姜錦林,呂建偉,曹少華,劉仁彬,石佳奇,龍 濤,單正軍

溴氰菊酯對稀有鮈鯽早期生命階段發(fā)育和內(nèi)分泌干擾毒性

姜錦林*,呂建偉,曹少華,劉仁彬,石佳奇,龍 濤,單正軍

(生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所,國家環(huán)境保護(hù)土壤環(huán)境管理與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210042)

采用半靜態(tài)水體暴露方式研究了水中溴氰菊酯對稀有鮈鯽早期生命階段的發(fā)育毒性與內(nèi)分泌干擾效應(yīng).結(jié)果表明,影響稀有鮈鯽胚胎孵化的LOEC(最低可觀察效應(yīng)濃度)>3.0μg/L;影響稀有鮈鯽仔魚發(fā)育畸形和死亡指標(biāo)的LOEC和NOEC(無可觀察效應(yīng)濃度)分別為1.0和0.33μg/L.低至0.04μg/L的溴氰菊酯暴露便可顯著下調(diào)稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)雄激素受體基因(AR)表達(dá)量并上調(diào)甲狀腺激素受體基因(TRβ)表達(dá)量;0.11μg/L的溴氰菊酯暴露可以下調(diào)稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)雄激素受體基因(AR)、雌激素受體基因(ER1、ER2b)和芳香烴受體基因(AhR1a)的表達(dá)量,并上調(diào)甲狀腺激素受體基因(TRβ)表達(dá)量;0.33μg/L的溴氰菊酯可以下調(diào)稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)雄激素受體基因(AR)、雌激素受體基因(ER1、ER2b)、芳香烴受體基因(AhR1a、AhR1b、AhR2)的表達(dá)量,并誘導(dǎo)甲狀腺激素受體基因(TRβ)表達(dá)量的上調(diào).上述作用濃度水平已經(jīng)處于多個(gè)天然水體中溴氰菊酯的檢出濃度范圍,因此,關(guān)于水體殘留溴氰菊酯對魚類的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)必須予以重視.

溴氰菊酯；稀有鮈鯽；早期生命階段；發(fā)育毒性；內(nèi)分泌干擾

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一種高效殺蟲劑,在全球范圍內(nèi)使用歷史較長,由于其疏水性較強(qiáng),易富集在水生生物體內(nèi),且對水生生物的毒性較大,故對水生生態(tài)系統(tǒng)存在一定風(fēng)險(xiǎn).溴氰菊酯是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中對蟲類毒力最高的一種,在我國較為常見,被廣泛用于農(nóng)林漁業(yè)病蟲害防治.鑒于其健康風(fēng)險(xiǎn),溴氰菊酯被美國環(huán)保局確定為首要控制使用的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥之一[1],近期研究也發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯及其代謝產(chǎn)物在人體尿液及母乳中廣泛存在,流行病學(xué)研究結(jié)果顯示,體內(nèi)溴氰菊酯可能和小兒智力發(fā)育障礙,小兒孤僻癥相關(guān),這可能和哺乳動物早期發(fā)育的神經(jīng)元對溴氰菊酯暴露具有高度敏感性有關(guān)[2].一般來說,擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在哺乳動物和高等脊椎動物體內(nèi)的代謝較快,可快速被清除,但在水生生物體內(nèi)的代謝和排泄能力較低,毒性較高.作為最早使用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的國家,美國很早就開始關(guān)注擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對水生態(tài)環(huán)境帶來的影響[3].

