劉鑫磊，林鈮，周曉冰，李波

·綜述·

肝器官芯片的研究進展

劉鑫磊，林鈮，周曉冰，李波

人體器官生物芯片是通過微流控技術(shù)，結(jié)合細胞生物學、工程學和生物材料等多學科，模擬人體組織器官主要結(jié)構(gòu)和功能特征，在體外構(gòu)建的微流體微生理系統(tǒng)[1]。與傳統(tǒng)的毒理學動物實驗相比，應用器官芯片更能反映人體內(nèi)真實情況，避免了動物實驗預測人體結(jié)果的差異；同時相對于靜態(tài)培養(yǎng)替代方法，又能更好地體現(xiàn)出組織的敏感性和特異性[2-3]。此外，這種檢測方式可以減少對研究動物的需要，符合減少、替代、優(yōu)化的 3R 原則。

肝臟作為機體的代謝中樞，對藥物的代謝發(fā)揮著重要作用，同時也成為藥物毒性作用的重要靶器官，進入 I 期臨床試驗后因肝臟毒性導致的新藥研發(fā)失敗占到 90% 以上。最重要的安全問題之一是藥物誘發(fā)的肝損傷，它可引起急性或慢性肝病，并且是藥物從臨床試驗乃至市場撤出的主要原因。目前對肝損傷的不良預測通常是臨床前階段直接將不同物種的數(shù)據(jù)外推到臨床階段而得出的，但仍有約 30% 的藥物性肝損傷無法預測[4]，因此開發(fā)高效、可靠、便捷的肝毒性預測模型是藥物研發(fā)和安全性評價領域重點關注的難點和熱點，正是這些迫切的需求，以及微流控技術(shù)的發(fā)展，催生了肝器官芯片的發(fā)展和應用研究[5]。為了使廣大科研工作者更好地了解肝器官芯片，本文綜述了近些年肝器官芯片的構(gòu)建、與其他器官共培養(yǎng)多器官芯片及其應用的研究進展和面臨的挑戰(zhàn)。

1 肝器官芯片的構(gòu)建

1.1 細胞系

在解剖學中，肝臟主要有四種細胞，分別是肝實質(zhì)細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、枯否細胞、肝星狀細胞。原代細胞和組織切片在短時間內(nèi)可以保持起源時的形態(tài)和功能特征，但其壽命和擴張能力有限，難以用于高通量研究。細胞系有比原代細胞更高的復制能力和穩(wěn)定的表型，可以長期使用，有助于可重復的研究，所以細胞系廣泛應用于藥物研發(fā)實驗[6-7]。

HepaRG 細胞系誘導分化后可以表達較高的 CYP3A4 和 CYP2B6，其中 CYP3A4 是肝臟分泌最多的代謝酶，涵蓋市面上三分之二的藥物代謝；CYP2B6 僅占肝臟酶分泌的 5%，但可涵蓋市面上 25% 以上的藥物代謝，因此誘導分化的 HepaRG 細胞在體外肝臟模型建立過程中常用來代替肝實質(zhì)細胞。在研究肝非實質(zhì)細胞作用的過程中，可加入肝枯否細胞。枯否細胞是肝組織內(nèi)的巨噬細胞，是單核吞噬細胞系統(tǒng)的一部分，由血液的單核細胞黏附于肝竇壁分化而形成的，可通過吞噬作用清除血循環(huán)的異物顆粒或衰老的紅細胞、血小板、NK 細胞。肝枯否細胞和星狀細胞均在肝臟的免疫防御以及肝纖維化、肝炎或脂肪性肝炎的病理生理中起著至關重要的作用。為了研究酒精誘導的脂肪肝中單個肝非實質(zhì)細胞的病理生理過程，Deng 等[8]應用四種轉(zhuǎn)化細胞系 HepG2 細胞、LX-2 細胞、EAhy926 細胞和 U937 細胞共培養(yǎng)以組成肝微流控芯片。

已建立的細胞系用于細胞培養(yǎng)和體外藥物測試，但是這些細胞最初都是從腫瘤中獲取的，可能并不能代表健康的肝功能，為了獲得足夠數(shù)量和適當功能性的肝細胞，人類多能干細胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）可作為體外類器官建立的常用細胞來源。Kamei 等[9]利用微流控裝置建立了 hPSCs 肝分化的方法，在三維環(huán)境中誘導 hPSCs 進行分化，通過 CYP450 的表達和吲哚氰綠（ICG）排泄實驗來判定肝細胞的成熟和功能。

