張芳芳

（福建省閩東水產(chǎn)研究所，福建 寧德 352100）

弧菌（Vibrio）是一種菌體短小、彎曲成弧形、尾部帶一鞭毛的革蘭氏陰性細(xì)菌，也是一類兼具遺傳多樣性與生態(tài)多樣性的兼性厭氧細(xì)菌，廣泛分布于近岸海域及海洋環(huán)境中，是海水及養(yǎng)殖生物的主要致病菌之一[1]。海洋弧菌可引起海洋經(jīng)濟(jì)動物的大規(guī)模感染和死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如哈維弧菌（V.harveyi）可以引起海水養(yǎng)殖生物，包括琥珀魚、大菱鲆、暗紋東方鲀、斜帶石斑魚、鮑魚、對蝦和大黃魚等的全球性疾病[2]；溶藻弧菌（V.alginolyticus）能夠使大菱鲆、大黃魚、石斑魚等致病，還可引起珊瑚白化病[3]。此外，海洋弧菌還可能對人類的健康產(chǎn)生危害，例如：副溶血弧菌（V.parahemolyticus）可感染貝類、甲殼類、魚類等，人類如果食用腌制或未完全煮熟的帶病菌海鮮，容易引起嚴(yán)重的腸胃炎[4]；人體皮膚損傷后接觸到帶有創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）的海水或者海產(chǎn)品，會發(fā)生感染，病情嚴(yán)重的會導(dǎo)致敗血癥、器官衰竭等[5]。因此，弧菌的快速檢測和監(jiān)控對于海洋養(yǎng)殖和人類健康的安全有著重要的意義。

傳統(tǒng)的弧菌檢測方法主要包括選擇性培養(yǎng)基、生化和血清學(xué)檢測、組織切片觀察法、超薄切片電鏡觀察法[6]。近年來，弧菌的分子生物學(xué)檢測技術(shù)也有較大進(jìn)展，包括分子雜交法、DGGE 法、TGGE 法、RFLP 法[7]、高通量液相芯片法[8]、多重PCR 檢測、微陣列技術(shù)[9]等，然而這些技術(shù)普遍存在成本高、耗時(shí)耗力、依賴專業(yè)人員和專業(yè)檢測設(shè)備等缺點(diǎn)，不適合在養(yǎng)殖場及魚排上推廣。而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是一種新的病原核酸檢測技術(shù)，該技術(shù)憑借高效簡便、靈敏度高、成本低等優(yōu)勢在病原檢測領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，并取得了較好的效果[10]。相關(guān)研究顯示，LAMP 技術(shù)已在副溶血性弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌和溶藻弧菌等的檢測上應(yīng)用[5,11-16]，但現(xiàn)有LAMP 技術(shù)大部分都只針對單一的弧菌檢測，該研究針對上述問題，根據(jù)弧菌屬保守基因序列設(shè)計(jì)引物，并對LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行篩選優(yōu)化，建立了可檢測多種致病性弧菌的LAMP 快速檢測方法。最后利用水樣和不同菌株進(jìn)行方法特異性和靈敏度分析，旨在為弧菌快速檢測及早期診斷提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)使用的菌株包括：哈維氏弧菌（V.harveyi，vha）、副溶血弧菌（V.parahemolyticus，vpa）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus，vvu） 和 溶 藻 弧 菌（V.alginolyticus，val），由福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究院從大黃魚身上分離并保存；維氏氣單胞菌（Vickers aeromonas，vae）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，vhy）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae，aca）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria，aso）、大腸桿菌（Escherichia coli，eco）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，sau）、遲鈍愛德華菌（Retarded Edwards，red）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa，pae），由集美大學(xué)鰻鱺病害防控課題組提供。

主要試驗(yàn)試劑包括：硫酸鎂、鈣黃綠素與甜菜堿[Sigma Aldrich 公司（美國）]，Tris-HCl （pH 值8.8）、KCl、(NH4)2SO4（索萊寶生物科技有限公司），MiniBEST 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、Taq DNA 聚合酶、dNTPs 和DNA Marker DL 2 000 [寶生物工程（大連）有限公司]，Bst DNA 聚合酶、10× Reaction Buffer 和Solution Mix[New EnglandBiolabs 公 司（ 美國）]，胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養(yǎng)基、胰酪大豆胨肉湯（TSB）培養(yǎng)基（廈門琉聯(lián)生物科技有限公司），ALL-DNA-OUT 試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

根據(jù)弧菌屬16S rRNA 高度保守區(qū)域的基因片段，利用Primer Explorer version 4.0 設(shè)計(jì)3 套LAMP 特異性引物，引物由生工生物科技有限公司合成。通過預(yù)試驗(yàn)進(jìn)行比較篩選，最終確定1 套最優(yōu)的LAMP 引物（見表1）。