由于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用,近年來世界上越來越多的水體環(huán)境中檢測到擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的存在[4–10].由于此類農(nóng)藥在我國的使用量較大,水環(huán)境中殘存的農(nóng)藥可能會對水生生物造成有害影響.急性研究表明,大部分?jǐn)M除蟲菊酯類類農(nóng)藥對枝腳類等浮游生物、蝦類和魚類的毒性等級處于高毒,且總體上,對前兩者(枝腳類和蝦類)的毒性高于后者(魚類).如溴氰菊酯對多刺裸腹溞的24h- LC50為0.133μg/L[11];溴氰菊酯和氰戊菊酯對凡納對蝦的24h-LC50分別為0.20和0.17μg/L[12].而溴氰菊酯對花鰻鱺和黔東南田魚(鯉)的96h-LC50分別為7.67[13]和5.38μg/L[14],聯(lián)苯菊酯對真鯛的24h-LC50為2.5μg/L[15].以上研究表明擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)不可忽視.目前針對菊酯類農(nóng)藥對水生生物的致毒機(jī)理和毒性效應(yīng)特征研究相對較少,研究表明溴氰菊酯在48h內(nèi)可通過氧化損傷途徑對克氏原螯蝦機(jī)體產(chǎn)生毒性作用[16];另有研究表明溴氰菊酯對中華絨螯蟹免疫系統(tǒng)有顯著影響[17],且對中華絨螯蟹血細(xì)胞有較強(qiáng)的DNA損傷作用[18].此外,諸多研究揭示溴氰菊酯處理對水生魚類具有神經(jīng)、心血管和生殖毒性,且對魚類的運(yùn)動有負(fù)面影響[19].

稀有鮈鯽()是一種中國特有的淡水魚類,主要生活于支流的溝渠等小水體中,分布于中國四川省漢源縣等地,具有性周期短、易于飼養(yǎng)、對化學(xué)物質(zhì)敏感等優(yōu)點(diǎn),是進(jìn)行化學(xué)品毒性測試和環(huán)境水樣毒性實(shí)驗(yàn)的理想材料[20,21].本研究選擇稀有鮈鯽作為供試生物,研究溴氰菊酯暴露對稀有鮈鯽早期生命階段的發(fā)育毒性和內(nèi)分泌相關(guān)核受體基因表達(dá)干擾效應(yīng),以期為豐富溴氰菊酯的水生生物毒性效應(yīng)特征和毒性機(jī)制研究,及其更完善的水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器:繁殖盒(北京愛生科技發(fā)展有限公司);1L玻璃魚缸(配蓋,三合祖平玻璃儀器廠);人工氣候箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);體視顯微鏡(Leica,S8APO);手持式組織勻漿機(jī);離心機(jī)(Sigma 2-16PK);核酸蛋白質(zhì)測定儀(Beckman-DU800); PCR儀(Bio-Rad DNAEngine);熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96TMReal-Time System).

試劑:98.2%溴氰菊酯原藥,購自江蘇農(nóng)博生物科技有限公司;二甲基亞砜(DMSO),購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;RNA提取試劑盒RNAprep Pure Micro Kit(TIANGEN,Beijing,China);反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR PT Kit(TOYOBO,Tokyo,Japan);實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme,Q711-02).

1.2 受試材料

供試魚種為稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus),品種為封閉群IHB.種魚購自中國科學(xué)院水生生物研究所,引入批號為稀有鮈鯽20180728,從該批次的養(yǎng)殖群體中選擇健康、體表無損傷、體質(zhì)健壯的成魚為親魚,飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中14d,溫度(25±2)°C,每天14h光照,溶解氧大于空氣飽和濃度的60%,每日定時(shí)投喂豐年蟲2次(08:00、16:00).

將雌雄親魚以1:1比例配對,每日觀察雌雄魚的行為,當(dāng)觀察到雄魚追逐雌魚時(shí),將雌雄魚撈出,人工受精方式獲取受精卵.試驗(yàn)開始前在顯微鏡下隨機(jī)抽樣觀察,確認(rèn)本批受精卵處于單細(xì)胞期.

試驗(yàn)用水為曝氣處理24h以上的除氯自來水,水溫為(25±1)°C,pH值控制在6.5～7.5,光/暗比為14h/10h,溶解氧360%,水質(zhì)硬度為145.0mg/L(以CaCO3計(jì)).

1.3 暴露實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)藥液配制 準(zhǔn)確稱取0.0509g 98.2%溴氰菊酯原藥,加10.0mL DMSO,用試驗(yàn)用水溶解并定容至500mL,得到濃度為100.0mg/L溴氰菊酯貯備溶液.使用時(shí)將貯備溶液分別稀釋為1.0mg/L和100.0μg/L的稀釋溶液,再進(jìn)一步稀釋為各暴露組溶液.吸取100.0μL DMSO,用試驗(yàn)用水稀釋定容至1.0L,得到濃度為0.1mL/L的溶劑對照組.受試物溶液每隔72h更新一次,受試物溶液體積1L.

