尹天齊, 王慶, 楊宇峰,2, 岑競儀

1. 暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 廣東 廣州 510632;

2. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室, 廣東 珠海 519000

浮游動物種類多、數(shù)量大、分布廣, 連接了浮游植物和其他水生動物, 是水體食物網(wǎng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)(Bucklin et al, 2021)。浮游動物作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分, 是魚類幼體的良好開口餌料,其動態(tài)變化影響著魚類、浮游植物和無脊椎動物的生物量(Novotny et al, 2021)。作為環(huán)境和氣候變化的指示生物, 浮游動物在河口區(qū)域的生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用(楊宇峰 等, 2006)。

珠江口地處亞熱帶, 是咸淡水交匯海域, 受珠江徑流、廣東沿岸流和外海水的綜合影響, 生態(tài)環(huán)境獨特, 生物組成多樣。研究者從20 世紀80 年代至今已對珠江口浮游動物進行了大量調(diào)查研究, 他們多使用淺水Ⅰ型網(wǎng)采集后通過形態(tài)學(xué)鑒定進行種類組成和時空分布研究(李開枝 等, 2005; 彭鵬飛等, 2015), 或使用淺水Ⅱ型網(wǎng)采集后通過形態(tài)學(xué)鑒定研究珠江口浮游動物的群落結(jié)構(gòu)組成及其對環(huán)境因子的響應(yīng)(Tan et al, 2004; 黃彬彬 等, 2017), 探討珠江口中型浮游動物的攝食選擇性、繁殖屬性及營養(yǎng)級聯(lián)效應(yīng)機制(司悅悅 等, 2018)。使用孔徑較大的浮游生物網(wǎng)會嚴重低估中小型浮游動物類群和浮游幼體(Turner, 2004; 連喜平 等, 2013)。已有研究表明, 中小型浮游動物在海洋生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用(李開枝 等, 2021)。

DNA 分子鑒定基于DNA 條形碼(DNA barcode)技術(shù)。DNA 條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA 片段, 是生態(tài)學(xué)研究的重要工具, 近年來被廣泛用于水生生物檢測, 已成為海洋浮游動物多樣性評估的有效方法(Bryant et al, 2021)。形態(tài)學(xué)和分子鑒定相結(jié)合的方法在霉菌(徐旭華 等, 2021)、鱗翅目害蟲(詹金鈺 等, 2021)、魚類(Hoogendoorn et al,2020)等物種鑒定中均有應(yīng)用。近年來, 該方法也應(yīng)用于浮游動物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的時空變化研究(Novotny et al, 2021; Coguie et al, 2021)。

本研究在珠江口海域使用4 種浮游生物網(wǎng)采集浮游動物樣品, 進行形態(tài)學(xué)鑒定和DNA 分子鑒定,分析浮游動物的群落結(jié)構(gòu)特征, 并比較不同調(diào)查方法對浮游動物群落結(jié)構(gòu)研究結(jié)果的影響, 以期為深入全面研究南海近海浮游動物提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 采樣站位與采樣時間

2019 年12 月對珠江口海域共10 個站位進行了生態(tài)調(diào)查(圖1)。

1.2 浮游動物形態(tài)學(xué)樣品采集、鑒定與計數(shù)

浮游動物形態(tài)學(xué)鑒定樣品分別使用淺水I 型浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)衣孔徑0.505mm, 網(wǎng)長145cm)、淺水Ⅱ型浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)衣孔徑0.160mm, 網(wǎng)長140cm)、淺水Ⅲ型浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)衣孔徑0.077mm, 網(wǎng)長140cm)和25#浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)衣孔徑0.064mm, 網(wǎng)長45cm)采集。自樣點底層至表層使用淺水I/ Ⅱ/Ⅲ型浮游生物網(wǎng)垂直拖網(wǎng)采集樣品, 濃縮后裝入體積為500mL的塑料廣口瓶中, 使用數(shù)字生物網(wǎng)口流量計計算水體體積; 用采水器采集不同深度的樣品50L, 用25#浮游生物網(wǎng)濃縮后裝入塑料瓶中。浮游動物樣品用甲醛溶液固定保存(終濃度5%)后帶回實驗室, 在顯微鏡和解剖鏡下對樣品進行鑒定、計數(shù)并剔除雜質(zhì),然后稱量浮游動物濕重(天平稱量法)(徐姍楠 等,2017)。

