董蘭芳, 許明珠, 劉海娟, 曾夢清, 陳瑞芳, 李世才

廣西海水養(yǎng)殖新品種繁育工程技術(shù)研究中心(廣西海洋研究所有限責(zé)任公司), 廣西 北海 536000

鱟(Limulus)屬節(jié)肢動物門(Archropoda), 肢口綱(Merostomata), 劍尾目(Xiphosura), 鱟科(Limulidae), 是一種生活在海洋中的大型節(jié)肢動物。鱟出現(xiàn)在地質(zhì)歷史時期古生代的泥盆紀(jì), 由三葉蟲演化而來, 是地球上少數(shù)僅存的古老物種, 經(jīng)過漫長的歲月, 保留了原始而古老的形態(tài)特征, 有海中“活化石”之稱。中國鱟(Tachypleus tridentatus)是東方鱟屬中的一種(Sekiguchi, 1988)。世界上95%的中國鱟資源分布在中國, 尤其廣西北部灣是中國鱟最主要的棲息地(李瓊珍, 2010)。由于近二十年的過度捕撈和沿海灘涂開發(fā)破壞, 中國鱟資源急劇減少,已成為國家二級保護(hù)動物。我國有關(guān)部門一直重視中國鱟的研究(洪水根, 2011), 深入開展了包括地理分布(翁朝紅 等, 2012; 顏明艷等, 2019)、資源現(xiàn)狀和價值(李瓊珍 等, 2011; 翁朝紅 等, 2012; 朱俊華 等, 2020)、生活習(xí)性(高鳳英 等, 2003)、人工繁育(鮑虞園 等, 2020; 梁君榮 等, 2001; 王軍 等,2001; 王德祥 等2001; 程鵬 等, 2006)等方面的研究工作。

人工增殖放流是恢復(fù)鱟資源最有效、最迅速的方法(洪水根, 2011), 中國鱟苗種規(guī)?；斯し庇膶崿F(xiàn)為中國鱟資源的保護(hù)和修復(fù)奠定了扎實基礎(chǔ),目前沿海多地開展了中國鱟幼苗大規(guī)模放流活動。然而, 幼鱟在放流海區(qū)多變環(huán)境中的生存和生長狀況沒有經(jīng)過系統(tǒng)研究, 難以保證人工放流的成效和可行性。了解和掌握環(huán)境因子對中國鱟幼鱟生長狀況的影響規(guī)律, 進(jìn)而選擇適宜放流的時間和海區(qū),是保證人工放流得以成功的當(dāng)務(wù)之急。鹽度作為主要的環(huán)境因子, 可對甲殼動物的生理產(chǎn)生廣泛影響,水體鹽度的變化直接影響其生長性能、成活率和繁殖等(陳垂坤 等, 2015)。有關(guān)鹽度對中國鱟影響的研究僅有零星報道, 李鋒 等(1999)研究表明中國鱟人工授精育苗的可行鹽度為16‰～40‰, 適宜鹽度為16‰～33‰; 王德祥 等(2001)研究了授精后中國鱟胚胎和三葉幼體發(fā)育的最適鹽度為20‰; 中國鱟胚后一期幼體的耗氧率和排氨率隨著鹽度的升高,呈先升后降的趨勢, 均在 35‰時達(dá)到峰值(程文,2007)。鹽度對幼鱟蛻殼的影響未見報道。本研究通過研究不同鹽度下中國鱟幼鱟存活、蛻殼、滲透調(diào)節(jié)、免疫指標(biāo)、抗氧化能力等的變化, 探討不同鹽度水平對幼鱟生長和生理的影響, 為中國鱟人工育苗和人工放流提供基礎(chǔ)資料, 同時豐富鱟生理生態(tài)學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用中國鱟一齡幼鱟來源于廣西海洋研究所有限責(zé)任公司竹林海水增養(yǎng)殖基地人工繁育的同一親本所產(chǎn)的同批次苗種, 廣西海洋研究所有限責(zé)任公司為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的珍稀瀕危水生動物(中國鱟)增殖放流苗種供應(yīng)單位。挑選活力較好的健康個體(平均體質(zhì)量30.82±0.79mg)作為試驗對象。不同鹽度水平養(yǎng)殖試驗在規(guī)格為29cm×20cm×15.5cm 的塑料整理箱中進(jìn)行, 試驗用海水為砂濾自然海水,鹽度為29.7‰, 用充分曝氣的自來水和海水晶調(diào)節(jié)試驗組海水鹽度, 水溫維持在29～32℃之間。

