陶虹錦，張少杰，王炳智，薛麗燕，劉 靜，王剛石

1 解放軍醫(yī)學院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學中心 消化科，國家老年疾病臨床醫(yī)學研究中心，北京 100853；3 中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院 病理科，北京 100021；4 解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學中心 老年醫(yī)學研究所，衰老及相關疾病研究北京市重點實驗室，北京 100853

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是人類最常見的病原菌之一，在全球的自然人群中感染率超過50%[1]。Hp 感染可引起多種胃腸道疾病，1%～2%的Hp 感染者可發(fā)生胃惡性腫瘤[2]。Hp經(jīng)口進入胃內(nèi)后，如何在高酸性環(huán)境下定植生存并進一步損傷胃黏膜而致病，其錯綜復雜的機制遠未闡明。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一類廣泛存在于自然界的結構高度保守的蛋白質(zhì)家族[3]。根據(jù)分子量的大小分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 和小分子熱休克蛋白，其中HSP70在生物細胞中含量最高，在環(huán)境壓力譬如熱應激、缺血、乙醇、細菌和病毒感染下產(chǎn)生，不僅能幫助蛋白折疊、增強細胞耐受，也具有抗凋亡、抗氧化和免疫的作用[4-5]。有研究證明HSP70在人類腫瘤細胞中也有廣泛的表達，以對抗化療藥物并促進腫瘤的發(fā)生[3,6-9]。已知很多細菌感染可以增加宿主HSPs 的表達[10-12]。然而有研究發(fā)現(xiàn)Hp 在感染胃上皮細胞時具有下調(diào)宿主細胞HSPs表達的能力[13]。HSP70 的下調(diào)會進一步加劇Hp感染引起的胃上皮細胞生長停滯并誘導細胞凋亡，無法拮抗Hp 感染誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達，減弱了機體對細菌感染的免疫和耐受能力，有利于Hp 定植與致病[14-15]。研究Hp 感染下調(diào)宿主細胞HSPs 的規(guī)律，闡明其潛在機制，不僅有助于我們深入了解Hp 與宿主胃黏膜上皮細胞之間的互動，為干預Hp 感染提供新的方法，還可以探索抑制HSPs 通路的新路徑，進而為腫瘤治療提供新的策略。筆者通過對人胃黏膜細胞和組織中HSP70 的研究，探討HSP70 蛋白在人胃黏膜細胞和腺體中的表達特征，為今后探索Hp 感染所導致的細菌-宿主間互動以及尋找抗Hp 治療新靶點提供基礎數(shù)據(jù)。

材料與方法

1 主要實驗材料與試劑 幽門螺桿菌標準菌株ATCC 26695 由北京大學第一醫(yī)院提供；人胃黏膜細胞Ges-1 和人胃癌細胞BGC-823 由本實驗室保存。人胃癌組織芯片由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院病理科提供，組織芯片中包含正常胃黏膜組織14 個、Hp 感染的胃黏膜組織3 個以及胃癌組織51 個。彎曲桿菌瓊脂基礎購于美國OXOID 公司，微需氧產(chǎn)氣袋購于法國梅里埃公司，HSP70、GAPDH 抗體購于英國Abcam 公司，細胞培養(yǎng)相關試劑購于北京索萊寶公司，Western-blot 其余相關試劑購于碧云天公司，RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄及qPCR 試劑購于南京諾唯贊公司。

2 實驗分組 1)體外細胞學實驗。對照組：①人胃黏膜細胞Ges-1 正常生長24 h (n=3)；②人胃癌細胞BGC-823 正常生長24 h (n=3)。實驗組：①人胃黏膜細胞Ges-1 與Hp 共培養(yǎng)12 h 組、24 h 組、48 h 組(n=3)；②人胃癌細胞BGC-823 與Hp 共培養(yǎng)12 h 組、24 h 組、48 h 組(n=3)。2)組織病理學實驗。對照組：人正常胃黏膜組織。實驗組：①Hp 感染的胃黏膜組織；②胃癌組織。連續(xù)切片的組織芯片分別進行Hp 和HSP70 的免疫組織化學(IHC)染色。

