葉禹秀, 羅小衛(wèi), 楊斌, 林秀萍, 劉永宏, 周雪峰

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院, 廣西 南寧 530200;

2. 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室, 廣東省海洋藥物重點實驗室, 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 廣東 廣州510301;

3. 海南省熱帶海洋生物技術(shù)重點實驗室, 三亞中科海洋研究院, 海南 三亞 572024

為適應(yīng)復(fù)雜的海洋生態(tài)環(huán)境, 海藻共附生微生物可產(chǎn)生獨特的次生代謝產(chǎn)物參與宿主的防御體系,幫助宿主抵抗外界致病菌和病毒的侵害, 以及其他海洋生物的攻擊。這些獨特的次生代謝產(chǎn)物往往骨架新穎、活性顯著, 為新型海洋藥物的研發(fā)提供寶貴資源(楊曦亮 等, 2020)。擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)作為一類分布較為廣泛的內(nèi)生真菌,其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)新穎性、生物活性豐富的特點, 很多具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗真菌、抗病毒活性(陳霈雯 等, 2019; 馬麗麗 等, 2021)。對陸地植物和沿海紅樹植物共附生來源擬盤多毛孢屬真菌的代謝產(chǎn)物研究相對較多, 如冼嘉韻 等(2017)從南海紅樹林植物桐花樹來源的內(nèi)生雜色擬盤多毛孢屬真菌中分離得到具有良好抗腫瘤活性化合物pestalachlorides C 和抗炎活性的 pestalachlorides B。對海洋動植物來源的該屬真菌代謝產(chǎn)物研究相對較少。本課題組前期從南海永興島海域采集的礁棲腔節(jié)藻屬海藻(Coelarthrumsp.)中分離得到一株擬盤多毛孢屬真菌Pestalotiopsis neglectaSCSIO41403,已經(jīng)從中分離鑒定6 個具有較弱細(xì)胞毒性的天然產(chǎn)物, 2 個具有較明顯的COX-2 抑制活性的二苯酮衍生物和1 個可作為肝臟X 受體α 調(diào)節(jié)劑的天然產(chǎn)物(Wang et al, 2020a, b; Liang et al, 2021)。然而, 該礁棲海藻共附生真菌代謝產(chǎn)物非常豐富, 仍有不少代謝產(chǎn)物尚未分離鑒定。因此, 本研究在HPLC 導(dǎo)向下對重新發(fā)酵的該菌株提取物進(jìn)行化學(xué)成分研究,定向分離純化該菌株中尚未鑒定的代謝產(chǎn)物, 以期發(fā)現(xiàn)更多結(jié)構(gòu)新穎或活性顯著的天然產(chǎn)物, 為海藻來源擬盤多毛孢屬真菌的藥用活性成分挖掘提供重要依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker 公司AVANCE-500 MHz); 質(zhì)譜儀(Waters 公司XEVO TQD); 高效液相色譜儀(日本島津公司LC10AVP); 中壓制備色譜(瑞士步琪 LC3000); 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化N-1100D-WD); 電子天平(德國塞多利斯股份公司BS110S); 數(shù)控超聲波清洗器(鞏義市予華儀器有限公司KQ-250DB); 三層多功能搖床(北京博宇寶威實驗設(shè)備有限公司HYG-CXI 型); 自動蒸汽滅菌鍋(合肥華泰醫(yī)療器械有限公司LX-B100L 型); 半制備色譜柱: YMC-Pack, ODS-A, 250×10mm,S-5μM ,12nm(YMC 公司); 薄層層析硅膠GF-254 和柱層析硅膠 200-300 目(煙臺江友硅膠有限公司);HPLC 色譜純試劑: 甲醇、乙腈(瑞典Oceanpark 公司); 實驗分析純試劑: 石油醚、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等(天津大茂化學(xué)試劑廠)。