1.3.2 魚類早期生命階段毒性試驗(yàn) 根據(jù)稀有鮈鯽幼魚(受精卵孵出后1月齡)急性毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,將早期生命階段毒性試驗(yàn)試驗(yàn)處理組濃度分別設(shè)置為0.04,0.11,0.33,1.0,3.0μg/L,同時(shí)設(shè)置不含受試物的空白對照組和一組二甲基亞砜(DMSO)溶劑對照組.受試溶液穩(wěn)定性測試結(jié)果表明,在半靜態(tài)試驗(yàn)條件(換水頻率為72h)下,試驗(yàn)過程中受試物濃度的變化小于初始測試濃度的±20%,符合半靜態(tài)試驗(yàn)質(zhì)控要求,因此試驗(yàn)采用半靜態(tài)試驗(yàn)法.

試驗(yàn)期間,受試溶液體積為1L,容器內(nèi)溶液的負(fù)荷率不超過5g/L.每一濃度處理組和對照組90粒卵,分為3個(gè)平行.魚卵受精后開始試驗(yàn),在胚盤開始分裂前將胚胎浸在試驗(yàn)溶液中.試驗(yàn)期限:孵育期3d,孵出后28d,共計(jì)31d.光暗比為14h:10h,溫度24.2～ 25.8°C,溶解氧81.8%～96.8%.親魚飼喂豐年蝦,剛出生仔魚飼喂草履蟲,幼魚飼喂孵出48h的鹵蟲幼體.第一次仔魚飼喂在產(chǎn)卵后第6d開始.在每次更換試驗(yàn)液時(shí)清理試驗(yàn)容器.試驗(yàn)期間,記錄胚胎孵化情況,每24h觀察記錄胚胎及幼魚畸形、死亡情況,并清理死亡胚胎和幼魚.

1.4 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方法

暴露31d后,用液氮速凍各處理濃度組和對照組稀有鮈鯽幼魚并提取魚體總RNA.按照RNA提取試劑盒說明書提取暴露31d后幼魚的總RNA,用核酸蛋白質(zhì)儀測定RNA的濃度和純化質(zhì)量,再按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到互補(bǔ)DNA(cDNA).最后按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書在冰上配制20μL反應(yīng)體系,反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性30s;95°C 10s,60°C 30s,共40個(gè)循環(huán);融解曲線采集程序使用儀器默認(rèn)的采集程序.所用基因引物序列如表1.

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理

相對基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算,其中ΔΔCt由公式(1)計(jì)算得到:

ΔΔCt=(Cttarget-Ctactin)·t-(Cttarget-Ctactin)·0(1)

式中:Ct表示循環(huán)閾值;Cttarget表示目標(biāo)基因的Ct值;Ctactin表示內(nèi)參基因的Ct值;t代表任意時(shí)間點(diǎn);0表示經(jīng)β-actin基因校正后1倍量的目標(biāo)基因表達(dá).

在滿足正態(tài)分布和方差齊性的前提條件下,采用單因素方差分析法(One-way ANOVO)和最小顯著性檢驗(yàn)法(LSD)分析處理組和對照組之間的差異顯著性(<0.05為差異顯著,用*表示),否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)來檢驗(yàn)組間差異的顯著性,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示.用Origin 9.1軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 溴氰菊酯對稀有鮈鯽胚胎孵化和仔魚發(fā)育影響

稀有鮈鯽胚胎孵出48～72h后逐漸孵化,到96h孵化全部完成,各濃度處理組孵化率與對照組的孵化率不存在顯著性差異,所以0.04～3.0μg/L的溴氰菊酯對稀有鮈鯽的孵化無顯著影響.如圖1所示,3.0μg/L濃度組4～5d時(shí),孵化出的仔魚開始出現(xiàn)畸形,可以觀察到的畸形終點(diǎn)指標(biāo)包括仔魚軀體彎曲和體軸彎曲等;1.0μg/L濃度組6～7d時(shí),孵化出的仔魚開始出現(xiàn)畸形,可以觀察到的畸形終點(diǎn)指標(biāo)包括卵黃囊水腫和尾部彎曲(144h),以及心包水腫(168h)等;其余濃度組基本未出現(xiàn)仔魚畸形的情況.從第10d開始,畸形的仔魚開始死亡,故統(tǒng)計(jì)了4～9d各濃度組的畸形率變化情況,結(jié)果見圖2.與對照組相比,1.0和3.0μg/L濃度組的稀有鮈鯽畸形率隨暴露時(shí)間延長而顯著升高,而暴露在其它幾組較低的濃度組的仔魚相比對照組則無顯著差異.

