杜忠蕾，Muhammad Shoaib Tahir，高 源，馬倩倩，朱沁芳，劉 杰，劉美恒，張 歡，張 偉

1 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海西寧 810001；2 高原醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，青海西寧 810001；3 黑龍江省牡丹江市第二人民醫(yī)院，黑龍江牡丹江 157000；4 江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院，江蘇淮安 223300

急進高原后，面對突然的低壓低氧環(huán)境，機體可產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，反應(yīng)的失衡易發(fā)生急性高原病(acute mountain sickness，AMS)[1-2]。高原肺水腫(high altitude pulmonary edema，HAPE)是一種威脅急進高原人群生命健康的重癥AMS。HAPE主要是由于肺動脈血管不均勻收縮導(dǎo)致肺循環(huán)壓力增加而引起的一種非心源性水腫[3-4]，至今HAPE 發(fā)生機制不明確。水通道蛋白(aquaporin，AQP)中AQP1、AQP5 作為肺泡毛細(xì)血管膜上的主要水通道蛋白，為肺泡與毛細(xì)血管之間的水份運輸提供了主要途徑，在肺內(nèi)液體清除中起到了關(guān)鍵作用[5-7]。二者表達(dá)的變化會影響肺泡膜的通透性，在HAPE 的發(fā)病中起著一定的促進作用。國外學(xué)者一直認(rèn)為乙酰唑胺(acetazolamide，AZ)是預(yù)防AMS 的首選藥[8]。但到目前為止，AZ 預(yù)防HAPE 的具體機制尚不清楚，本課題擬通過構(gòu)建HAPE 動物模型，探討AZ 在低氧應(yīng)激下對大鼠肺泡膜通透性的影響。

材料與方法

1 主要材料及儀器 乙酰唑胺粉劑(RS-Sigma，A6011-25G)；HE 染色試劑盒(Solarbio，G1120)；Anti-Aquaporin 1(Abcam，ab65837)；Anti-Aquaporin 5 (Abcam，ab78486)；Rat IL-6 ELISA Set (Bdbiosciences，Cat.No.550319)；2-step plus Poly-HRP Anti Rabbit IgG Detection System (Elabscience E-IR-R215)，實驗動物低壓模擬艙(西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司，型號：HCPⅢD800)，手持式血液分析儀(Flextronics 公司，300-G)，血氣生化多項測試卡片(美國雅培床旁監(jiān)護有限公司，N20319)，酶聯(lián)免疫檢測儀(帝肯上海貿(mào)易有限公司，Infinite M200 PRO)、石蠟切片機(德國萊卡儀器有限公司，LEICA RM2235)、光學(xué)顯微鏡(Olympus 公司)，實時熒光定量PCR 儀(Bio-rad，CFX96)。

2 實驗動物及造模 由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購入健康雄性SD 大鼠(6～8 周齡，體質(zhì)量199.60±8.27 g)，許可證號：SCXK(京)2019-0004。所有大鼠置于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物房通風(fēng)櫥中飼養(yǎng)(室溫20℃～23℃，相對濕度40%～45%，晝夜交替；自由攝取標(biāo)準(zhǔn)維持顆粒飼料和水)。本課題組的前期研究及相關(guān)文獻(xiàn)表明，在模擬海拔7 000 m 缺氧暴露2 d 肺水腫持續(xù)發(fā)展[9-10]。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后按照不同處理方式分為4 組，每組12 只：對照組(CN 組，海拔2 260 m)、低氧組(H7K 組，海拔7 000 m)、乙酰唑胺組(NAZ 組，海拔2 260 m)、低 氧+乙酰唑胺組(HAZ 組，海拔7 000 m)。NAZ 組與CN 組置于西寧海拔2 260 m(大 氣 壓574 mmHg，PO2120.1 mmHg；1 mmHg=0.133 kPa)；NAZ 組、CN 組分別給予1%AZ (50 mg/kg)、0.9%氯化 鈉注射液(45 mg/kg)灌胃(Bid，5 d)。HAZ 組與H7K 組置于模擬海拔7 000 m 的低壓氧艙中2 d(大氣壓305 mmHg，PO263.7 mmHg)；HAZ、H7K 組分別給予1% AZ(50 mg/kg)、0.9%氯化鈉注射液(45 mg/kg)灌胃(Bid，入艙前3 d 和艙內(nèi)2 d)。4 組大鼠均灌胃5 d后取材。