3 細胞與細菌共培養(yǎng) Hp 培養(yǎng)在37℃、微需氧環(huán)境(5% O2、10% CO2、85% N2)下生長3～4 d。人胃黏膜細胞Ges-1 及胃癌細胞BGC-823 培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2，一般生長2 d。實驗所用細菌和細胞均自復蘇后傳代3 次。收集對數(shù)生長期細胞，用不含抗生素的培養(yǎng)基將細胞重懸，以1×105/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)12 h 使細胞貼壁完成。收集對數(shù)生長期的Hp 菌株，調(diào)整菌液濃度為1 OD600(1×108CFU/mL)，加入200 μL 菌液至細胞6 孔板中，使細菌與細胞培養(yǎng)比例為200∶1，對照組加入等體積培養(yǎng)基。細菌感染時間設定為12 h、24 h 和48 h，每組設置3 個重復孔。

4 Western-blot 檢測HSP70蛋白 表達 Hp 感 染的Ges-1 和BGC-823 細胞按照分組提取總蛋白。采用BCA 法蛋白定量并加熱變性。SDS-PAGE 凝膠電泳，使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF 膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗在4℃孵育過夜，稀釋倍數(shù)Anti-HSP70 (Abcam，ab181606)為1∶3 000，Anti-GAPDH(Abcam，ab8245)為1∶2 000。次日用TBST洗膜15 min×3 次；二抗在常溫下孵育2 h，TBST洗膜10 min×3 次。HRP 化學發(fā)光法顯色。Image J軟件定量各條帶灰度值。

5 RT-PCR和qPCR 檢測HSP70 基因mRNA 表達 Hp 感染的Ges-1 和BGC-823 細胞按照分組提取總RNA，并用瓊脂凝膠電泳和核酸檢測儀測定RNA 完整性、濃度和純度，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為后續(xù)PCR 和qPCR 的擴增模板。PCR 和qPCR 使用的引物由上海生工設計合成，HSP70蛋白的引物序列如下：HSPA1A-F：5’-ACTTTG ACAACAGGCTGGTGAACC-3’；HSPA1A-R：5’-TCGGAACAGGTCGGAGCACAG-3’。以人GAPDH作為內(nèi)參，引物序列如下：GAPDH-F：5’-AGA AGGTGGTGAAGCAGGCGTCG-3 ’ ；GAPDH-R：5’-CCTTGGAGGCCATGTGGGCC-3’。PCR 反應條件如下：HSP70：95℃ 10 min；95℃ 30 s，53℃30s，72℃ 30s，27 個 循 環(huán)；72℃ 5min。GAPDH：95℃ 10min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30 s，27 個循環(huán)；72℃ 5 min。擴增產(chǎn)物用瓊脂凝膠電泳觀察反應終點時PCR 產(chǎn)物量。Image Lable 軟件定量各條帶灰度值。qPCR 反應使用Biorad CFX96 完成，反應條件如下：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)；熔解曲線設置0.5℃/s 緩慢升溫至95℃。

6 免疫組織化學(IHC)染色 將組織芯片常規(guī)脫蠟水化，高壓修復抗原。加內(nèi)源性過氧化物酶阻滯劑，室溫孵育10 min。加適量稀釋好的一抗工作液，37℃孵育3 h。加酶標二抗工作液，室溫孵育20 min。滴加DAB 顯色，清水中終止顯色，蘇木素染液中復染2 min，1%鹽酸乙醇中分化。常規(guī)脫水、透明、封片。染色的觀察用顏色深淺表示表達強度：淺黃色為低度表達，深黃色為中度表達，棕黃色為高度表達。