使用 YSI 便攜式水質(zhì)分析儀現(xiàn)場采集各站位溫度、鹽度、pH、溶解氧(dissolved oxygen, DO)等數(shù)據(jù)。浮游動物樣品的采集、運輸、保存和分析均按照《海洋監(jiān)測規(guī)范 第7 部分:近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測》(GB 17378.1-2007)(中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局 等, 2008a)和《海洋調(diào)查規(guī)范》(GB/T 12763.1-2007)(中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局 等, 2008b)所規(guī)定的方法進行。種類鑒定參照《中國海洋浮游橈足類多樣性》(連光山 等, 2018)、《中國海洋浮游橈足類圖譜》(張武昌 等, 2019)和《中國近海常見浮游動物圖集》(孫松 等, 2015)等分類書籍; 為跟蹤分類的最新進展,同時參考WoRMS(https://www.marinespecies.org/)等專業(yè)網(wǎng)站。

1.3 水體DNA 樣品和網(wǎng)采浮游動物DNA 樣品的采集與測序

1.3.1 水體和網(wǎng)采DNA 樣品的采集

選取站點SZ02、SZ07、SZ10 用于比較傳統(tǒng)調(diào)查方法和DNA 分子鑒定對浮游動物群落結(jié)構(gòu)研究結(jié)果的差異。用采水器分層采集水體樣品, 混合均勻后采集2L 水樣用孔徑為0.45μm 的混合纖維素酯膜(直徑47mm, Millipore HAWP04700, USA)現(xiàn)場過濾, 獲得水體DNA 樣品; 使用淺水Ⅱ型網(wǎng)自底層垂直拖網(wǎng)采集濃縮的浮游動物樣品, 并通過孔徑為0.45μm 的混合纖維素酯膜(直徑 47mm, Millipore HAWP04700, USA)現(xiàn)場過濾, 使用數(shù)字生物網(wǎng)口流量計計算水體體積, 獲得網(wǎng)采DNA 樣品。水體DNA樣品和使用淺水Ⅱ型網(wǎng)采集的DNA 樣品濾膜用液氮保存后帶回實驗室, 用 DNeasy Power Soil Kit(QIAGEN 12888, Germany)試劑盒進行DNA 提取,獲得的DNA 樣品放置于-80℃保存。

1.3.2 樣品PCR 和Illumina MiSeq 測序

選取亞熱帶近海真核生物通用引物528F(5′-GCGGTAATTCCAGCTCCAA-3′) 和 760R(5′-AATCCRAGAATTTCACCTCT-3′)用于18S rRNA基因PCR 擴增(Cheung et al, 2010)。PCR 反應(yīng)程序為: 94℃變性3min, 然后進行30個循環(huán)(94 ℃ 30s, 60 ℃ 30s,72 ℃ 1min),最后72℃延伸5min。PCR 反應(yīng)在20μL(4μL 5×FastPfu 緩沖液,2μL 2.5mmol·L-1dNTPs, 0.8μL 每個引物(5mmol·L-1),0.4μL FastPfu 聚合酶和10 ng 模板DNA)體系中進行。PCR 產(chǎn)物從 2%的瓊脂糖凝膠中提取, 使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)進一步純化, 并根據(jù)協(xié)議使用QuantiFluorTM-ST(Promega, USA)進行定量。純化的擴增產(chǎn)物在Illumina MiSeq 平臺(Illumina, San Diego, USA)上以等摩爾和成對末端聚在一起測序(2×300)。上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供了測序服務(wù)。

1.3.3 水體和網(wǎng)采DNA 樣品數(shù)據(jù)分析

對原始FASTQ 文件進行多路分解、Trimomatic質(zhì)量過濾和FLASH 合并。在序列篩選之后, 為研究樣品的物種組成多樣性, 使用 UPARSE(版本 7.1 http://drive5.com/uparse/)以97%的相似度對操作分類單元(OTU)進行聚類, 并使用UCHIME 鑒定和移除嵌合序列。用 RDP 分類器算法(http://rdp.cme.msu.edu/)對NT 18S rRNA 基因數(shù)據(jù)庫進行分類,以70%的置信度閾值對每個18S rRNA 基因序列進行分類, 得出各站位對應(yīng)的物種信息。使用美吉生物云平臺對OTUs 的代表序列進行物種注釋, 在各分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計, 得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。并對樣品OTUs進行豐度、Alpha 多樣性計算分析, 以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品間的共有和特有OTUs 信息。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.4.1 浮游動物形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)