3 動脈血氣測定 每組大鼠12 只造模結(jié)束后，予20%烏拉坦注射液0.7 mL/100 g，腹腔注射，麻醉成功后將動物仰臥固定，打開腹腔，腹主動脈取血0.2 mL 立即測動脈血氣。

4 測定血清中白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)濃度 每組大鼠12 只，抽取腹主動脈血液約8 mL，靜置2 h 后離心(3 000 r/min，10 min)，留取血清，采用ELISA 法檢測血清中IL-6、TNF-α 濃度。

5 測定大鼠的肺組織含水量 采血結(jié)束后，每組取6 只大鼠，打開胸腔，暴露并分離取出肺組織。取少量左肺下葉4%多聚甲醛固定，剩余左肺組織-80℃冰箱凍存后用于其他指標(biāo)檢測。右側(cè)肺葉吸干表面水分后用精密電子天平快速稱量，計為濕重(W)，將右肺組織置80℃恒溫烤箱，干燥72 h 直至恒干重(平均稱重誤差＜0.002 g)后再稱量，計為干重(D)，計算右肺組織濕重與干重質(zhì)量比值(W/D)，表示肺組織水腫情況。

6 測定支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中IL-6、TNF-α 含量 每組剩余6 只大鼠，結(jié)扎左側(cè)支氣管并留存左肺組織(處理同上)。在氣管分叉處插入氣管插管，用預(yù)冷滅菌的0.9%氯化鈉注射液緩慢灌洗右肺，每次2 mL，重復(fù)3 次，回收后混勻，回收率＞60%，離心(1 500 r/min，15 min)取上清，ELISA 法測定BALF中IL-6、TNF-α 濃度。

7 qRT-PCR方法檢測肺組織中AQP1、AQP5 mRNA 的相對含量 從-80℃冰箱中提前取出已凍存的大鼠左肺組織(每組12 只)，并稱量約0.1 g，按Trizol 試劑說明提取肺組織的總RNA 并測得OD 值，根據(jù)PCR 反應(yīng)試劑盒的操作流程逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用CFX96 實時熒光定量PCR 儀進行三步法擴增檢測各組AQP1、AQP5 mRNA 表達(dá)量。實驗所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct法進行相對定量分析。qRTPCR 引物(恒碩生物工程股份有限公司合成)序列5'-3'，AQP1-F：AAGCCATGTTTGGCCACTTCA；AQP1-R：GGCCCTTAGCCATTGTCCAG；AQP5-F：CCATGGTGGTGGAGTTAATCTTGA；AQP5-R：CATGGAACAGCCGGTGAAGTAG；Actin-F：CCTAAGGCCAACCGTGAAAA；Actin-R：CAGA GGCATACAGGGACAACAC。

8 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化 各組肺組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定2 d 后石蠟包埋并切片(厚度為5 μm)，HE 染色、固定，于Olympus 光學(xué)顯微鏡觀察并攝片。

9 免疫組化觀察肺組織中AQP1、AQP5 的表達(dá)左肺組織標(biāo)本經(jīng)固定、石蠟包埋、切片后，脫蠟、水化組織切片并進行抗原熱修復(fù)，用0.lmol/L 的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)稀 釋AQP1(1∶400)和AQP5(1∶200)一抗并孵育后，再按照二步法免疫組化試劑盒的使用步驟進行操作，封片后使用Olympus 光學(xué)顯微鏡觀察，攝片，細(xì)胞膜上出現(xiàn)黃、棕色為陽性細(xì)胞。