7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS22.0 軟件進行分析。實驗所測數(shù)據(jù)以±s表示，各組間采用單因素方差分析比較，兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 Hp 感染人胃黏膜細胞和胃癌細胞的HSP70 蛋白表達 Hp ATCC 26695 分別與人胃黏膜細胞Ges-1、胃癌細胞BGC-823共培養(yǎng)12h、24h、48 h 后，分別采集細胞的蛋白樣本。Western-blot結果顯示，同對照組相比，Hp 感染后的Ges-1 細胞和BGC-823 細胞HSP70 蛋白的表達隨感染時間延長逐漸降低，其中Ges-1 細胞在24 h 和48 h 的表達水平同對照組相比顯著下降，而BGC-823 細胞則在48 h 顯著下降(P＜0.05，圖1)。Westernblot 結果也顯示，在無Hp 感染的情況下，胃癌細胞BGC-823 的HSP70 蛋白表達水平高于人胃黏膜細胞Ges-1(圖2)。

圖1 Hp 感染12 h、24 h、48 h 時對胃黏膜細胞(Ges-1)和胃癌細胞(BGC-823)HSP70 蛋白表達的影響(Western-blot，A、C，n=2)及定量分析結果(B、D，n=3，aP＜0.05)Fig.1 Effects of Hp infection on HSP70 protein expression in gastric mucosa cells (GES-1) and gastric cancer cells (BGC-823) at 12 h,24 h and 48 h detected by western-blot (A,C,n=2) and quantitative analysis (B,D,n=3,aP＜0.05)

圖2 胃黏膜細胞(Ges-1)和胃癌細胞(BGC-823) HSP70 蛋白表達的比較A：Western-blot 結果；B：定量分析結果(n=3)Fig.2 Comparison of HSP70 protein expression in gastric mucosa cells (GES-1) and gastric cancer cells (BGC-823)A:Western-blot analysis;B:quantitative analysis (n=3)

2 Hp感染人胃黏膜細胞和胃癌細胞的HSP70 mRNA 表達 RT-PCR 結果顯示，同對照組相比，Hp 感染后的Ges-1 細胞和BGC-823 細胞均出現(xiàn)了HSP70mRNA 表達下降，Ges-1細胞在感染12 h后下調(diào)最為顯著，而BGC-823 細胞在24 h 的表達水平最低(P＜0.05，圖3)，而至48 h 表達均出現(xiàn)回升。qPCR 結果也顯示了相同的HSP70 mRNA變化趨勢(圖4)。

圖3 Hp 感染12 h、24 h、48 h 時對胃黏膜細胞(Ges-1)和胃癌細胞(BGC-823) HSP70 mRNA 表達的影響(A、C：RT-PCR 結果)及定量分析結果(B、D，n=3，aP＜0.05)Fig.3 Effects of Hp infection on HSP70 mRNA expression in gastric mucosa cells (GES-1) and gastric cancer cells (BGC-823) at 12 h,24 h and 48 h detected by RT-PCR (A,C) analysis and quantitative analysis (B,D,n=3,aP＜0.05)

圖4 Hp 感染12 h、24 h、48 h 時對胃黏膜細胞(Ges-1)和胃癌細胞(BGC-823) HSP70 mRNA 表達的影響(qPCR)(n=3,aP＜0.05)Fig.4 Effects of Hp infection on HSP70 mRNA expression in gastric mucosa cells (GES-1) and gastric cancer cells (BGC-823) at 12 h,24 h and 48 h detected by qPCR (n=3,aP＜0.05)

3 Hp 感染的胃黏膜腺體HSP70 蛋白表達 采用人胃組織芯片進行Hp 和HSP70 的IHC 染色，結果發(fā)現(xiàn)Hp 染色的陽性信號位于小凹和黏膜表面，表現(xiàn)為顆粒狀棕黃色信號(圖5A)，觀察同一腺體的HSP70 免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)胃腺上皮細胞的胞質(zhì)和胞核可見均勻的淺黃色-深黃色陽性信號，胞核信號多強于胞質(zhì)(圖5B)。與Hp 陰性的腺體對比(圖6)，Hp 感染的腺體細胞其HSP70 表達強度無明顯變化。在Hp 陰性的正常胃黏膜腺體中，HSP70 蛋白表達在不同類型細胞的表現(xiàn)完全不同：胃泌酸腺體(固有腺)細胞和腺頸部(增殖帶)的HSP70 蛋白表達陽性，其細胞胞質(zhì)與胞核均表現(xiàn)出均勻的淺黃色信號，胞核呈較大的圓形，且能看到核仁；而成熟的胃小凹上皮細胞胞核呈狹長、細小形狀，其HSP70 蛋白表達陰性(圖6)。