1.2 菌種來源

菌株分離自采集于南海永興島附近海域珊瑚礁的腔節(jié)藻屬海藻(Coelarthrumsp.), 鑒定為擬盤多毛孢屬真菌Pestalotiopsis neglectaSCSIO41403(Wang et al, 2020a)。海藻和真菌菌株分別由中國科學(xué)院南海海洋研究所連喜平博士和林秀萍博士鑒定, 菌種樣本保存在中國科學(xué)院南海海洋研究所海洋微生物研究中心(編號SCSIO41403)。

1.3 提取分離

菌株發(fā)酵過程見前期報道的方法(Wang et al,2020a)。獲得的乙酸乙酯浸膏采用中壓色譜柱進(jìn)行分離, 用 100～200 目硅膠拌樣, 經(jīng)中壓制備色譜分離(石油醚:CH2Cl2100:0～1:1)梯度洗脫后得到41 個餾分(Fr.1～Fr.41)。在高效液相分析導(dǎo)向下,定向分離之前尚未發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物。Fr.4 經(jīng)半制備高效液相(CH3CN:H2O 90:10)分離純化得到化合物 1(3.9mg), Fr.26 經(jīng)半制備高效液相(CH3CN:H2O 34:66) 分離純化得到化合物2(13.5mg)、化合物 5(5.9mg)和化合物 6(3.5mg);Fr.7 經(jīng)半制備高效液相(CH3CN:H2O 90:10)分離純化得到化合物 3(10.7mg); Fr.24 經(jīng)半制備高效液相(CH3CN:H2O 70:30)純化得到化合物4(9.1mg)?；衔?～6 結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

1.4 抗菌活性實驗

供抗菌活性篩選的菌株為白色念珠菌(Candida albicansATCC 10231)。采用K-B 法(Kirby-Bauer test)測定分離得到的6 個化合物對白色念珠菌的抑制活性(譚才鄧 等, 2016)。

供試菌的準(zhǔn)備: 將白色念珠菌菌種接種到LB瓊脂培養(yǎng)基上活化24～48h, 然后接種于30mL LB 液體培養(yǎng)基中, 置于恒溫震蕩搖床中(28 ℃,180r·min-1), 培養(yǎng)24h。

試驗平板的準(zhǔn)備: 先往已冷卻至 50℃左右的LB 半固體培養(yǎng)基中注入3mL 菌液, 混合均勻, 傾注平板約30mL, 靜置待用。

抗菌活性測定: 將無菌干燥的空白濾紙片(直徑 6mm)分別用移液槍滴加藥物原液和對照溶液,每張濾紙片含待測待測化合物分別為5μg, 陰性對照為甲醇, 陽性對照為制霉菌素(nystatin)。將各含藥紙片貼加于試驗平板, 37℃恒溫培養(yǎng)18～24h, 測定其紙片周圍抑菌圈直徑的大小。

2 實驗結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物3: 白色粉末, 10.7mg, 分子式C11H12O4;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δHppm: 5.20 (2H, s, H-2),3.76 (3H, s, 5-OMe), 2.19 (3H, s, 6-Me), 2.14 (3H, s,4-Me);13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δCppm: 173.2 (C,C-1), 163.9 (C, C-5), 153.9 (C, C-7), 143.6 (C, C-3),118.6 (C, C-6), 116.7 (C, C-4), 106.2 (C, C-8), 70.2(CH2, C-2), 60.4 (O-CH3, 5-OMe), 11.5 (CH3, 4-Me),8.7 (CH3, 6-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致, 故鑒 定 該 化 合 物 為 7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalidc (Jia et al, 2015)。

化合物4: 白色粉末, 9.1mg, 分子式C10H12O3;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δHppm: 6.70 (1H, q,J=6.5 Hz, H-2’), 5.89 (1H, s, H-5), 5.44 (1H, s, H-3),3.80 (3H, s, 4-OMe), 1.82 (3H, d,J= 7.0 Hz, 2′-Me)1.80 (3H, s,1′-Me);13C NMR (125 MHz, CDCl3)δCppm: 171.6 (C, C-4), 164.5 (C, C-2), 161.4 (C, C-6),130.4 (CH, C-2′), 126.7 (C, C-1′), 97.3 (CH, C-5),88.1 (CH, C-3), 56.0 (CH3, 4-OMe), 14.4 (CH3,2′-Me), 12.2 (CH3, 1′-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致, 故鑒定該化合物為pestalotiopyrones G (張宏岐 等, 2018)。