10 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計軟件SPSS27.0進行分析，計量資料以±s表示，各組間的數(shù)據(jù)比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。以雙側(cè)α=0.05 為檢驗水準(zhǔn)。

結(jié)果

1 大鼠動脈血氣分析 各組大鼠造模結(jié)束后通過腹主動脈采集動脈血進行血氣分析對比，結(jié)果顯示，與CN 組比較，NAZ 組、H7K 組和HAZ 組的大鼠動脈血pH 值下降(P＜0.05)；H7K 組的大鼠動脈血PaO2明顯降低(P＜0.05)，而HAZ 組PaO2得到改善(P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠動脈血氣分析結(jié)果Tab.1 The arterial blood gas testing results of rats

2 肺組織含水量：W/D 比值的結(jié)果分析 H7K 組右肺W/D 比值高于CN 組(P＜0.05)。與H7K 組比較，HAZ 組的W/D 比值降低(P＜0.05)。見圖1。

圖1 采用濕/干重比測定各實驗組大鼠的肺組織含水量(aP＜0.05，vs CN 組；bP＜0.05，vs NAZ 組；cP＜0.05，vs H7K 組)Fig.1 The lung water content of rats in different experimental groups was measured using the wet/dry weight ratio(aP＜0.05,vs CN group;bP＜0.05,vs NAZ group;cP＜0.05,vs H7K group)

3 ELISA 檢測BALF 及血清中IL-6、TNF-α 含量變化 與CN 組相比較，H7K 組的大鼠血清及BALF 中IL-6、TNF-α 的 含 量均升高(P＜0.05)。HAZ 組IL-6 的含量較H7K 組降低(P＜0.05)。H7K 組與HAZ 組BALF 中TNF-α含量無統(tǒng)計學(xué)差異。見圖2、圖3。

圖2 ELISA 法檢測BALF 中IL-6 和TNF-α 濃度(aP＜0.05，vs CN 組；bP＜0.05，vs NAZ 組；cP＜0.05，vs H7K 組)Fig.2 The concentration of IL-6 and TNF-α in BALF were determined by ELISA (aP＜0.05,vs CN group;bP＜0.05,vs NAZ group;cP＜0.05,vs H7K group)

圖3 ELISA 法檢測血清中IL-6 和TNF-α 的濃度(aP＜0.05，vs CN 組；bP＜0.05，vs NAZ 組；cP＜0.05，vs H7K 組)Fig.3 The concentration of IL-6 and TNF-α in the serum were determined by ELISA (aP＜0.05,vs CN group;bP＜0.05,vs NAZ group;cP＜0.05,vs H7K group)

4 qRT-PCR 檢測肺組織中AQP1、AQP5 mRNA的相對含量 與CN 組相比，H7K 組的肺組織中AQP1、AQP5 mRNA 表達(dá)量明顯增加(P＜0.05)；與H7K 相比，給予乙酰唑胺預(yù)處理的HAZ 組，肺組織中AQP1、AQP5 mRNA 表達(dá)量降低(P＜0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠左肺組織AQP1、AQP5 mRNA 表達(dá)水平(aP＜0.05，vs CN 組；bP＜0.05，vs NAZ 組；cP＜0.05，vs H7K 組)Fig.4 mRNA expression levels of AQP1 and AQP5 in lung tissues(aP＜0.05,vs CN group;bP＜0.05,vs NAZ group;cP＜0.05,vs H7K group)

5 各組肺組織HE 染色的形態(tài)學(xué)觀察 CN 組及NAZ 組肺泡腔清晰，肺泡間隔未增寬、肺泡腔內(nèi)無出血；與CN 組比較，暴露在低氧2 d 的H7K組肺泡上皮細(xì)胞明顯腫脹，肺泡間隔增寬伴有炎細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)水腫；與H7K 組比，HAZ 組肺間質(zhì)水腫和炎細(xì)胞浸潤均有所減輕。如圖5。