圖1 溴氰菊酯暴露對稀有鮈鯽仔魚的致畸效應(yīng)

A為正常仔魚(CK,144h);B為卵黃囊水腫、尾部彎曲(1.0μg/L,144h);C為卵黃囊水腫(1.0μg/L,168h);D為心包水腫(1.0μg/L,168h);E為軀體彎曲(3.0μg/L,144h);F為體軸彎曲(3.0μg/L,144h)

圖2 溴氰菊酯對稀有鮈鯽畸形率的影響

2.2 溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚死亡率影響

1.0與3.0μg/L濃度組的稀有鮈鯽在暴露第9d時(shí)出現(xiàn)數(shù)量較多的畸形,死亡率結(jié)果如圖3所示,從第10d開始,畸形的仔魚開始死亡,到第13d時(shí),1.0與3.0μg/L濃度組的稀有鮈鯽仔魚基本全部死亡.試驗(yàn)結(jié)束后,對31d各暴露組稀有鮈鯽死亡率做了統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示,除1.0和3.0μg/L濃度組外,暴露在其它幾組較低濃度組的仔魚死亡率相比對照組無顯著性差異.綜合發(fā)育與死亡終點(diǎn)指標(biāo),溴氰菊酯對稀有鮈鯽的LOEC(最低可觀察效應(yīng)濃度)為1.0μg/L,NOEC (無可觀察效應(yīng)濃度)為0.33μg/L.

圖3 溴氰菊酯暴露對稀有鮈鯽仔魚死亡率影響

2.3 溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚性激素受體基因表達(dá)的影響

選取雄激素受體(AR)和雌激素受體(ERs)作為溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚發(fā)育過程中的生殖內(nèi)分泌干擾機(jī)制的研究對象.如圖4所示,在經(jīng)溴氰菊酯暴露31d后,各濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)AR基因的相對表達(dá)量與對照組相比均顯著下降,分別為對照組的0.77倍、0.65倍、0.37倍(數(shù)值分別對應(yīng)0.04, 0.11,0.33μg/L濃度組).測定溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚發(fā)育過程中體內(nèi)ERs表達(dá)情況,結(jié)果表明,0.11, 0.33μg/ L濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)ER1、ER2b基因的相對表達(dá)量與對照組相比均顯著下降,分別為0.69、0.42倍(0.11μg/L組別)和0.74、0.50倍(0.33μg/ L組別),而0.04μg/L濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)ER1、ER2b基因的相對表達(dá)量與對照組相比無顯著差異.各濃度組溴氰菊酯對ER2a基因的相對表達(dá)量無顯著影響.

圖4 溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚性激素受體基因表達(dá)影響

2.4 溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚甲狀腺激素受體基因表達(dá)的影響

通過溴氰菊酯暴露后稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)甲狀腺激素受體TRα和TRβ基因的表達(dá)情況,分析溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚甲狀腺干擾效應(yīng).如圖5所示,在經(jīng)溴氰菊酯暴露31d后,各濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)TRβ基因的相對表達(dá)量與對照組相比均顯著上升,分別為對照組的2.66倍、3.07倍、4.41倍(數(shù)值分別對應(yīng)0.04,0.11,0.33μg/L濃度組),而各濃度組溴氰菊酯對TRα基因的相對表達(dá)量無顯著影響.