圖5 組織芯片的免疫組織化學(IHC)染色，顯示HSP70 蛋白在Hp 感染陽性腺體的表達(400×)A：IHC 染色檢測Hp 感染，胃黏膜表面和小凹內(nèi)呈顆粒狀棕黃色信號，提示Hp 感染陽性；B：與A 為同一胃黏膜組織的連續(xù)切片，相同視野下IHC 染色檢測HSP70 表達，染色結果顯示腺上皮細胞的胞質(zhì)和胞核可見均勻的淺黃色-深黃色陽性信號，胞核信號多強于胞質(zhì)Fig.5 Immunohistochemistry (IHC) staining of tissue chips showed the expression of HSP70 protein in Hp positive glands (400×)A:Hp infection was detected by IHC staining of human gastric mucosa.The staining results showed that the surface and pits of gastric mucosa showed a granular brown-yellow signal,suggesting positive Hp infection;B:continuous sections of the same gastric mucosa tissue as A,HSP70 expression was detected by IHC staining under the same visual field.The staining results showed that there were uniform light yellow to dark yellow positive signals in the cytoplasm and nucleus of glandular epithelial cells,and the nucleus signal was stronger than the cytoplasm

4 胃癌組織的HSP70 蛋白表達 采用IHC 檢測可以觀察到胃癌細胞的HSP70 染色主要表現(xiàn)為胞質(zhì)與胞核的均勻深黃色信號(圖7)，其表達強度明顯高于正常胃黏膜的腺體細胞，不論胃黏膜腺體是否有Hp 感染(圖6)。

圖6 正常胃黏膜腺體，IHC 染色檢測HSP70 表達，染色結果顯示泌酸腺和增殖細胞胞質(zhì)和胞核可見淺黃色-深黃色陽性信號，而胃小凹上皮細胞染色陰性(400×)Fig.6 HSP70 expression was detected by IHC staining of normal gastric mucosa glands.The staining results showed light yellow to dark yellow positive signals in the cytoplasm and nucleus of acid-secreting glands and proliferating cells,while the epithelial cells of gastric fovea were negative (400×)

圖7 人的胃癌組織切片，IHC 染色檢測HSP70 表達，染色結果顯示腺癌細胞的胞質(zhì)和胞核呈深黃色陽性信號(400×)Fig.7 HSP70 expression was detected by IHC staining of human gastric cancer tissue.The staining results showed dark yellow positive signals in the cytoplasm and nucleus of adenocarcinoma cells (400×)

討論

已知Hp 感染可導致胃黏膜炎癥，并通過破壞細胞凋亡和增殖的平衡、減少上皮細胞的遷移、減少胃黏膜內(nèi)的血流量或血管生成來延緩胃黏膜的愈合，HSPs 可以逆轉(zhuǎn)這些限制并促進胃黏膜的愈合[16]。HSP70 在細胞內(nèi)扮演著分子伴侶的角色，在調(diào)節(jié)細胞生長、促進增殖和抗凋亡方面發(fā)揮重要作用[17]。

本研究證實了Hp 可以引起胃癌細胞HSP70蛋白和mRNA 的表達降低，還發(fā)現(xiàn)Hp 感染正常胃黏膜細胞(Ges-1)后同樣可以導致HSP70 蛋白和mRNA 的表達下降。文獻報道，Hp 感染一旦致胃黏膜細胞損傷產(chǎn)生腸化等病變后，該細菌將主動遷移至其他正常胃黏膜細胞定植繼續(xù)生存[18]。我們的結果發(fā)現(xiàn)，感染Hp 后的兩種細胞HSP70蛋白和mRNA 表達僅一過性下調(diào)，這個下調(diào)的時間窗可能有利于細菌的進一步定植。Yeo 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)在Hp 下調(diào)了細胞的HSP70 表達后，使用藥物或?qū)毎麩o損傷的熱休克干預可恢復HSP70的表達水平，進而抑制細胞iNOS 基因表達，減少NO 的產(chǎn)生對胃組織的損傷。根據(jù)這樣的結果，如果能夠在細胞HSP70 蛋白發(fā)生下調(diào)的時間窗內(nèi)給予干預，使HSP70 蛋白表達維持甚至上調(diào)，將可能減少Hp 的定植及其對胃黏膜的損傷。