圖5 SD 大鼠的肺組織HE 染色圖(40×；紅色箭頭指示肺間隔增寬、內(nèi)皮細(xì)胞腫脹等情況)Fig.5 HE staining of lung tissue sections of SD rats (40×;red arrows indicate widening of lung septa,swelling of endothelial cells,and so on)

6 肺組織中AQP1、AQP5 蛋白表達(dá)免疫組化 檢測出細(xì)胞膜上出現(xiàn)黃、棕色染色為陽性細(xì)胞。光鏡觀察：CN 組的肺組織切片可見部分血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞染色呈黃棕色。H7K 組肺泡膜上的上皮細(xì)胞棕黃色顆粒較CN 組增加。HAZ 組AQP1 和AQP5 陽性表達(dá)低于H7K 組(P＜0.05)(圖6A)。在每組切片中隨機取6 個視野，使用ImageJ 軟件測得IOD 值進行數(shù)據(jù)分析。H7K 組IOD 值高于CN 組、NAZ 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；應(yīng)用乙酰唑胺的HAZ 組IOD 值較H7K 組降低且有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)(圖6B)。

圖6 肺組織中AQP1 和AQP5 的表達(dá)(免疫組化法。aP＜0.05，vs CN 組;bP＜0.05，vs NAZ 組;cP＜0.05，vs H7K 組) A：顯微鏡下觀察(40×)；B：各組AQP1 和AQP5 IOD 數(shù)值Fig.6 Expression levels of AQP1 and AQP5 in lung tissues of rats (immunohistochemical methods.aP＜0.05,vs CN group;bP＜0.05,vs NAZ group;cP＜0.05 vs H7K group) A:microscopic observation (40×);B:AQP1 and AQP5 IOD values in each group

討論

本研究探討了乙酰唑胺對低氧應(yīng)激下SD 大鼠肺泡膜通透性的影響，結(jié)果顯示在模擬海拔7 000 m(305 mmHg，PO263.7 mmHg)的低壓氧艙中持續(xù)2 d 低氧暴露后，SD 大鼠動脈血PaO2下降，肺組織病理切片可見肺間質(zhì)水腫、炎細(xì)胞浸潤，肺組織W/D 升高。通過以上指標(biāo)與組織學(xué)分析，可以判斷H7K 組的肺組織出現(xiàn)了典型的間質(zhì)性肺水腫，肺水含量顯著增加，提示大鼠HAPE模型成功建立。

HAPE 是與高原低氧有關(guān)的致死性高原病，HAPE 的發(fā)生取決于海拔高度的易感性[11]。其主要的病理生理改變是非心源性肺水腫，高原低氧引起肺動脈高壓過度灌注以及局部肺血管不均勻收縮導(dǎo)致血管滲漏[12]。低氧應(yīng)激引起肺泡膜通透性發(fā)生改變，降低了肺泡液體清除率，導(dǎo)致肺泡內(nèi)液體聚積，已經(jīng)被認(rèn)為是HAPE 發(fā)病的病理生理學(xué)機制[13]。大量液體進入肺間質(zhì)，致肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)主動重吸收功能障礙，使肺泡內(nèi)液體過度積聚，最終發(fā)生HAPE[14]。減輕肺水腫是改善高原肺水腫預(yù)后的重要治療靶點，應(yīng)用藥物防治仍是首選[15]。

pH、PaCO2、PaO2和HCO3-是判斷血氧和酸堿平衡的常用指標(biāo)。本實驗通過低壓氧艙模擬急性低氧的大鼠模型，各組大鼠進行動脈血氣對比顯示H7K 組的大鼠動脈血pH、PaO2及HCO3-水平較CN 組降低，缺氧引起肺通氣量增加以維持肺泡PaO2水平，而過度通氣會進一步導(dǎo)致PaCO2急劇下降[16]，與國內(nèi)一些學(xué)者研究結(jié)果一致[17]。有研究認(rèn)為，AZ 作為強效碳酸酐酶抑制劑，通過減少腎小管回收HCO3-，增加腎排泄碳酸氫鹽，引起代謝性酸中毒，進而使肺泡通氣量增加，提高動脈血氧含量[18-19]，并能抑制缺氧導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)及肺血管收縮，降低肺動脈壓[20]。本實驗結(jié)果表明AZ 對模擬海拔7000m 低氧2d 的大鼠PaO2有所改善。