1.2 不同鹽度水平中國鱟幼鱟養(yǎng)殖試驗

試驗共設(shè)置8 個鹽度梯度, 分別為5‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰、40‰, 每個梯度設(shè)3 個平行組, 共24 個試驗組, 每個試驗組整理箱內(nèi)放幼鱟150 只。幼鱟在自然海水中暫養(yǎng)7d 后開始鹽度試驗, 將其隨機分組稱重后直接從對照組轉(zhuǎn)移到試驗組。

養(yǎng)殖日常管理: 養(yǎng)殖試驗期間投喂鹵蟲幼體,每天在18:00 進(jìn)行投喂, 投餌前先用吸管吸出殘餌及糞便。每兩天測一次鹽度, 便于調(diào)節(jié)蒸發(fā)引起的鹽度變化, 每周徹底清洗塑料箱并換水, 清洗前先用濾網(wǎng)撈出幼鱟, 用百潔布徹底清理后加入自然砂濾海水, 調(diào)至所需鹽度再放入幼鱟。養(yǎng)殖試驗持續(xù)56d。

1.3 樣品收集與分析

為防止養(yǎng)殖后期有試驗組大部分幼鱟蛻殼為二齡而取不到足夠的一齡幼鱟樣本, 養(yǎng)殖30d 時, 每組隨機撈取一齡幼鱟50 只, 純水沖洗拭干后, -80℃冰箱保存用于一齡幼鱟酶活的測定, 蛻殼率、成活率僅統(tǒng)計剩余的100 只幼鱟。

從有幼鱟蛻殼開始, 每天根據(jù)鱟殼數(shù)量統(tǒng)計蛻殼幼鱟的個數(shù)。養(yǎng)殖56d 后, 養(yǎng)殖試驗結(jié)束, 收集一齡幼鱟和二齡幼鱟, 分別稱重后計數(shù), 統(tǒng)計成活率、蛻殼率及蛻殼增重率, 純水沖洗拭干后, 保存于-80℃冰箱, 用于酶活測定。

蛻殼增重率(molting weight gain rate)計算:

蛻殼增重率(%)= (二齡幼鱟平均體質(zhì)量 - 一齡幼鱟平均體質(zhì)量)/一齡幼鱟平均體質(zhì)量 × 100%

1.4 酶活測定

將冷凍的一齡(測試用的一齡幼鱟為養(yǎng)殖30 天保存的樣本)及二齡幼鱟轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器, 加入預(yù)冷的生理鹽水, 充分勻漿后, 勻漿液用冷凍離心機(Jouan, C3i, 法國)離心10min(4 ℃, 3000r·min-1), 上清液即為待測酶液。

Na+-K+-ATP 酶、溶菌酶(lysozyme, LZM)、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase, CAT) 、 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力以及總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)均采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定。待測酶液蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn), 用考馬斯亮藍(lán)法測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 22.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA), 若差異達(dá)到顯著(P＜0.05),則用Tukey 多重比較各組數(shù)據(jù)之間的差異, 結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=3)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度對幼鱟成活率、蛻殼率、體質(zhì)量和蛻殼增重率的影響

