西韋[73]等。隨著我們對SARS-CoV-2 結構特征、生物學性質、感染過程以及與宿主的關系的認識不斷深入，病毒感染周期中各個階段重要的靶點逐漸顯露，研究者們開始針對特定靶點進行藥物的全新設計，不斷有單克隆抗體、抗病毒融合肽、小分子酶抑制劑、免疫抑制劑等抗新冠藥物進入臨床試驗階段。值得注意的是，與 SARS-CoV 相比，SARS-CoV-2 具有更高的突變頻率[74]，新的毒株在全世界不斷涌現(xiàn)，現(xiàn)有的藥物和疫苗都不能確保針對 SARS-CoV-2 突變體有效[75]。人類與 SARS-CoV-2 的斗爭短期之內(nèi)無法結束，未來的藥物研發(fā)需要密切關注 SARS-CoV-2 基因突變，不斷根據(jù)新的靶點設計新的疫苗和抗病毒藥物，同時結合臨床診斷分析，注重對病毒造成的宿主免疫系統(tǒng)的變化所引起的逃逸、耐藥性和發(fā)病機制的研究。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2022.03.001

中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程重大協(xié)同創(chuàng)新項目（2020-I2M-2-010）

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所國家衛(wèi)生健康委員會抗生素生物工程重點實驗室/中國醫(yī)學科學院藥物合成生物學重點實驗室

王麗非：Email：lifeiwang2002@hotmail.com；洪斌：Email：binhong69@hotmail.com

2021-12-03