肺含水量是肺水腫嚴(yán)重程度的指標(biāo)。濕干重法與肺水腫輕重程度呈正相關(guān)[21]。本實驗中H7K組的大鼠與CN 組相比，其右肺W/D 比值增高(P＜0.05)。實驗結(jié)果與Lee 等[22]的結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，預(yù)防應(yīng)用AZ 的HAZ 組右肺W/D較H7K 組降低。這說明AZ 可明顯改善肺水腫。

炎癥反應(yīng)在高海拔疾病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用[18,23]。低氧應(yīng)激過程中可誘發(fā)肺組織發(fā)生非細(xì)菌性炎性反應(yīng)、激活肺泡巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，促進IL-6、TNF-α 等炎癥介質(zhì)釋放，造成肺泡膜的損傷并使之通透性增高[24]。本實驗中H7K 組的大鼠BALF 及血清中IL-6、TNF-α水平較CN 組升高，HAZ 組的大鼠BALF 及血清中TNF-α、IL-6 水平較H7K 組降低，說明AZ 在抑制炎癥連鎖反應(yīng)方面有一定效果。

AQP 是位于細(xì)胞膜上的一組選擇性水通道蛋白。相關(guān)研究表明，AQP1 和AQP5 作為肺組織中主要的水通道蛋白，是通過肺毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮進行水份運輸?shù)闹饕緩絒25]。AQP1 主要表達(dá)在肺毛細(xì)血管內(nèi)皮上，AQP5 主要分布于Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞，二者的表達(dá)量變化與肺內(nèi)液體清除能力密切相關(guān)。AQP1、AQP5 的過度表達(dá)可使水快速通過肺毛細(xì)血管內(nèi)皮及肺泡上皮引起肺間質(zhì)水份增多。B?rtsch 等[26]報道炎癥因子可能在細(xì)胞模型中促進AQP 的表達(dá)。水通道蛋白的調(diào)控可能使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的活化增加并在低氧的環(huán)境下表達(dá)上調(diào)。在本實驗中模擬海拔7 000 m 環(huán)境下2 d 大鼠的肺組織中AQP1、AQP5 mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著增加，這與Wang 等[5]的研究一致。AZ 作為一個經(jīng)典藥物，常用于青光眼的治療，通過減少房水的產(chǎn)生而降低眼壓，也有抗炎作用。AZ 與AQP 有著密切的關(guān)系，已經(jīng)證明其通過與AQP1 相互作用，抑制AQP1 的表達(dá)從而減少水滲透[27-28]。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)HAZ 組的肺組織中AQP1 和AQP5 均較H7K 組有所下降。AZ 通過減少肺泡膜AQP1、AQP5 的表達(dá)，影響肺泡上皮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)運和肺水平衡，從而發(fā)揮防治HAPE 的作用。

綜上所述，動物低壓氧艙模擬海拔7 000 m 環(huán)境下2 d 可使SD 大鼠肺泡膜通透性增加，引起肺水腫，同時伴有BALF 及血清中IL-6、TNF-α 含量增加，肺組織中AQP1、AQP5 表達(dá)水平增加。乙酰唑胺預(yù)處理可有效緩解大鼠肺水腫，減輕低氧應(yīng)激下炎癥因子IL-6、TNF-α 的釋放及肺組織中AQP1、AQP5 的表達(dá)，降低低氧應(yīng)激下大鼠肺泡膜通透性。然而，本實驗的樣本量少且存在一定的局限性，未來可能通過靶向調(diào)節(jié)AQP1、AQP5的表達(dá)來深入研究HAPE 的具體分子機制，發(fā)現(xiàn)更有效的防治藥物。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。