圖5 溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚甲狀腺激素受體基因表達(dá)影響

2.5 溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚芳香烴受體基因表達(dá)的影響

通過溴氰菊酯暴露后稀有鮈鯽幼魚發(fā)育過程中體內(nèi)芳香烴受體基因AhRs表達(dá)情況,分析稀有鮈鯽暴露溴氰菊酯后芳香烴受體介導(dǎo)毒性反應(yīng)的影響.如圖6所示,0.11和0.33μg/L濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)AhR1a基因的相對表達(dá)量與對照組相比均顯著下降,下降程度分別為0.68倍和0.50倍;而0.04μg/L濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)AhR1a基因的相對表達(dá)量與對照組相比無顯著差異.0.33μg/L濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)AhR1b基因和AhR2基因的相對表達(dá)量與對照組相比均顯著下降,分別為0.44倍和0.59倍,而0.04和0.11μg/L濃度組稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)AhR1b、AhR2基因的相對表達(dá)量與對照組相比均無顯著差異.

3 討論

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是繼有機(jī)氯、有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯之后的第三代農(nóng)藥,具有高效廣譜,對哺乳動物低毒和低殘留的優(yōu)點(diǎn),在農(nóng)業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用,且其使用量逐年增加.其中,溴氰菊酯是最常見的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥品種.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥進(jìn)入水環(huán)境的方式有3種,一種是施于農(nóng)田的農(nóng)藥通過沉降及地表徑流等方式進(jìn)入水體環(huán)境中[22];一種是由于農(nóng)藥的不恰當(dāng)使用,如在魚類養(yǎng)殖時(shí)使用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥進(jìn)行清塘工作,使其直接進(jìn)入養(yǎng)殖水體中;還有一種是活性成分隨人類使用的蚊香、驅(qū)蚊水殘?jiān)S生活污水進(jìn)入水體.近年來,由于擬除蟲菊酯農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用,世界上越來越多的水體環(huán)境中檢測到擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的存在[4–6].此外,國內(nèi)九龍江口[7]、官廳水庫[8]、梁灘河流域[9]和珠江三角河網(wǎng)[10]等水體環(huán)境中也均有擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢出,其中溴氰菊酯檢出濃度范圍為ND～106.3ng/L.由于溴氰菊酯等農(nóng)藥對水生生物具有較高的毒性,水環(huán)境中殘存的溴氰菊酯可能會對魚類造成不利影響.已有研究表明,斑馬魚幼魚在溴氰菊酯脅迫下出現(xiàn)體長縮短、頭眼面積減小和孵化率增加等現(xiàn)象,其頭部、身體、心臟和尾部區(qū)域產(chǎn)生不同程度的凋亡,溴氰菊酯顯著誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子flk1和fli-1以及心肌發(fā)育相關(guān)基因myl7呈劑量依賴性下降,增加了斑馬魚幼魚的趨觸性行為,引起了類似焦慮的行為[23].暴露在溴氰菊酯中的鰱魚出現(xiàn)不同程度的行為失調(diào),肝、鰓、腦、肌肉組織中總蛋白含量顯著降低,全身皮質(zhì)醇和血糖水平顯著升高[24].最近的研究還發(fā)現(xiàn),20和40μg/L的溴氰菊酯處理顯著阻礙了斑馬魚胚胎魚鰾前體細(xì)胞和組織層的形成,因此損害了斑馬魚魚鰾的發(fā)育[19].目前對環(huán)境濃度范圍該類農(nóng)藥是否能引起魚類的發(fā)育和內(nèi)分泌干擾毒性方面的研究還相對較少.本研究將處于早期生命階段的稀有鮈鯽胚胎暴露于0.04～3.0μg/L的溴氰菊酯溶液中,發(fā)現(xiàn)考察濃度范圍內(nèi)溴氰菊酯對稀有鮈鯽胚胎的孵化無顯著影響(LOEC>3.0μg/L),但暴露于1.0和3.0μg/L的溴氰菊酯溶液7～9d后,大量仔魚出現(xiàn)畸形癥狀,暴露31d后的幼魚死亡率分別為96.7%和100%,綜合來看,影響稀有鮈鯽仔魚發(fā)育畸形和死亡指標(biāo)的LOEC和NOEC分別為1.0和0.33μg/L.由此可見0.33～1.0μg/L濃度水平的溴氰菊酯水環(huán)境賦存濃度可能會對水生魚類幼體造成畸形和死亡風(fēng)險(xiǎn).從內(nèi)分泌干擾終點(diǎn)指標(biāo)(性激素受體基因表達(dá)和甲狀腺激素受體基因表達(dá))來看,低至0.04μg/L的溴氰菊酯濃度已經(jīng)對稀有鮈鯽幼魚內(nèi)分泌指標(biāo)造成了干擾,而該濃度水平已處在當(dāng)下諸多天然水體的檢出濃度范圍,這需引起重視.