不同鹽度對中國鱟幼鱟的成活率、蛻殼率、體質(zhì)量、蛻殼增重率影響的結(jié)果見表1。不同鹽度對中國鱟幼鱟的成活率、蛻殼率、二齡幼鱟平均體質(zhì)量及蛻殼增重率有顯著影響(P＜0.05), 且均隨鹽度升高呈先升高后降低的趨勢。鹽度20‰試驗組幼鱟的成活率最高達(dá)96.30%, 顯著高于鹽度5‰和10‰試驗組(P＜0.05); 鹽度20‰、25‰、30‰和35‰試驗組的幼鱟蛻殼率顯著高于高鹽和低鹽試驗組(P＜0.05), 25‰試驗組最高, 蛻殼率達(dá)92.08%; 鹽度5‰試驗組的二齡幼鱟均重顯著小于25‰試驗組(P＜0.05); 隨著鹽度的升高, 幼鱟蛻殼增重率先顯著升高(P＜0.05)后顯著降低(P＜0.05), 鹽度20‰和25‰試驗組的幼鱟蛻殼增重率顯著高于鹽度5‰和40‰試驗組(P＜0.05)。二次回歸分析(圖1)表明, 中國鱟幼鱟蛻殼率和鹽度的二次曲線回歸方程為:y=-01438x2+6.9323x+8.3767(R2=0.891), 當(dāng)蛻殼率達(dá)到最大值時, 對應(yīng)的鹽度為24.10‰; 蛻殼增重率和鹽度的二次曲線回歸方程為:y=-0.0616x2+3.072x+31.339(R2=0.7998), 當(dāng)蛻殼增重率達(dá)到最大值時, 對應(yīng)的鹽度為24.94‰。

表1 不同鹽度下中國鱟幼鱟成活率、蛻殼增重率和蛻殼率Tab. 1 Survival rate, molting weight gain rate and molting rate of the juvenile horseshoe crab under different salinity

2.2 不同鹽度對幼鱟Na+-K+-ATP 酶活性的影響

圖2 為不同鹽度下幼鱟Na+-K+-ATP 酶活性的變化趨勢, 結(jié)果表明, 幼鱟Na+-K+-ATP 酶活性均隨鹽度的升高呈先顯著升高(P＜0.05)后顯著降低(P＜0.05)的趨勢, 一齡幼鱟的酶活為鹽度25‰試驗組最高,顯著高于35‰和40‰試驗組(P＜0.05), 二齡幼鱟則是鹽度30‰試驗組最高, 顯著高于鹽度5‰和40‰試驗組(P＜0.05) 。

2.3 不同鹽度對幼鱟免疫酶活性的影響

不同鹽度對幼鱟免疫酶活性影響的結(jié)果見表2。鹽度對一齡幼鱟的ACP 和AKP 活性有顯著影響(P＜0.05), 對LZM 活性沒有顯著影響(P＞0.05); 高鹽度試驗組(35‰和40‰)一齡幼鱟的ACP 活性顯著高于鹽度較低試驗組; 鹽度 5‰試驗組一齡幼鱟的AKP 活性顯著低于其他試驗組(P＜0.05)。鹽度對二齡幼鱟的ACP、AKP 和LZM 活性均沒有顯著影響(P＞0.05)。

表2 不同鹽度對幼鱟免疫酶活性的影響Tab. 2 Effect of salinity on immune enzyme activity of the juvenile horseshoe crab

2.4 不同鹽度對幼鱟抗氧化酶活性的影響

不同鹽度對幼鱟抗氧化酶活性影響的結(jié)果見表3。不同鹽度對一齡幼鱟的CAT 活性有顯著影響(P＜0.05), 對T-AOC、GSH-Px 和SOD 活性沒有顯著影響(P＞0.05), 高鹽度試驗組(35‰和40‰)一齡幼鱟的CAT 活性顯著高于鹽度較低試驗組(P＜0.05)。鹽度對二齡幼鱟的 GSH-Px 活性有顯著影響(P＜0.05), 對T-AOC、CAT 和SOD 活性沒有顯著影響(P＞0.05), 二齡幼鱟的GSH-Px 活性隨著鹽度的升高而升高的趨勢, 鹽度10‰試驗組顯著低于30‰和40‰試驗組(P＜0.05) 。

表3 不同鹽度對幼鱟抗氧化酶活性的影響Tab. 3 Effect of salinity on antioxidant enzyme activity of the juvenile horseshoe crab