表1 LAMP 引物序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌DNA提物制備 將菌種從-80 ℃冰箱取出后快速復(fù)溫，接種在TSA 平板上，并將平板倒置于培養(yǎng)箱中30℃過夜培養(yǎng)，從過夜培養(yǎng)的平板中各挑出3 個(gè)單菌落至TSB 培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)12 h，按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA 提取，用分光光度計(jì)檢測DNA 濃度及純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的優(yōu)化 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)使用LAMP 25 μL 反應(yīng)體系，各種成分及其濃度為：內(nèi)引物16s-FIP 和16s-BIP 各1.6 μmol/L、外引物16s-F3 和16s-B3 各0.2 μmol/L、20 mmol/L Tris-HCl （pH值8.8）、10 mmol/L KCl、8 mmol/L MgSO4、10 mmol/L(NH4)2SO4、0.1% Tween-20、0.8 mol/L 甜 菜 堿、1.6 mmol/L dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶及模板2 μL，使用超純水補(bǔ)齊至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?3 ℃、45 min。通過對Mg2+濃度（4、6、8、10 mmol/L）、甜菜堿濃度（0.4、0.6、0.8 、1.0 mol/L）、dNTPs濃度（1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L）和反應(yīng)溫度（61、63、65、67 ℃）4 個(gè)變量參數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以擴(kuò)增條帶的清晰度為考察指標(biāo)優(yōu)化反應(yīng)體系及反應(yīng)程序。

1.2.3 特異性試驗(yàn)根據(jù)優(yōu)化好的LAMP 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序，以vha、vpa、val、vvu、vae、vhy、aca、aso、eco、sau、red 和pae 的DNA 為模板進(jìn)行檢測，以滅菌超純水為陰性對照，同時(shí)向反應(yīng)管中加入1 μL鈣黃綠素，通過顏色變化來判斷是否存在擴(kuò)增，變黃綠色，說明發(fā)生了LAMP 特異性擴(kuò)增，反之則無。同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增，引物為16S-F3 和16S-B3。反應(yīng)體系（25 μL）：Taq DNA 聚合酶0.3 μL，10×PCR Buffe 2.5 μL ，dNTP 2 μL，上下游引物 各0.5 μL，DNA 模板2 μL，用ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃，5 min；變性94℃，30 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，45 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；最后72℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物和常規(guī)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上110 V 電泳分離30 min，并觀察LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物在紫外光照射下的顏色變化，以驗(yàn)證所建方法的特異性。

1.2.4 敏感性試驗(yàn)以vvu 為代表，將提取的DNA模板加入雙蒸水，進(jìn)行10 倍遞進(jìn)稀釋，在相同反應(yīng)條件下對不同濃度DNA 模板進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增和常規(guī)PCR 擴(kuò)增，通過瓊脂糖電泳結(jié)果及顏色變化驗(yàn)證所建方法的最低檢測限。

1.2.5 實(shí)際樣品檢測為了評價(jià)LAMP 檢測方法的有效性，2019 年7 月從寧德蕉城區(qū)泥土澳養(yǎng)殖場采集體表有肉眼可見潰爛的大黃魚6 條，采集其肝臟取約芝麻粒大小，加入到含有50 μL All-DNA-Fast-Out 的0.2 mLPCR 管中，在80℃孵育15 min 后，將上清液直接用做LAMP 檢測的模板進(jìn)行檢測，并對常規(guī)PCR 方法與LAMP 方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，同時(shí)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP 檢測方法優(yōu)化

在不同的Mg2+濃度、dNTP 濃度、甜菜堿濃度及反應(yīng)溫度下擴(kuò)增，分別取5 μL 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1 所示。

由圖1A 可知，隨著Mg2+濃度增加，LAMP 反應(yīng)效率呈降低趨勢，Mg2+濃度為4 mmol/L 時(shí)LAMP產(chǎn)物跑膠時(shí)條帶最亮，與負(fù)對照相比差異最明顯，這說明在LAMP 反應(yīng)體系中Mg2+濃度為4 mmol/L 時(shí)反應(yīng)效率最優(yōu)。相反，反應(yīng)體系中隨著dNTPs 濃度的增加，LAMP 反應(yīng)效率呈上升趨勢（圖1B），dNTPs 濃度為1.8 mmol/L 時(shí)，LAMP 產(chǎn)物跑膠時(shí)條帶最亮，與負(fù)對照相比差異最明顯。因此，選擇dNTPs 濃度為1.8 mmol/L 進(jìn)行LAMP 后續(xù)反應(yīng)。