1.4.1.1 多樣性指數(shù)

物種多 樣性指 數(shù)(H′) 的計算采用Shannon-Wiener 指數(shù)(Shannon et al, 1950), 具體公式如下:

公式中,Pi表示第i種在該海域全部采樣中的比例(ni/N0),S則表示為浮游動物種類總數(shù)。

物種多樣性指數(shù)(D)的計算采用Simpson 多樣性指數(shù)(Simpson, 1949)具體公式如下:

公式中,ni表示第i種的總個體數(shù),N表示該海域所有物種的總個體數(shù)。

1.4.1.2 均勻度

物種均勻度(J)采用Pielou 均勻度指數(shù)(Pielou,1966), 具體公式如下:

1.4.1.3 優(yōu)勢度

為了把優(yōu)勢種數(shù)目控制在一定范圍內(nèi), 規(guī)定當浮游動物優(yōu)勢度Y＞0.02 時, 該種為該海域的優(yōu)勢種(徐兆禮 等, 1989), 計算公式為

公式中,ni表示第i種的總個體數(shù),N表示該海域所有物種的總個體數(shù),fi表示第i種在該海域各站位出現(xiàn)的頻率。

1.4.1.4 多樣性閾值

多樣性閾值Dv分為5類: 即Dv＞3.5 為多樣性非常豐富, 2.6～3.5 為多樣性豐富, 1.6～2.5 為多樣性較好, 0.6～1.5 為多樣性一般, ＜0.6 為多樣性差, 以此來衡量該水域浮游動物的群落結(jié)構(gòu)狀況(陳清潮等, 1994)。

1.4.2 統(tǒng)計分析

采用Graphpad Prism 9.0 進行不同網(wǎng)具之間的生物量和豐度的t 檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 浮游動物種類組成

共鑒定浮游動物36 種(類): 其中橈足類種類最多, 有22 種, 占總種類數(shù)的61.11%; 其次是水母類,有5 種, 占總種類數(shù)的13.89%; 毛顎類2 種, 占總種類數(shù)的5.56%; 被囊類有1 種, 占總體的2.78%;階段性浮游幼蟲有 6 類, 占總種類數(shù)的 16.67%(表1、圖2)。

表1 珠江口浮游動物的種類組成Tab. 1 Species composition of zooplankton in the Pearl River Estuary

各站點浮游動物種類數(shù)范圍為5～17, 其中淺水Ⅲ型網(wǎng)在站點SZ10 采集種類數(shù)最多(17 種), 淺水Ⅰ型網(wǎng)在站點SZ02 和淺水Ⅲ型網(wǎng)在站點SZ01 采集種類數(shù)最少(5 種)。淺水Ⅰ型浮游生物網(wǎng)采集浮游動物種類數(shù)為27 種; 淺水Ⅱ型網(wǎng)采集浮游動物種類數(shù)最多為30 種, 淺水Ⅲ型網(wǎng)采集的種類數(shù)為28 種, 25#浮游生物網(wǎng)采集的浮游動物種類數(shù)最少為21 種(圖2)。

強額孔雀哲水蚤(Parvocalanus crassirostris)為4 種網(wǎng)具采集到的共有優(yōu)勢種; 太平洋紡錘水蚤(Acartia pacifica)為淺水Ⅰ型網(wǎng)采集到的優(yōu)勢種; 短角長腹劍水蚤(Oithona brevicornis)在淺水Ⅲ型網(wǎng)和25#浮游生物網(wǎng)采集的浮游動物中均為優(yōu)勢種; 微刺哲水蚤(Canthocalanus pauper)為淺水Ⅲ型網(wǎng)采集的特有優(yōu)勢種(表2)。小型橈足類(短角長腹劍水蚤)在網(wǎng)衣孔徑較小的浮游生物網(wǎng)采集的浮游動物中為優(yōu)勢種。

表2 不同網(wǎng)具采集的浮游動物種類優(yōu)勢度Tab. 2 Species dominance of zooplankton collected using different types of nets

