郭建軍，曾 靜，袁 林，熊大維

（江西省科學院微生物研究所，江西 南昌 330096）

傳統(tǒng)農(nóng)藥和化肥的過量使用導致很多植物病蟲產(chǎn)生抗藥性，這不僅降低了藥效和肥效，而且可能誘導害蟲產(chǎn)生有毒物質(zhì)從而加大土壤有害物的殘留[1]，嚴重的甚至可能危及人類的生命安全。因此，高效、安全的生防微生物制劑越來越受到植保工作者的青睞。多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是芽孢桿菌科（Bacillaceae）類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的革蘭氏陽性細菌，可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如拮抗蛋白[2]、酶[3]、多肽抗生素[4]、植物生長調(diào)節(jié)劑[5]及絮凝劑[6]等。該類細菌在植物葉際或根際定殖，可有效預防各種植物真菌、細菌和線蟲等病害的發(fā)生，并且能促進植物生長[7]，同時對人或動植物沒有明顯致病性。因此，該類細菌不但可以作為生物農(nóng)藥防治植物細菌性和真菌性土傳病害[4]，還可以作為微生物肥料用于促進植物生長、提高作物產(chǎn)量[5]。目前，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為免做安全鑒定的一級菌種。由多粘類芽孢桿菌等制備的生防微生物制劑以其環(huán)境友好性和對土傳病害的防治安全性[8]，在農(nóng)業(yè)病蟲害防治領(lǐng)域具備廣闊的應用前景。

多粘類芽孢桿菌不僅能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，且可形成抗逆性的芽孢，芽孢是多粘類芽孢桿菌在惡劣環(huán)境中產(chǎn)生的休眠體，因其含水量極低，能經(jīng)受住高溫、紫外線、電離輻射以及化學物質(zhì)滅殺等多種不良環(huán)境，便于運輸和儲藏[9]，是一種理想的生防微生物。目前，芽孢制劑主要有2 種形式，液體制劑和固體制劑。液體制劑存在運輸成本高、貯藏時間短、活菌數(shù)低等問題，而固體制劑在制備過程中存活率很低，導致田間防效不穩(wěn)定，嚴重影響生防微生物制劑的推廣和應用[10]。制劑中有效活菌數(shù)含量和貨架周期是影響制劑應用效果的關(guān)鍵因素[11]?，F(xiàn)有的微生物菌劑產(chǎn)品普遍存在活菌含量低、效價不高等問題[9]，芽孢含量決定了微生物菌劑的產(chǎn)品質(zhì)量，提高芽孢產(chǎn)量是工業(yè)生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)之一。因此，發(fā)酵液中芽孢含量成為評價芽孢桿菌發(fā)酵效果的重要指標[12]。從不同生境中篩選分離的芽孢桿菌菌株對發(fā)酵液營養(yǎng)及生長條件的要求也不同[13]，學者們常通過單因素試驗、正交試驗和響應面分析等方法優(yōu)化芽孢桿菌的發(fā)酵工藝，以提高芽孢產(chǎn)量[14-15]。該研究以多粘類芽孢桿菌LY1 為研究對象，以芽孢含量為考察指標，擬通過單因素試驗、Plackett-Burman 試驗設(shè)計、爬坡試驗、中心組合設(shè)計試驗對LY1 菌株培養(yǎng)基配方中的碳源、氮源、無機鹽進行篩選，對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，旨在有效提高多粘類芽孢桿菌的芽孢數(shù)，增加產(chǎn)品活性，降低生產(chǎn)成本，為高質(zhì)量生防菌劑的開發(fā)以及該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）LY1 分離自臍橙根際土壤，保藏于江西省生物化工工程技術(shù)研究中心微生物制劑團隊。

1.1.2 培養(yǎng)基（1）基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基：采用改良的YPD 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基，配方為葡萄糖20 g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母膏 5 g/L、氯化鈉 5 g/L；（2）計數(shù)培養(yǎng)基：固體YPD 培養(yǎng)基，即在上述改良的YPD 培養(yǎng)基中添加15 g/L 的瓊脂粉；（3）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH值自然，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與活菌計數(shù)將保存于-80℃的LY1菌種在固體YPD 培養(yǎng)基平板上劃線，28℃培養(yǎng)24 h；挑取單菌落轉(zhuǎn)接種于YPD 培養(yǎng)基，28℃、160 r/min搖床培養(yǎng)20 h，得到種子液；按2%（V/V，下同）接種量接入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中至30%芽孢脫落分離。采用稀釋涂布平板計數(shù)法測定活菌總數(shù)；芽孢計數(shù)時，先將培養(yǎng)好的發(fā)酵液在85℃水浴15 min，以除掉菌液中的營養(yǎng)體，稀釋后采用平板計數(shù)；芽孢率（%）=芽孢數(shù)/活菌數(shù)×100。