LAMP 反應(yīng)體系中加入4 種不同濃度甜菜堿均可以得到梯型條帶（圖1C）。但0.4 和0.6 mol/L 條帶亮度差異不大，與負(fù)對照相比差異最明顯，考慮到試驗(yàn)成本，確定加入0.4 mol/L 甜菜堿進(jìn)行LAMP 后續(xù)反應(yīng)。此外，LAMP 反應(yīng)體系中，61、63 和65℃均可以擴(kuò)增出條帶，說明反應(yīng)溫度條件具有比較好的寬容性，其中61 和63℃擴(kuò)增產(chǎn)物亮度比較接近，與負(fù)對照相比差異最明顯，說明在LAMP 反應(yīng)體系中反應(yīng)溫度為61 或63℃時(shí)反應(yīng)的產(chǎn)量相對更高。同樣考慮到試驗(yàn)成本問題，確定最優(yōu)的LAMP 反應(yīng)溫度為61℃。

綜上所述，優(yōu)化后LAMP 反應(yīng)條件為：在25 μL 反應(yīng)體系中內(nèi)引物16S-FIP 和16S-BIP 濃度為1.6 μmol/L、外引物16S-F3 和16S-B3 濃度為0.2 μmol/L，反 應(yīng) 體 系 中 包 含20 mmol/L Tris-HCl（ pH 值8.8），KCl 10 mmol/L，MgSO44 mmol/L，(NH4)2SO410 mmol/L，Tween-20 0.1%，甜菜堿0.4 mol/L，dNTPs 1.8 mmol/L，8U BstDNA 聚合酶及模板2 μL；最終反應(yīng)程序?yàn)?1℃條件下運(yùn)行45 min。

2.2 LAMP 反應(yīng)特異性評價(jià)

使用優(yōu)化后的LAMP 反應(yīng)體系對供試的12 種菌株進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2 所示，僅溶藻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌4 種菌株發(fā)生顯色反應(yīng)。常規(guī)PCR 結(jié)果（圖3）顯示，也只有溶藻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌4 種菌株擴(kuò)增出了條帶，其他8 種常見致病菌及陰性對照樣本均未擴(kuò)增出條帶。這表明優(yōu)化后的LAMP 反應(yīng)體系特異性較好。

圖2 12 種供試菌株的LAMP 檢測結(jié)果

圖3 12 種供試菌株的常規(guī)PCR 檢測結(jié)果

2.3 LAMP 反應(yīng)靈敏度評價(jià)

由圖4 可知，將創(chuàng)傷弧菌提取的DNA 進(jìn)行系列稀釋作為擴(kuò)增反應(yīng)模板，當(dāng)濃度依次為94 ng/μL～ 940 fg/μL 時(shí)，均有發(fā)生顯色反應(yīng)，當(dāng)濃度為94 fg/μL 時(shí)未出現(xiàn)顯色，說明沒有擴(kuò)增。由圖5 可知，常規(guī)PCR法的最低檢測限為94 pg/μL。兩相比較，說明LAMP檢測比常規(guī)PCR 檢測具有更好的靈敏度。

圖4 LAMP 的靈敏性檢測結(jié)果

圖5 常規(guī)PCR 的靈敏性檢測結(jié)果

2.4 LAMP 檢測方法的應(yīng)用

用該研究建立的LAMP 法以及常規(guī)PCR 法對采集的體表有肉眼可見潰爛的大黃魚進(jìn)行檢測，二者結(jié)果相一致，結(jié)果見圖6 和圖7，而且LAMP 反應(yīng)液顯色結(jié)果（圖8）與電泳結(jié)果也是一致的。對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，序列比對結(jié)果顯示，PCR 擴(kuò)增出的目的條帶與Gene Bank 上公布的弧菌屬序列同源率高達(dá)99%以上，表明大黃魚感染了致病弧菌。同時(shí)，也驗(yàn)證了該LAMP 方法可準(zhǔn)確檢測出水產(chǎn)品上的弧菌，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的可行性。

圖6 實(shí)際樣品的常規(guī)PCR 檢測結(jié)果

圖7 實(shí)際樣品的LAMP 檢測電泳結(jié)果

圖8 實(shí)際樣品的LAMP 檢測顯色結(jié)果

3 討 論

相關(guān)研究顯示，海水養(yǎng)殖水生生物在感染弧菌的早期由于無臨床征象，往往難以察覺。然而，一旦感染，溶藻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌等弧菌在合適的外界環(huán)境下便會大量繁殖，當(dāng)魚體中的病原微生物大量積累，導(dǎo)致魚群發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，魚體組織出現(xiàn)明顯潰爛時(shí)，養(yǎng)殖戶們才會發(fā)現(xiàn)，此時(shí)已錯(cuò)過弧菌防治的最佳時(shí)機(jī)[17]。而且，水產(chǎn)養(yǎng)殖中弧菌病暴發(fā)的概率高，感染比例大，已成為阻礙水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素[18]。