2.2 浮游動物生物多樣性

各站點浮游動物Shannon—Wiener 多樣性指數(shù)H′淺水I 型網(wǎng)均值最高, 最高值位于站點SZ05, 為2.16; 25#浮游生物網(wǎng)在站點SZ01 采集的浮游動物H′最低, 為0.98。采用淺水Ⅰ型網(wǎng)采集的浮游動物H′與淺水Ⅱ型網(wǎng)和 25#浮游生物網(wǎng)差異顯著(P＜0.05)(圖3)。

對于各站點的Simpson 多樣性指數(shù)D, 淺水I型網(wǎng)采集的結(jié)果均值最高, 最高值位于站點SZ08(0.85); 25#浮游生物網(wǎng)在站點SZ02 采集的結(jié)果最低, 為0.54; 采用淺水Ⅰ型網(wǎng)采集的結(jié)果與淺水Ⅱ型網(wǎng)和25#浮游生物網(wǎng)差異顯著(P＜0.05); 采用25#浮游生物網(wǎng)的采集結(jié)果與淺水Ⅲ型網(wǎng)差異顯著(P＜0.05)。

對于各站點浮游動物均勻度指數(shù)J, 淺水I 型網(wǎng)采集的結(jié)果均值最高, 最高值位于站點SZ02; 在站點SZ03 用淺水Ⅱ型網(wǎng)獲得的結(jié)果最低, 為0.49; 采用淺水Ⅰ型網(wǎng)獲得的結(jié)果與淺水Ⅱ型網(wǎng)和25#浮游生物網(wǎng)差異極顯著(P＜0.01); 采用25#浮游生物網(wǎng)所獲得的結(jié)果與淺水Ⅲ型網(wǎng)差異顯著(P＜0.05)。

對于各站點浮游動物多樣性閾值Dv, 淺水Ⅰ型網(wǎng)均值最高, 最高值位于站點SZ08(1.91); 25#浮游生物網(wǎng)采集的浮游動物Dv在站點SZ01 最低, 為0.52;淺水Ⅰ型網(wǎng)采集的浮游動物Dv與淺水Ⅱ型網(wǎng)和25#浮游生物網(wǎng)差異極顯著(P＜0.01); 采用25#浮游生物網(wǎng)采集的浮游動物Dv與淺水Ⅲ型網(wǎng)差異顯著(P＜0.05)。

2.3 浮游動物豐度和生物量

各站點不同網(wǎng)具采集的浮游動物豐度和生物量變化較大(圖4)。淺水Ⅰ型網(wǎng)采集的浮游動物豐度均值最低, 為115±96ind.·m-3, 范圍為9～331ind.·m-3,最低豐度出現(xiàn)在SZ02 站位; 淺水Ⅱ型網(wǎng)平均豐度為3536±2444ind.·m-3, 范圍為811～9474ind.·m-3,最低豐度出現(xiàn)在SZ09 站位; 淺水Ⅲ型網(wǎng)平均豐度為4314±4172ind.·m-3, 范圍為 460～15221ind.·m-3, 最低豐度出現(xiàn)在SZ09 站位; 25#浮游生物網(wǎng)采集的浮游動物豐度均值最高, 為6741±3826 ind.·m-3, 范圍為2560～16140ind.·m-3, 最高豐度在SZ08 站位出現(xiàn)。淺水Ⅰ型網(wǎng)采集的浮游動物豐度與淺水Ⅱ型網(wǎng)和25#浮游生物網(wǎng)之間的差異極顯著(P＜0.01), 淺水Ⅰ型網(wǎng)采集的浮游動物豐度與淺水Ⅲ型網(wǎng)差異顯著(P＜0.05), 淺水Ⅱ型網(wǎng)采集的浮游動物豐度和25#浮游生物網(wǎng)之間的差異極顯著(P＜0.01), 淺水Ⅲ型網(wǎng)采集的浮游動物豐度與 25#浮游生物網(wǎng)差異顯著(P＜0.05)(圖5)。