3 討論

同其他節(jié)肢動物一樣, 鱟的生長是不連續(xù)的,通過蛻殼來實現(xiàn)。中國鱟生長速度非常慢, 發(fā)育至性成熟一般需要13～15 年的時間(李瓊珍, 2010)。水溫適宜時, 一齡幼鱟從孵化到蛻殼為二齡幼鱟一般需要3～5 個月, 水溫較低情況下一齡幼鱟可以保持1 年以上不蛻殼。剛蛻殼二齡鱟的甲殼非常柔軟, 要恢復(fù)至原來的硬度也需要相當(dāng)長的一段時間。

鹽度是水生生物生長環(huán)境中最重要的環(huán)境因子之一, 許多水生動物都具有一定程度的鹽度適應(yīng)性,且不同物種的最佳存活和生長鹽度范圍不同。研究表明鹽度對不同甲殼動物存活、蛻殼和生長影響的差異較大, 且同一甲殼動物, 不同發(fā)育階段對鹽度的適應(yīng)范圍也有所不同, 如高鹽(45‰)和低鹽(≤15‰)環(huán)境遠(yuǎn)海梭子蟹(Portunus pelagicus)的死亡率均顯著升高, 同時高鹽和低鹽都延長了梭子蟹的蛻殼周期, 降低了蛻殼增重(Romano et al, 2006)。5‰～25‰范圍內(nèi), 斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)蛻殼間期隨鹽度升高而延長, 鹽度30‰以后又縮短, 鹽度25‰試驗組對蝦的蛻殼周期最長, 特定生長率最高(楊其彬等, 2008); 路良允 等(2012)在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的研究中發(fā)現(xiàn), 鹽度30‰組蟹的生長率顯著高于15‰和35‰試驗組, 各組間蛻殼周期差異不顯著, 但30‰組較其他組縮短3.1～4.6d; 青蟹(Scylla serrata)幼蟹在變態(tài)為四期幼蟹之前, 對環(huán)境鹽度有較高要求, 鹽度低于10‰, 將延長變態(tài)周期和降低成活率, 四期以后鹽度適應(yīng)能力明顯增強,適當(dāng)降低鹽度將有助于縮短其蛻殼周期(于忠利 等,2010)。在脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)(龍曉文 等, 2014)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)(申玉春 等, 2012)、南極大磷蝦(Euphausia superba)(趙國慶 等, 2018) 、 日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)(蔣湘 等, 2017)等甲殼動物中也開展了相關(guān)研究, 研究結(jié)果不盡相同, 但大致可分為兩類: (1)不適鹽度刺激甲殼動物加快蛻殼, 蛻殼間期縮短,但生長率并沒有因此而增加; (2)不適鹽度阻礙甲殼動物的蛻殼過程, 蛻殼間期延長, 生長率也隨之下降。環(huán)境鹽度變化時, 動物機體必然要經(jīng)歷滲透調(diào)節(jié)等一系列過程, 這些過程需消耗大量能量, 因而鹽度變化增加了機體的能量消耗(Martínez-álvare et al, 2002)。本研究中, 在5‰～40‰的鹽度范圍內(nèi), 中國鱟幼鱟的成活率、蛻殼增重率及蛻殼率均隨鹽度的升高呈先升高后降低的趨勢, 即高鹽和低鹽等不適環(huán)境引起幼鱟蛻殼率降低、生長率下降, 屬于第(2)類情況, 與遠(yuǎn)海梭子蟹的研究結(jié)果類似。自然條件下幼鱟通常在離繁殖沙灘很近的潮間帶平坦沙灘度過一齡和二齡, 一般棲息在淺水區(qū)蛻皮, 蛻殼率和蛻殼增重率與鹽度的回歸分析均表明, 中國鱟幼鱟蛻殼與生長的最適鹽度在24‰～25‰左右。