通過對比HSP70 蛋白與mRNA 下調(diào)的特征，發(fā)現(xiàn)從mRNA 水平的下調(diào)到蛋白質(zhì)水平的下調(diào)，至少需要12h，我們猜測這個時間間隔不僅是基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程所必需，而且與Hp 生長需要較長的倍增時間有關。關于Hp 感染下調(diào)胃癌細胞HSPs 的表達已有一些文獻報道。研究發(fā)現(xiàn)cagA(+/-)的Hp 均能下調(diào)宿主細胞HSP70 的表達，而聯(lián)合外源性cagA 蛋白可得到更顯著的效果[19]。Lang 等[20]指出，與野生株相比，cagA 基因敲除的Hp 并不能下調(diào)HSPs 的表達，然而cagA 基因的表達載體轉(zhuǎn)入細胞后也未能下調(diào)細胞表達HSPs，說明cagA 基因確實參與了宿主細胞HSPs的下調(diào)，但不是決定性的因素。國內(nèi)也有研究報道Hp 陽性的萎縮性胃炎患者的胃黏膜組織HSP70表達略低[21]。目前，Hp 調(diào)節(jié)宿主細胞HSPs 表達的機制遠未闡明，本研究發(fā)現(xiàn)的HSP70 表達動態(tài)改變時間窗現(xiàn)象為進一步研究Hp-宿主互動提供了空間。

研究表明，HSP70 在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達的狀態(tài)，并與腫瘤的分級、轉(zhuǎn)移、化療耐藥和不良預后相關[9,22-23]。因此，尋求抑制HSPs 通路的方法可能會成為治療癌癥的新途徑。本研究也證實了HSP70 蛋白在胃癌組織中高表達。同時我們也發(fā)現(xiàn)，在正常胃黏膜腺體中，HSP70 蛋白表達在不同的胃黏膜腺體、不同生長和分化狀態(tài)的胃黏膜細胞中有明顯差異，表現(xiàn)為胃泌酸腺體(固有腺)細胞和增生活躍的小凹上皮細胞HSP70蛋白表達陽性，成熟的胃小凹上皮細胞或黏液腺上皮細胞表達陰性。目前沒有關于HSP70 蛋白在胃黏膜組織分布規(guī)律的文獻報道。但有研究發(fā)現(xiàn)在人的子宮內(nèi)膜，增殖期的基底腺細胞大量表達HSP70 蛋白，而在功能性細胞中HSP70 不表達，在分泌期基底細胞和功能細胞——腺細胞均顯著表達[24]。也有研究提出小鼠的生殖細胞在減數(shù)分裂時期HSPa2 蛋白表達量最高，在非分裂時期表達降低[25-26]。HSPs 的表達可能有助于增生期細胞對外界不利環(huán)境的耐受。

本研究的局限：1)體外培養(yǎng)并不能完全模擬體內(nèi)的感染環(huán)境；2)與Hp 共培養(yǎng)48h 后的細胞狀態(tài)明顯下降，無法進行更長時間的觀察研究，雖然在mRNA 水平看到了HSP70 表達的回升，但無法檢測到HSP70 蛋白表達回升的時間點，也無法評估Hp 對宿主細胞更長作用周期的動態(tài)影響。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)體外模擬Hp 感染胃黏膜細胞可以使細胞的HSP70 出現(xiàn)一過性表達降低，正常胃黏膜細胞出現(xiàn)表達降低反應的時間略早于胃癌細胞；正常胃黏膜組織中不同類型的腺體細胞具有與感染組織不同的HSP70 蛋白表達特征。這些發(fā)現(xiàn)為將來深入探討Hp 感染的致病機制提供了新的思路。