各站點淺水Ⅰ型網(wǎng)采集的浮游動物生物量均值最低, 為0.21±0.14g·m-3, 范圍為0.05～0.44g·m-3, 站點 S Z 0 4 最低; 淺水Ⅱ型網(wǎng)平均生物量為0.56±0.33g·m-3, 范圍為0.17～1.10g·m-3, 最低生物量出現(xiàn)在 SZ05 站位; 淺水Ⅲ型網(wǎng)平均生物量為0.50±0.25g·m-3, 范圍為0.19～1.05g·m-3, 最低生物量出現(xiàn)在SZ05 站位; 25#浮游生物網(wǎng)生物量均值最高, 為4.33±3.42g·m-3, 范圍為2.13～12.82g·m-3, 站點SZ10 生物量最高。除淺水Ⅱ型網(wǎng)采集浮游動物生物量與淺水Ⅲ型網(wǎng)無顯著差異外, 其余網(wǎng)型采集的浮游動物生物量相互間差異均極顯著(P＜0.01) (圖5)。不同網(wǎng)型采集的無節(jié)幼體豐度差別較大, 25#浮游生物網(wǎng)采集的無節(jié)幼體豐度顯著高于其他3 種網(wǎng)型(P＜0.01)(圖5); 除去無節(jié)幼體豐度, 25#浮游生物網(wǎng)采集的浮游動物豐度與淺水Ⅲ型網(wǎng)沒有顯著差異(P＞0.05),與淺水I 型和淺水Ⅱ型網(wǎng)采集的浮游動物豐度仍有顯著性差異(P＜0.01 和P＜0.05)(圖5)。

2.4 浮游動物形態(tài)學(xué)鑒定與DNA 分子測序結(jié)果的比較

2.4.1 18S rDNA 高通量測序結(jié)果

將珠江口SZ02、SZ07、SZ10 三個站點的水體DNA樣品和使用淺水Ⅱ型浮游生物網(wǎng)采集的網(wǎng)采DNA樣品進行高通量測序。水體DNA 樣品測序共獲得1718 個OTU, 網(wǎng)采DNA 樣品測序共獲得197 個OTU。

表3 DNA 樣品序列數(shù)和OTU 數(shù)Tab. 3 The number of sequence and OTU in the DNA samples

在門水平上, 水體DNA 樣品檢測出9 門, 網(wǎng)采DNA 樣品檢測出7 門, 形態(tài)學(xué)鑒定浮游動物共5 門(圖6)。網(wǎng)采DNA 樣品和形態(tài)學(xué)鑒定的節(jié)肢動物門相對豐度高于水體DNA 樣品, 水體DNA 樣品能更好地采集并檢測出原生動物種類(圖6)。浮游動物類群中, 哲水蚤種類在三類樣品中占比最高(圖6), 鏡檢樣品中的無節(jié)幼體、浮游幼蟲和魚卵, 在分子樣品中只能注釋為對應(yīng)的種類, 而不能歸類為浮游動物類群。

2.4.2 DNA 分子鑒定與形態(tài)學(xué)鑒定浮游動物種類的比較

在站位SZ02、SZ07、SZ10 采集的水體DNA樣品共檢測出71 條浮游動物OTU, 其中注釋出15 種; 網(wǎng)采DNA 樣品共檢測出31 條浮游動物OTU, 其中注釋出 20 種; 形態(tài)學(xué)鑒定到種的有18 種(表4)。

表4 水體和網(wǎng)采DNA 樣品測序與形態(tài)學(xué)鑒定種類Tab. 4 Zooplankton species in the water and net-collected samples through DNA sequencing and morphological identification

站點SZ02 水體DNA 樣品中注釋出14 種浮游動物; 使用淺水Ⅱ型網(wǎng)采集的DNA 樣品注釋出13種浮游動物; 形態(tài)學(xué)鑒定出8 種浮游動物, 三種方法共同發(fā)現(xiàn)的浮游動物1 種, 為強額孔雀哲水蚤(圖7)。

站點SZ07 水體DNA 樣品注釋出9 種浮游動物;使用淺水Ⅱ型網(wǎng)采集的DNA 樣品中注釋出15 種浮游動物; 形態(tài)學(xué)鑒定出14 種浮游動物, 三種方法共同發(fā)現(xiàn)的浮游動物1 種, 為強額孔雀哲水蚤(圖7)。

站點SZ10 水體DNA 樣品中注釋出11 種浮游動物; DNA 樣品中注釋出13 種浮游動物; 形態(tài)學(xué)鑒定出9 種浮游動物, 三種方法共同發(fā)現(xiàn)的浮游動物1 種, 為強額孔雀哲水蚤(圖7)。