該研究針對致病性弧菌基因保守序列中的6 個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了2 對特異性引物（內(nèi)、外引物各一對），利用具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶，通過鏈置換方式進(jìn)行高效擴(kuò)增，建立了一種針對致病性弧菌的快速通用LAMP 檢測方法。由于LAMP 獨(dú)特的核酸擴(kuò)增機(jī)制，反應(yīng)過程在恒溫下即可完成，不再需要像常規(guī)PCR 那樣復(fù)雜的程序（需經(jīng)歷預(yù)變性、變性、退火、延伸等多個(gè)溫度），操作簡便高效且成本低，對儀器要求也不高[19]。此外，LAMP 的產(chǎn)物是由多重復(fù)靶序列的莖-環(huán)狀DNA 和花椰菜狀DNA 所組成的混合物，在瓊脂糖凝膠電泳上會呈現(xiàn)出LAMP 所特有的階梯狀條帶，故可通過跑膠后的條帶判斷反應(yīng)是否進(jìn)行，另外可結(jié)合特定的熒光染料進(jìn)行顯色反應(yīng)，檢測人員可以直接根據(jù)顏色的變化來得出結(jié)果，對場地和人員的操作要求相對較低，在條件相對簡陋的情況下也可以展開工作[20]。目前，LAMP 方法已成功應(yīng)用于多種病毒、真菌、細(xì)菌等病原的分子生物學(xué)檢測和診斷[21-23]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域也得到了有效推廣?；【诤Ｋ秃Ｑ髣游镏袕V泛存在且常年引發(fā)疾病，但大部分LAMP 檢測都僅針對單一弧菌屬細(xì)菌，對致病性弧菌進(jìn)行通用性檢測，可以顯著提高檢測效率，進(jìn)而增強(qiáng)水生生物和海產(chǎn)品的安全性。

反應(yīng)體系中反應(yīng)溫度以及Mg2+、dNTPs 和甜菜堿的濃度都會對LAMP 反應(yīng)產(chǎn)生影響，濃度過高或過低都不利于反應(yīng)的進(jìn)行，甚至?xí)K止反應(yīng)，該研究對各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，保證了方法的可靠性和特異性。整個(gè)LAMP 檢測反應(yīng)時(shí)間為45 min，較之于傳統(tǒng)的檢測方法和其他常規(guī)分子檢測具有極大的優(yōu)越性。優(yōu)化后的LAMP 反應(yīng)體系對溶藻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌4 種弧菌檢測均為陽性，其他菌株則未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，表明該研究的LAMP 引物可以有效對弧菌做出特異性檢測。這是由于LAMP 反應(yīng)需要在4 個(gè)不同序列的引物與模板發(fā)生特異性配對后才能啟動，故其具有高度的特異性。在靈敏度檢測中，當(dāng)創(chuàng)傷弧菌核酸模板濃度為94 ng/μL ～940 fg/μL 時(shí)，每個(gè)濃度均可在紫外光下觀察到藍(lán)綠色且電泳結(jié)果也出現(xiàn)階梯狀條帶，當(dāng)模板濃度降低到94 fg/μL 時(shí)未發(fā)生顯色反應(yīng)，說明該體系檢測的靈敏度為940 fg/μL，而常規(guī)PCR 檢測的靈敏度為94 pg/μL，表明LAMP 檢測下限比常規(guī)PCR 法降低了2 個(gè)數(shù)量級。LAMP 檢測不需要對模板進(jìn)行熱變性處理，節(jié)省了因溫度循環(huán)而消耗的時(shí)間，對儀器依賴性小，肉眼檢測即可得出結(jié)果，更適合于現(xiàn)場的實(shí)地診斷。

綜上所述，該研究開發(fā)了一種靈敏、快速、操作簡便的LAMP 通用檢測方法檢測水生生物中的弧菌，而且可以直觀地觀察反應(yīng)進(jìn)行情況，便于試驗(yàn)室快速分析，也適用于養(yǎng)殖場的現(xiàn)場診斷，為實(shí)現(xiàn)致病性弧菌的早期診斷和現(xiàn)場即時(shí)檢測，從而有效預(yù)防和監(jiān)測因弧菌感染引發(fā)的疾病提供了科學(xué)有效的方法。