1.2.2 單因素試驗將活化的多粘類芽孢桿菌LY1按2%的接種量接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為40%（100 mL/250 mL），在30℃、150 r/min 條件下，依次考察培養(yǎng)溫度（25、28、32、35、37℃）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、初始pH 值（5、6、7、8、9）、裝液量（10%、20%、30%、40%、50%）、搖床轉(zhuǎn)速（100、150、200、250、300 r/min）對多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)孢的影響，采用活菌計數(shù)法測定多粘類芽孢桿菌的活菌數(shù)。在培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上以芽孢含量為指標，通過改變碳源、氮源、無機鹽種類篩選最佳培養(yǎng)基。選擇6 種碳源（葡萄糖、蔗糖、糖蜜、麥芽糊精、玉米粉、淀粉）、6 種氮源（酵母粉、蛋白胨、豆餅粉、黃豆粉、硫酸銨、尿素）、7 種無機鹽（硝酸鉀、磷酸二氫鉀、檸檬酸鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、硫酸錳、碳酸鈣），分別替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的同類組分，根據(jù)菌株LY1 發(fā)酵液中芽孢含量考察各組分對多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)孢的影響。

1.2.3 響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)工藝基于單因素篩選的碳源、氮源以及無機鹽的試驗結(jié)果，利用響應面分析軟件，以培養(yǎng)后發(fā)酵液中芽孢數(shù)為響應值進行條件優(yōu)化，從而獲得最優(yōu)培養(yǎng)工藝，并對配方進行驗證試驗。（1）Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計。基于單因素篩選的碳源、氮源以及培養(yǎng)條件的試驗結(jié)果，通過PB 試驗進行下一步優(yōu)化。選擇9 個因素：A，糖蜜10～15 g/L；B，黃豆粉10～15 g/L；C，磷酸二氫鉀 5～7 g/L；D，硫酸錳 1～2 g/L；E，培養(yǎng)溫度32～35℃；F，接種量4%～6%；G，初始pH 值7～8；H，裝液量30%～40%；J，轉(zhuǎn)速200～250 r/min；從中篩選關(guān)鍵因子。試驗設(shè)計1 個冗余變量，每個因素取2 個水平，即范圍區(qū)間最大值為高水平“1”和范圍區(qū)間中最小值為低水平“-1”，每組試驗重復3 次，結(jié)果取平均值，考察試驗因素的影響主次。（2）最低添加量試驗?？紤]到后期投入生產(chǎn)的成本效益最大化，挑選出影響不顯著的因素，研究其最低添加量。（3）最陡爬坡試驗設(shè)計。從PB 試驗設(shè)計中挑選出顯著性因素進行最陡爬坡試驗，根據(jù)因素正負效應的大小設(shè)定變化步長與方向，以進一步優(yōu)化試驗區(qū)域。（4）中心組合設(shè)計試驗。非關(guān)鍵因子以PB 試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，關(guān)鍵因子以最陡爬坡試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，運用Box-Behnken 的中心組合設(shè)計原理，設(shè)計了3 因素5 水平共20 個試驗處理進行響應面試驗分析，按試驗所得數(shù)據(jù)進行方差分析，并擬合多元回歸方程，預測發(fā)酵芽孢數(shù)最大值所對應的關(guān)鍵因子范圍。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 軟件進行單因素試驗數(shù)據(jù)分析和繪圖；PB 試驗、最陡爬坡試驗、中心組合試驗均運用Design Expert 8.0.6 軟件進行設(shè)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多粘類芽孢桿菌LY1 培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗結(jié)果

由圖1 可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌體活菌數(shù)和芽孢數(shù)呈先升高后降低的趨勢，在培養(yǎng)溫度為32℃時活菌數(shù)和芽孢數(shù)均達最大值；當接種量逐漸增加時，活菌數(shù)并無明顯變化，但芽孢轉(zhuǎn)化率呈先升高后降低的趨勢，在接種量為4%時芽孢數(shù)最多；隨著初始pH值的升高，活菌數(shù)和芽孢數(shù)均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，當初始pH 值為8.0 時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)均達最大值；裝液量為20%時菌體生長最好，當裝液量超過20%時，活菌數(shù)顯著降低，但芽孢數(shù)卻顯著增加，在裝液量為40%時，芽孢數(shù)最多，表明40%的裝液量有利于芽孢的形成；隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌株LY1 的活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率均逐漸升高，當搖床轉(zhuǎn)速超過250 r/min 時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)均呈下降趨勢，可能是轉(zhuǎn)速較高時菌體發(fā)生了細胞自溶現(xiàn)象。因此，選取培養(yǎng)溫度32℃、接種量4%、初始pH 值8.0、裝液量30%（75 mL/250 mL）、搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min 作為菌株LY1 后續(xù)試驗的液體發(fā)酵條件。