3 討論

3.1 不同網(wǎng)具采集的浮游動物豐度和生物量的比較

本次調(diào)查中浮游動物的豐度與生物量均在歷史記錄范圍內(nèi)(表5), 4 種網(wǎng)具采集的浮游動物中橈足類(種類和豐度)占比均最高, 與已有調(diào)查結(jié)果一致(李開枝 等, 2005; 吳玲玲 等, 2012; 黃彬彬 等,2017)。淺水Ⅱ型網(wǎng)采集浮游動物豐度的最大值顯著低于黃彬彬 等(2017)的調(diào)查結(jié)果, 可能是因為其調(diào)查樣點靠近岸邊, 陸源輸入營養(yǎng)物質(zhì)豐富導(dǎo)致浮游動物豐度較高。淺水Ⅲ型網(wǎng)采集浮游動物豐度和生物量遠高于宋盛憲(1991)的調(diào)查結(jié)果, 可能是珠江口水域富營養(yǎng)化程度增加所致。豐度和生物量(濕重)在某些站點的變化趨勢不一致的原因是該站點的水母和箭蟲含量較大(徐姍楠 等, 2017)。

表5 珠江口浮游動物豐度和生物量調(diào)查結(jié)果的比較Tab. 5 Comparison of zooplankton abundance and biomass in the Pearl River Estuary among different investigations

采用網(wǎng)目較大的網(wǎng)具采集浮游動物會嚴重低估小型浮游動物尤其是小型橈足類的豐度和生物量, 造成數(shù)量級的差異(王榮 等, 2003; 連喜平 等,2013; Chen et al, 2016)。僅使用淺水Ⅰ型網(wǎng)未能充分采集到小型橈足類, 可能會嚴重低估浮游動物的豐度和生物量及其在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的作用(Turner, 2004; Di Mauro et al, 2009)。以往珠江口海域浮游動物的研究主要使用淺水Ⅰ型網(wǎng)采集大中型浮游動物(表5), 高原 等(2008)采用13#浮游生物網(wǎng)與25#浮游生物網(wǎng)組合, 進行了珠江口上游浮游動物的相關(guān)研究。連喜平 等(2013)在南海北部采用網(wǎng)目孔徑為505μm 和160μm 兩種網(wǎng)具進行了浮游動物采樣, 其研究結(jié)果表明, 盡管兩種網(wǎng)具采集的浮游動物種類組成不同, 但浮游動物的群落結(jié)構(gòu)相似。本研究中使用4 種網(wǎng)具采集浮游動物, 其豐度和生物量隨網(wǎng)徑變小顯著增大, 淺水Ⅰ型網(wǎng)采集的浮游動物多樣性指數(shù)顯著高于淺水Ⅱ型和25#浮游生物網(wǎng)采集的浮游動物, 表明僅以淺水Ⅰ型網(wǎng)采集的樣品去分析浮游動物的種類組成和數(shù)量變動, 尤其對于浮游動物群落結(jié)構(gòu)小型化的富營養(yǎng)化水體, 監(jiān)測結(jié)果將嚴重低估浮游動物的豐度和生物量, 可能會影響水生生態(tài)系統(tǒng)的進一步研究。因此, 使用多種網(wǎng)具組合能更真實地反映浮游動物群落結(jié)構(gòu)和粒徑組成。

3.2 浮游動物形態(tài)學(xué)和DNA 分子鑒定種類的比較

浮游動物個體小、種類多, 形態(tài)學(xué)鑒定十分耗時, 其中浮游幼蟲形態(tài)復(fù)雜, 缺乏關(guān)鍵分類學(xué)特征,鑒定困難。浮游動物形態(tài)學(xué)鑒定需要經(jīng)過長期培訓(xùn)。物種分子鑒定能進行更詳細的生物多樣性評估并揭示“隱藏的生物多樣性”(Lindeque et al, 2013; Questel et al, 2021), 深入了解物種的生活史和生態(tài)作用。使用分子標記評估獲得的浮游動物豐富度, 可能比形態(tài)物種豐富度高出一個數(shù)量級(Renz et al, 2021)。