甲殼類Na+-K+-ATP 酶活性與水體環(huán)境鹽度密切相關(guān), 鹽度主要通過滲透壓調(diào)節(jié)實現(xiàn)對水產(chǎn)動物生理狀態(tài)的影響, 而Na+-K+-ATP 酶在滲透壓調(diào)節(jié)中起著極其重要的作用(柳旭東 等, 2009)。有研究表明, 水生動物自身滲透壓調(diào)節(jié)基本過程為: 隨著水體環(huán)境鹽度的改變, Na+-K+-ATP 酶活性逐漸升高或逐漸降低, 經(jīng)過一段時間的調(diào)節(jié)與適應(yīng)后逐步趨于穩(wěn)定, 不同物種Na+-K+-ATP 酶活變化趨勢和變化程度截然不同, 存在很大的種間差異(楊宇晴 等, 2010;亓磊 等, 2013; 蔡星媛 等, 2015; 李娜 等, 2017;游出超 等, 2019)。且當(dāng)鹽度范圍超出機體的滲透調(diào)節(jié)能力, 機體將表現(xiàn)為酶活性降低, 抵抗力低下,嚴(yán)重者將導(dǎo)致死亡。本研究鹽度范圍內(nèi), 隨著鹽度升高, 一齡和二齡幼鱟的Na+-K+-ATP 酶活性均呈先顯著升高后顯著降低趨勢。因養(yǎng)殖試驗周期較長,測定的酶活應(yīng)為穩(wěn)定期活性, 說明高鹽和低鹽導(dǎo)致了中國鱟幼鱟Na+-K+-ATP 酶活性降低, 即環(huán)境鹽度變化超過幼鱟的滲透調(diào)節(jié)能力, 這是高鹽組(40‰)和低鹽組(5‰)幼鱟死亡率顯著升高的一個重要原因。

一般認(rèn)為無脊椎動物缺乏特異性免疫性系統(tǒng),而是以各種非特異性免疫因子及酶類為主的體液免疫抵抗病原的入侵, 甲殼動物亦是如此。外界鹽度過高或者過低均會引起機體內(nèi)外滲透壓失衡, 進(jìn)而導(dǎo)致甲殼動物生長速度和非特異免疫能力下降(李志輝 等, 2019)。ACP 和AKP 在甲殼動物的免疫應(yīng)答機制中, 直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移與代謝, 可加速物質(zhì)的攝取與轉(zhuǎn)運, 形成水解酶體系, 破壞和消除侵入機體的異物(吳丹華 等, 2010)。本研究中, 不同鹽度試驗組一齡幼鱟的ACP 和AKP 活性有顯著差異, 35‰和40‰高鹽度試驗組一齡幼鱟的ACP 活性顯著高于鹽度較低試驗組, 而鹽度5‰試驗組一齡幼鱟的AKP 活性顯著低于其他試驗組, 結(jié)果一定程度上反應(yīng)了幼鱟在高鹽和低鹽脅迫環(huán)境下的不適應(yīng), 磷酸酶活性降低可能導(dǎo)致機體對物質(zhì)的吸收和代謝降低, 最終表現(xiàn)為蛻殼率和蛻殼增重率下降。與免疫指標(biāo)類似, 幼鱟體內(nèi)的一些抗氧化指標(biāo)同樣也能反映出其對不同鹽度的適應(yīng)程度, SOD、CAT、GSH-Px 等抗氧化酶對清除氧化脅迫過程中產(chǎn)生的活性氧自由基起著決定性作用, 當(dāng)機體自由基平衡被破壞時, 抗氧化酶活性會相應(yīng)變化來維持機體內(nèi)的氧化平衡。本研究中35‰和40‰高鹽度試驗組一齡幼鱟的CAT 活性顯著高于鹽度較低試驗組, 鹽度10‰試驗組二齡幼鱟的GSH-Px 活性顯著低于30‰和40‰試驗組, 這說明幼鱟在高鹽環(huán)境下的滲透調(diào)節(jié)過程消耗更多的能量來保持機體滲透壓平衡, 新陳代謝較快, 產(chǎn)生的活性氧自由基較多, 因而抗氧化酶活性更高。

4 結(jié)論

鹽度對中國鱟幼鱟生長、蛻殼、Na+-K+-ATP 酶活性、免疫指標(biāo)和抗氧化能力有顯著影響, 幼鱟蛻殼生長最適宜的鹽度在24‰～25‰之間, 鹽度過高或過低都將引起幼鱟滲透調(diào)節(jié)能力、免疫力和抗氧化力顯著降低, 最終表現(xiàn)為生長率和成活率下降。