1.2 常用模型

目前常用的肝類器官芯片模型主要有肝微球、三明治夾心模型。低吸附球形板和懸滴成球技術(shù)是培養(yǎng)肝微球常用的技術(shù)手段。常規(guī)的 2D 培養(yǎng)模式無法模擬人體復雜微環(huán)境以及細胞外基質(zhì)的支持，3D 培養(yǎng)環(huán)境可以使細胞表面的黏附因子更加均勻地表達[10]。Bhise 等[11]用甲基丙烯酸酐化明膠（GelMA）模擬細胞外基質(zhì)，將其與肝小球混合后，進行肝臟 3D 生物打印。實驗表明，將細胞接種在 GelMA 微結(jié)構(gòu)的表面生長狀態(tài)良好，芯片腔室內(nèi)用膠原包被有利于細胞的播種和培養(yǎng)[12-13]。芯片的多層設計可用于模擬藥物吸收和排泄過程，在研究不同給藥方案下藥物吸收、代謝以及毒性反應方面具有巨大潛力。

在無菌、溫度、pH 值、培養(yǎng)基和藥物的流體流動等穩(wěn)定培養(yǎng)條件下，Yu 等[14]設計了一種用于 3D 細胞培養(yǎng)的灌注-導管-肝臟芯片，以確保培養(yǎng)基在球狀培養(yǎng)上的切線流動。肝細胞功能顯著改善，并維持 14 天的恒定值(尿素、白蛋白合成和 CYP450 酶活性)。用雙氯芬酸和對乙酰氨基酚重復給藥的慢性藥物反應進行評估，結(jié)果表明該動態(tài)培養(yǎng)比靜態(tài)培養(yǎng)更敏感，生物芯片中白蛋白的產(chǎn)量提高了一倍。除此之外，在生物芯片上顯示了一種特定膽汁酸的代謝。利用微流控網(wǎng)絡模擬體內(nèi)循環(huán)結(jié)構(gòu)、各臟器體積比、門靜脈至肝動脈血流比等生理參數(shù)，可構(gòu)建適合于體內(nèi)條件的體外藥代動力學模型。

2 肝器官芯片與其他器官的共培養(yǎng)研究

微流控單器官芯片模型旨在重現(xiàn)該器官功能，雖然其可提供有關靶器官生理反應的有用信息，但卻無法展現(xiàn)人體中不同組織和器官之間的相互作用。為了能夠模擬相對復雜的人體生理反應和器官-器官相互作用，并開展疾病建模、藥效評價、藥物篩選等研究，在過去幾年中出現(xiàn)了各種多器官芯片。

多器官聯(lián)合培養(yǎng)會影響肝臟代謝的功能以及相關酶的表達量。肝腸共培養(yǎng)微流控芯片由腸上皮細胞和肝細胞兩層獨立組成，其設計目的可使藥物在腸道培養(yǎng)室內(nèi)依次吸收，在肝培養(yǎng)室內(nèi)進行代謝反應。Chen 等[15]使用人原代腸細胞建立肝腸共培養(yǎng)模型，與單器官動態(tài)培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)系統(tǒng)的細胞代謝率（尿素或白蛋白的產(chǎn)生）無顯著變化，但 CYP 活性顯著提高。Choe 等[16]將 Caco-2 和 HepG2 在芯片上培養(yǎng)時，也觀察到兩種細胞的 CYP450 代謝活性均顯著增強，Caco-2 細胞的吸收性能也隨之發(fā)生變化。肝腸共培養(yǎng)比單培養(yǎng)的代謝譜更接近于人體天然的代謝譜，這些結(jié)果顯示了肝器官芯片在預測人類反應的臨床前研究中的潛力。Yu 等[17]研究表明在多能干細胞衍生的內(nèi)皮細胞和肝細胞共培養(yǎng)環(huán)境中，與靜態(tài)對照相比，微流控芯片上檢測到抗炎營養(yǎng)藥物槲皮素代謝產(chǎn)物的水平更高，可以更顯著抑制 IL-1β 介導的炎癥。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，微流控培養(yǎng)可能具有更靈敏的生理反應。