圖1 不同培養(yǎng)條件下菌株LY1 發(fā)酵液中的活菌數(shù)和芽孢數(shù)

2.2 多粘類芽孢桿菌LY1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化的單因素試驗結(jié)果

由圖2 可知，菌株LY1 利用有機緩效碳源（糖蜜或玉米粉）發(fā)酵后芽孢率均顯著的高于速效碳源（蔗糖或葡萄糖）（P＜0.01），以糖蜜為碳源時芽孢數(shù)最多；添加無機氮源的培養(yǎng)基中活菌數(shù)和芽孢數(shù)顯著低于添加有機氮源的培養(yǎng)基，以黃豆粉為氮源時，芽孢數(shù)較多、芽孢率較高；培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀時，活菌數(shù)和芽孢數(shù)均達最大值；另外，培養(yǎng)基中添加Mn2+有利于芽孢穩(wěn)定形成。綜合分析單因素試驗結(jié)果，選擇糖蜜、黃豆粉、磷酸二氫鉀、硫酸錳為發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行后續(xù)試驗進一步優(yōu)化。

圖2 不同培養(yǎng)基成分下菌株LY1 發(fā)酵液中的活菌數(shù)和芽孢數(shù)

2.3 多粘類芽孢桿菌LY1 發(fā)酵的PB 試驗結(jié)果

通過對單因素試驗結(jié)果的分析，確定了PB 試驗的因素，按 PB 試驗設(shè)計，把每個因素設(shè)計成“-1”和“1”2 個水平，以多粘類芽孢桿菌發(fā)酵液中的芽孢數(shù)為響應值，確定各因素對發(fā)酵產(chǎn)孢的影響，從中篩選出有顯著影響的因素進行下一步優(yōu)化。按照Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計PB 試驗（表1），共16 組處理，每組3 個平行。

由表 1 和表 2 可知，糖蜜、黃豆粉、磷酸二氫鉀、初始pH 值和搖床轉(zhuǎn)速為正效應，硫酸錳、培養(yǎng)溫度、接種量和裝液量為負效應；回歸模型的P值=0.012 5＜0.05，相關(guān)性顯著，糖蜜、黃豆粉和搖床轉(zhuǎn)速對多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)孢影響極顯著（P＜0.01），而其他因素對多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)孢影響不顯著（P＞0.05）。

表1 PB 試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4 多粘類芽孢桿菌LY1 發(fā)酵的最陡爬坡試驗結(jié)果

以重要影響因子糖蜜、黃豆粉和搖床轉(zhuǎn)速的試驗值變化梯度方向為爬坡方向，根據(jù)各因素響應值大小確定變化步長，在32℃、初始pH 值8.0、裝液量30%、接種量4%的條件下培養(yǎng)，最陡爬坡試驗結(jié)果見表3。從表3 可以看出，隨著重要影響因子濃度的增加，發(fā)酵液芽孢數(shù)的變化趨勢為先上升后下降，4號試驗發(fā)酵液中芽孢數(shù)最多，達 5.079×109CFU/mL。故采用糖蜜17.5 g/L、黃豆粉17.5 g/L、搖床轉(zhuǎn)速260 r/min 進行后續(xù)工藝優(yōu)化試驗，其他條件為磷酸二氫鉀7.0 g/L、硫酸錳1.0 g/L、培養(yǎng)溫度32℃、接種量4%、初始pH 值8.0、裝液量30%。

表3 最陡爬坡試驗梯度設(shè)計及結(jié)果

2.5 多粘類芽孢桿菌LY1 發(fā)酵的中心組合試驗結(jié)果

最陡爬坡試驗確定了重要影響因子的取值區(qū)間，以糖蜜、黃豆粉和搖床轉(zhuǎn)速為自變量，分別用 X1、X2、X3表示，以多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)（Y）為響應值進行3 因素5 水平的中心組合設(shè)計試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，回歸模型方差分析結(jié)果見表5。

表4 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果

由表5 可知，模型的P值＜0.01，表明模型對響應值Y 影響極顯著，且模型失擬項的P值為0.298 4（P＞0.05），影響不顯著；模型的決定系數(shù)R2=0.979 8，表明預測僅有2.02%的變異情況不能由該模型解釋，說明建立的模型可以較好地反映不同條件下多粘類芽孢桿菌LY1 的產(chǎn)孢數(shù)變化情況，可以用回歸方程對多粘類芽孢桿菌產(chǎn)孢情況進行分析和預測。