化合物5: 黃色粉末, 5.9mg, 分子式C7H6O2;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δHppm: 9.88 (1H, s, H-7),7.82 (2H, dd,J= 8.1,1.0 Hz, H-2,6), 6.96 (2H, dd,J=8.1,1.0 Hz, H-3,5);13C NMR (125 MHz, CDCl3)δCppm: 191.1 (CH, C-7), 161.3 (C, C-4), 132.5 (CH,C-2), 132.5 (CH, C-6), 130.2 (C,C-1), 116.1 (CH, C-3),116.1 (CH, C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致, 故鑒定該化合物為 4-hydroxybenzaldehyde (田倩倩 等,2010)。

化合物 6: 淡黃色粉末, 5.9 mg, 分子式C10H12O3;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δHppm: 7.27(1H, s, 4-OH), 7.09 (2H, dd,J= 8.0,1.0 Hz, H-2,6),6.77 (2H, dd,J= 8.0,1.0 Hz, H-3,5), 4.24 (2H, t,J=6.8 Hz, H-8), 2.87 (2H, t,J= 6.8 Hz, H-7), 2.05 (3H, s,H-10);13C NMR (125 MHz, CDCl3)δCppm: 171.3 (C,C-9), 154.3 (C, C-4), 130.1 (CH, C-2), 130.1 (CH,C-6), 120.5(C, C-1),115.4 (CH, C-3), 115.4 (CH, C-5),65.3 (CH2, C-8), 34.2 (CH2, C-7), 21.1 (CH3, C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致, 故鑒定該化合物為4-羥基苯乙基乙酸酯 (韋瑋 等, 2018)。

2.2 抗菌活性

通過觀察試驗平板發(fā)現(xiàn)化合物3(1mg·mL-1)對白色念珠菌有明顯抑制活性, 其抑菌圈直徑為25mm, 其他化合物無明顯活性。陽性藥 nystatin(25mg·mL-1)抑菌圈直徑為30mm。

3 討論

本文對腔節(jié)藻海藻來源擬盤多毛孢屬真菌Pestalotiopsis neglectaSCSIO41403 的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離鑒定, 共分離出6 個單體化合物, 為首次從該菌株發(fā)現(xiàn), 其中化合物1、2、5 和6 是首次從海洋動植物(不含紅樹植物)共附生微生物中發(fā)現(xiàn)。根據(jù)文獻(xiàn)報道, 化合物6 對子宮頸癌細(xì)胞有顯著抑制活性(關(guān)永強(qiáng) 等, 2014)?；衔? 對Cox-B3和RSV 有明顯的抗病毒活性, 其IC50分別為39.0和78.0μmol·L-1(Jia et al, 2015)。本研究首次發(fā)現(xiàn)化合物3 對白色念珠菌有明顯抑制活性。

根據(jù)文獻(xiàn)報道, 海藻共附生真菌代謝產(chǎn)物的生物活性主要集中在抗菌和抗腫瘤領(lǐng)域, 其次為抗氧化、抗炎等其他活性。這些活性天然產(chǎn)物的產(chǎn)生與特殊的生存環(huán)境及宿主的生長調(diào)節(jié)、化學(xué)防御等生命活動密切相關(guān)(楊曦亮 等, 2020)。海藻共附生真菌活性次級代謝產(chǎn)物研究雖已取得一定進(jìn)展, 但其具體的代謝意義和特殊性, 以及與藻類宿主的微妙關(guān)系仍有待深入探究。對于擬盤多毛孢屬真菌, 文獻(xiàn)中陸地植物和沿海紅樹植物來源的代謝產(chǎn)物研究相對較多, 而對海洋來源比如海藻共附生來源的, 其代謝產(chǎn)物和活性化合物研究相對較少。本研究為海藻共附生擬盤多毛孢屬真菌的代謝產(chǎn)物研究及其藥用活性挖掘提供了參考。