多數(shù)藥物進入人體后會經(jīng)歷吸收-分布-代謝-排泄過程。藥物代謝動力學指體內(nèi)藥物濃度與時間的關系。藥物效應動力學指體內(nèi)藥物濃度與作用效應強度的關系。動物實驗主要進行的是終點分析，而微流控芯片可以做到實時跟蹤監(jiān)測。Bavli 等[18]在線粒體功能障礙研究中，能提供實時分析線粒體應激的早期指示物的微小轉(zhuǎn)變。Marin 等[19]研究了對乙酰氨基酚在微流控條件下雙器官芯片中的藥代動力學特性。乙酰氨基酚的腸道吸收和肝代謝分別由人體的腸道和肝臟類器官模擬，腸屏障使用 Caco-2 和 HT-29 細胞構(gòu)建，肝球體由 HepaRG 和 HHSteC 細胞構(gòu)建（圖1）。此外，有研究采用肝臟免疫活性共培養(yǎng)模型應用于雙氯芬酸和氫化可的松的藥物代謝動力學的研究，培養(yǎng) 48 小時后評估生物轉(zhuǎn)化，主要 I 期和 II 期代謝物與人類體內(nèi)代謝譜相似，所得結(jié)果接近人體實際值，表明該芯片可用于藥物代謝動力學研究[20]。

肝臟與其他器官的活動密切相關，而微流控芯片可以使肝臟球形體與不同的人體類器官（如胰島、皮膚穿刺活檢、神經(jīng)元球形體或腸道組織）進行共培養(yǎng)并在數(shù)周內(nèi)保持穩(wěn)態(tài)，對于藥物的吸收代謝及毒性反應可以有更詳細深入的研究[21-22]。多器官微流控芯片可用于癌癥轉(zhuǎn)移的研究，Kim等[23]利用 3D 微流體人體肝器官芯片研究細胞外囊泡在乳腺癌細胞肝轉(zhuǎn)移中的作用。肝腎微流控芯片研究表明乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移有明顯的肝向性，而非腎向性[24]。在藥物毒性反應方面，Lin 等[25]利用微流控芯片進行肝腎共培養(yǎng)，通過環(huán)孢素 A 與利福平的聯(lián)合使用證明構(gòu)建了一種新型的、具有潛在優(yōu)勢的毒理學研究替代模型。Baert 等[21]首次建立了肝臟與睪丸的體外共培養(yǎng)，以研究藥物經(jīng)肝酶代謝后對其他器官的療效及副作用（圖2）。

圖1 肝腸共培養(yǎng)芯片模擬口服給藥

圖2 肝臟與睪丸的體外共培養(yǎng)

此外，利用具有皮膚結(jié)構(gòu)的心肝器官芯片可用于研究局部給藥的藥物毒性，這種有效的皮膚阻隔模型還可以對比急性和慢性藥物的影響[26]。多種共培養(yǎng)模型顯示出較為理想的代謝表征，有望成為藥物篩選的重要模型。

3 肝器官芯片應用

由于肝器官芯片是基于充分了解人體的復雜組織器官結(jié)構(gòu)和生理功能特點而構(gòu)建的，所以這種近生理的體外模型在疾病建模，藥物篩選、開發(fā)與安全性評價，肝毒性篩選，再生醫(yī)學和個性化精密醫(yī)學等領域具有巨大的應用價值和前景。本文僅列舉藥物研發(fā)與評價、疾病機制分析的研究進展。

3.1 藥物評價研究

在藥物有效性和安全性評價中，微流控芯片作為一個體外模型，雖然不能完全替代動物實驗，但是器官芯片的重要優(yōu)勢在于構(gòu)建它的細胞可直接來源于人，因此可以避免動物與人的種屬差異。Ma 等[27]研制了一種集成的多層微流控裝置，用于藥物代謝產(chǎn)物表征和藥物代謝誘導的細胞毒性分析。2012 年，Prot 等[28]在微流控生物芯片中培養(yǎng)的肝癌細胞的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組學數(shù)據(jù)整合，更完整地重建對乙酰氨基酚損傷通路。這項工作是全球整合微流控生物芯片數(shù)據(jù)進行毒性評估的首例，證明了這種新方法在預測毒理學方面的潛力。

藥物相互作用是藥物研究中的重要因素，一種藥物可以增加或降低與代謝另一種藥物相關的代謝酶的活性，因此，它可以更快或更慢地降解次級藥物，從而最終改變其治療效果或毒性反應[29]。Ma 等[30]使用已建立的肝仿生微組織，研究臨床藥物之間的相互作用，結(jié)果表明，預先給予影響 CYP-1A1/2 或尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶活性的藥物會改變后續(xù)給藥藥物的毒性作用。Vernetti 等[31]設計的微流控芯片系統(tǒng)可在連續(xù)介質(zhì)灌注下維持約一個月，表現(xiàn)出穩(wěn)定的代謝活性，包括長達 23 天的 I 期和 II 期藥物代謝、蛋白質(zhì)分泌、膽汁生成以及對各種有毒化合物的最終反應，證明了微流控芯片具有用于長期毒性研究的潛力。