表5 中心組合設(shè)計試驗結(jié)果的方差分析

利用 Design Expert 8.0.6 對回歸模型進行分析，得到糖蜜、黃豆粉、搖床轉(zhuǎn)速3 者之間的響應面圖，由圖3 可以看出，X1X2、X1X3等高線呈橢圓形，交互作用顯著，X2X3等高線近似圓形，交互作用不顯著，X1、X2、X3之間的交互作用響應面存在最高點，說明各因素間交互作用明顯，與方差分析結(jié)果一致。

圖3 不同因素間交互作用對芽孢含量影響的等高線和響應曲面

利用Design-Expert8.0.6.1 軟件對表5 的試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，得到以下回歸方程預測模型：Y=7.744+0.657X1-0.607X2+0.006X3+0.197X1X2+0.118X1X3+0.027X2X3-0.328X12-0.262X22-0.748X32。

由模型和軟件分析得到最適多粘類芽孢桿菌LY1發(fā)酵產(chǎn)孢的糖蜜、黃豆粉、搖床轉(zhuǎn)速對應的參數(shù)分別為19.37 g/L、15.31 g/L、261 r/min，此條件下產(chǎn)孢數(shù)預測值為6.817×109CFU/mL。為了證實上述優(yōu)化條件的準確性，在此優(yōu)化條件下進行3 次重復試驗，實際產(chǎn)芽孢數(shù)為6.825×109CFU/mL，實測值與回歸方程預測值結(jié)果相近，說明該研究所建立的數(shù)學模型可靠。

3 結(jié)論與討論

受發(fā)酵期間菌體數(shù)量、發(fā)酵后干燥期間菌體活性以及貯存期間菌體穩(wěn)定性等因素的影響，現(xiàn)有生防微生物制劑產(chǎn)品普遍存在活菌含量低、效價不高的問題[16]，已成為制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素。多粘類芽孢桿菌的芽孢具有極強的抗逆性，可耐受嚴苛的生存環(huán)境，是制備生防微生態(tài)制劑的理想形式，但芽孢的形成受諸多因素的影響，例如培養(yǎng)基成分、發(fā)酵培養(yǎng)條件以及復雜的代謝調(diào)理機制等[1,17-18]。該研究在搖瓶發(fā)酵條件下優(yōu)化了多粘類芽孢桿菌LY1 發(fā)酵產(chǎn)芽孢的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以芽孢數(shù)為評價指標，經(jīng)過單因素試驗、PB 試驗設(shè)計、最陡爬坡試驗、中心組合設(shè)計試驗及響應面分析，確定了多粘類芽孢桿菌LY1 的最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基配方為糖蜜19.37 g/L、黃豆粉15.31 g/L、磷酸二氫鉀7.0 g/L、硫酸錳1.0 g/L；在初始pH 值8.0、裝液量30%、培養(yǎng)溫度32℃、接種量4%、轉(zhuǎn)速261 r/min 的條件下培養(yǎng)發(fā)酵，芽孢數(shù)量達到6.825×109CFU/mL，這一結(jié)果同前期優(yōu)化的試驗結(jié)果相近，說明該研究結(jié)果具有一定的穩(wěn)定性及可重復性，為進一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝提供了必要的數(shù)據(jù)支撐。

芽孢是當菌體遇到惡劣生存環(huán)境才會形成的一種休眠體，用以抵御嚴苛的生存環(huán)境，其本身不是細菌生活史中不可缺少的部分[17-19]。因此，除與菌種本身特性和培養(yǎng)基所含碳氮源、金屬離子及配比有關(guān)外，培養(yǎng)條件如溫度、溶氧量、pH 值等都有可能成為限制多粘類芽孢桿菌產(chǎn)孢的因素。試驗中，通過對多粘類芽孢桿菌LY1 菌株最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的研究，以發(fā)酵液中芽孢數(shù)和芽孢轉(zhuǎn)化率為指標，在獲得較多菌體的同時提高了其芽孢量和芽孢轉(zhuǎn)化率，相比王波等[8]的研究結(jié)果，芽孢數(shù)量提高了一個數(shù)量級，得到兼顧芽孢數(shù)量和芽孢轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)孢培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，解決了以芽孢桿菌為主的生防微生物菌劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中存在的效價低問題。該試驗雖然得到了多粘類芽孢桿菌高密度培養(yǎng)條件和產(chǎn)孢培養(yǎng)基，但后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)以及產(chǎn)業(yè)化應用還需要進一步研究。