本次三個站點調(diào)查使用淺水Ⅱ型網(wǎng)采集的DNA 樣品識別出31 條浮游動物OTU, 而通過形態(tài)學(xué)鑒定檢測到 18 種浮游動物。其中錐形寬水蚤(T.turbinata)、強額孔雀哲水蚤(P. crassirostris)、近緣大眼劍水蚤(C. affinis)是形態(tài)學(xué)鑒定和網(wǎng)采DNA樣品的共有物種。水體DNA 樣品中鑒定出10 門, 多數(shù)為原生動物, 節(jié)肢動物門檢測出長紡錘水蚤(A.longiremis)和戴維斯長腹劍水蚤(O. davisae), 這兩種橈足類在三個站點鏡檢樣品中均無檢出。通過形態(tài)學(xué)鑒定的優(yōu)勢種為紅紡錘水蚤和小長腹劍水蚤。可能是因為浮游動物自身進化迅速, 同一物種在不同地區(qū)條形碼序列差異較大, 導(dǎo)致公共數(shù)據(jù)庫對DNA 條形碼測序數(shù)據(jù)解釋有限。

分子鑒定方法比形態(tài)學(xué)方法鑒別出更多的類群,可能是由于存在較難鑒定的浮游動物幼體或隱種(Rathnasuriya et al, 2021), 這些物種在形態(tài)學(xué)觀察中很難鑒別; 通過DNA 測序更容易檢測出稀有物種。本研究中發(fā)現(xiàn), 注釋為同一種的浮游動物具有多條OTU 序列, 有可能為隱種。已有研究表明, 浮游動物中隱種多樣性較高(Lindeque et al, 2013)。因此, 完善DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫有助于提高分子鑒定方法的可靠性。此外, 形態(tài)學(xué)鑒定通過識別浮游動物發(fā)育階段和性別, 能夠分析浮游動物種群結(jié)構(gòu),例如本研究鏡檢樣品中的無節(jié)幼體、浮游幼蟲和魚卵; 分子方法不能識別發(fā)育階段和性別, 浮游幼蟲和魚卵等只能注釋為對應(yīng)的種類, 但分子方法能提供更高的時空覆蓋率和分類學(xué)覆蓋面(Pearman et al,2015; Brisbin et al, 2020)。隨著越來越多的研究將形態(tài)學(xué)方法和DNA 分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合, 目前使用的浮游動物分類概念將會得到改進(Coguiec et al,2021; Singh et al, 2021), 并可加強不同地點和不同團隊研究結(jié)果的比較(Schroeder et al, 2020)。

本研究中, 分子測序和形態(tài)學(xué)鑒定之間的差異可能是由多方面原因引起的。首先, 浮游動物分類跨度和分子進化地位相差大, 采用的通用引物很難精準擴增到每一個門類, 且分子鑒定結(jié)果與比對的數(shù)據(jù)庫物種數(shù)量相關(guān)。本研究中, 鏡檢和網(wǎng)采DNA樣品中均無檢測到原生動物, 可能是由于采集的浮游生物網(wǎng)孔徑較大, 導(dǎo)致原生動物流失; 水體DNA樣品中每個站點均檢出原生動物且序列較為豐富。其次, 低豐度浮游動物可能在鏡檢過程中未被觀察到, 而在DNA 樣品中檢測到(Harvey et al, 2017)。第三, 18S rDNA 數(shù)據(jù)庫中的分類信息不完善導(dǎo)致浮游動物種類不一致(Lindeque et al, 2013)。例如, 小長腹劍水蚤和中華異水蚤在SZ07 樣點豐度較高, 但該站位水體DNA 樣品和網(wǎng)采DNA 樣品中均無檢出。第四, 分子測序可能會檢測到稀有種類的死亡細胞或殘體, 導(dǎo)致分子測序結(jié)果與鏡檢結(jié)果的不一致。例如, 每個站點均檢出戴維斯長腹劍水蚤, 但鏡檢未發(fā)現(xiàn)。

水體DNA 測序與使用淺水Ⅱ型網(wǎng)采集的網(wǎng)采DNA 樣品測序的調(diào)查方法各有優(yōu)劣。水體DNA 樣品能檢測出更多的微型浮游動物如原生動物等, 但其相對豐度不能等同于生物量(Elbrecht et al, 2015;Ershova et al, 2021); 網(wǎng)采DNA 樣品能過濾更多的水樣, 有利于采集更多的大中型浮游動物, 更能充分反映優(yōu)勢類群如橈足類的種類和數(shù)量。例如本次調(diào)查中網(wǎng)采DNA 樣品的節(jié)肢動物門相對豐度均高于水體DNA 樣品。