在 CYP 酶活性較低的系統(tǒng)中，由于毒性代謝物的積累較低，發(fā)生藥物肝毒性所需的劑量明顯高于體內(nèi)的真實血藥濃度。因此，肝器官芯片具有高水平的肝毒性檢測靈敏度。

3.2 疾病機制分析

微流控芯片可用于體內(nèi)炎癥的相關研究中。無論是單一培養(yǎng)還是與其他肝非實質(zhì)細胞共培養(yǎng)的原代成人肝細胞（primary human hepatocytes，PHH），3D 肝器官芯片為研究具有生理宿主細胞反應的長期乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染提供了重大改進。除了促進藥物功效研究，毒理學分析和發(fā)病機制研究之外，這些微流控培養(yǎng)系統(tǒng)還可以評估針對 HBV 感染的治愈性療法，通過 PHH 單培養(yǎng)和 PHH/Kupffer細胞共培養(yǎng)的設置，進行被 HBV 感染的宿主反應分析。該方法適用于研究 HBV 的發(fā)病機制、治療方案及其感染的長期影響[26, 32-33]。

非實質(zhì)細胞在酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。然而，這種細胞行為在傳統(tǒng)的體外酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)模型和動物模型中不便觀察。Deng 等[34]開發(fā)了一種可拆卸的芯片式肝臟裝置，用于研究酒精誘導的 ALD 中個體非實質(zhì)細胞的病理生理過程。該肝臟裝置由 HepG2、LX-2、EAhy926 和 U937 細胞在灌注下按生理分布順序排列組成。該裝置可以改善 HepG2 細胞的活性，維持包括白蛋白合成和尿素分泌在內(nèi)的高肝功能。這種新型的肝臟裝置能夠重建酒精誘導的肝非實質(zhì)細胞系的損傷過程，并通過測量不同類型肝非實質(zhì)細胞系的多種生物標志物，包括 Ve-cadherin、eNOS、VEGF 和 a-SMA 來了解不同類型肝細胞在 ALD 期間的狀態(tài)，可用于進一步的病理分析和藥物及毒物篩選研究。

此外，Gr?ger 等[35]首次測試了低溫下肝器官芯片維持細胞活性、組織形態(tài)和代謝轉(zhuǎn)化活力的能力。此項系統(tǒng)研究中，使用組織保存液 TiProtec 低溫保存肝器官芯片，能使其功能性維持 2 天，從而使肝器官芯片在生物醫(yī)學領域中有更為廣泛和靈活的應用。

4 展望

近年來，已經(jīng)開發(fā)出各種體外肝臟系統(tǒng)以模擬肝功能和病理生理學，其中微流體設備可以精準控制生物力學、生化參數(shù)，從而在細胞、組織和器官水平上模擬人體內(nèi)環(huán)境。但目前大多數(shù)器官芯片均處于研究階段，在實際應用中仍有一些問題需要解決，包括如何建立更符合人體生理的肝器官芯片體系，實現(xiàn)多種器官的功能關聯(lián)性和兼容性，如何實現(xiàn)肝器官芯片標準化和集成傳感檢測，以及如何推動器官芯片的法規(guī)認可及新藥注冊申報應用等。在材料層面上，肝器官芯片使用的某些聚合物（例如 PDMS）會吸收或釋放化合物，特別是疏水性藥物和激素，這可能會對肝毒性研究產(chǎn)生影響并使得藥物篩選過程具有挑戰(zhàn)性。在性能標準方面，需要制訂完善的質(zhì)量控制性能標準。器官芯片作為特殊的微流控技術(shù)與體外試驗的結(jié)合，首先應按照 3Q 程序驗證微流控系統(tǒng)的裝置或設備；其次，應定義用于器官或疾病模型的每個細胞的質(zhì)量標準，包括細胞來源、分化和適用范圍等；最后，統(tǒng)一的性能指標以及讀數(shù)的標準化對于確認芯片的生理相關性能也是非常必要的。在法規(guī)監(jiān)管方面，證明使用芯片的測試結(jié)果與臨床試驗的結(jié)果平行對于監(jiān)管批準至關重要，器官芯片的可靠性和相關性尚需進行充分的驗證。因此，盡管肝器官芯片的研發(fā)目前已經(jīng)取得了突飛猛進的發(fā)展，但仍需研發(fā)、商業(yè)及監(jiān)管機構(gòu)不斷共同努力解決上述問題，以推進其在藥物評價和研發(fā)中的實際應用。

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“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2018ZX09201017-001）

100176 北京，中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心，藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室

周曉冰，Email：zhxb@nifdc.org.cn

2021-12-02