性激素受體包括雄激素受體(AR)和雌激素受體(ERs),本研究選取這兩類受體基因作為溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚發(fā)育過程中的生殖內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的研究對象.AR和ERs通常在魚類的性腺和腦中表達(dá),屬于核受體超家族成員之一[25].現(xiàn)有研究表明,一些化合物會影響性激素核受體的表達(dá),從而對水生生物造成類雌激素效應(yīng).例如,有機(jī)氯農(nóng)藥會與靶細(xì)胞上的雌激素結(jié)合,對內(nèi)源性雌激素造成影響[26].擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對生殖內(nèi)分泌的干擾機(jī)制可能包括對性激素合成和代謝干擾、類雌激素效應(yīng)、抗雄激素效應(yīng)等.現(xiàn)有的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥干擾類雌激素和抗雄激素活性的研究表明,對于雄激素受體基因,高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯和氯菊酯暴露均會抑制斑馬魚幼魚體內(nèi)AR的表達(dá),表現(xiàn)出一定的抗雄激素效應(yīng);對于雌激素受體基因,高效氯氟氰菊酯暴露會上調(diào)斑馬魚幼魚體內(nèi)ER1的表達(dá),下調(diào)ER2a的表達(dá),氰戊菊酯暴露會上調(diào)ER1的表達(dá),氯菊酯暴露會上調(diào)ER2a、ER2b的表達(dá)[27].類似的,本研究從基因水平上對比分析溴氰菊酯對稀有鮈鯽幼魚發(fā)育中性激素受體基因的影響,也發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯對雄激素受體基因和雌激素受體基因均存在抑制作用,且對AR基因表達(dá)的抑制作用要高于ERs基因(表現(xiàn)在抑制ER1、ER2b基因的表達(dá)).

甲狀腺激素受體基因(TR)屬于核受體超家族,主要包含TRα和TRβ兩種基因,對于機(jī)體的正常分化發(fā)育和維持調(diào)控體內(nèi)代謝平衡等多個(gè)方面具有重要作用.其中,TRα在機(jī)體中的主要功能是調(diào)節(jié)機(jī)體生長發(fā)育、維持甲狀腺功能;TRβ在機(jī)體中的主要功能是增加T3的敏感性,維持甲狀腺激素TH對促甲狀腺素TSH的負(fù)反饋[28–30].甲狀腺激素能影響魚類胚胎向幼魚的轉(zhuǎn)變,所以,魚類的生長發(fā)育離不開甲狀腺激素的作用.多個(gè)研究證明內(nèi)分泌干擾物可以干擾魚類體內(nèi)甲狀腺系統(tǒng)的循環(huán)調(diào)節(jié),影響甲狀腺的功能,如添加型阻燃劑六溴環(huán)十二烷對斑馬魚體內(nèi)T3和T4具有明顯抑制作用,隨著其暴露濃度的增加,T3和T4的含量水平呈現(xiàn)下降趨勢[31];納米氧化銅會損傷甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu),改變上皮細(xì)胞形態(tài),誘導(dǎo)甲狀腺激素T3和T4上升,造成代謝酶編碼基因ugt1ab表達(dá)的下調(diào)[32];多氯聯(lián)苯暴露會引起褐牙鲆幼魚甲狀腺濾泡細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增生以及膠質(zhì)缺損現(xiàn)象,并造成血漿甲狀腺激素水平顯著下降[33].本研究結(jié)果表明,0.04μg/L的溴氰菊酯暴露便會通過干擾稀有鮈鯽幼魚TRβ基因的表達(dá),對稀有鮈鯽幼魚的甲狀腺系統(tǒng)產(chǎn)生干擾效應(yīng).本研究從基因?qū)用嫔县S富了溴氰菊酯對稀有鮈鯽體內(nèi)甲狀腺干擾作用機(jī)制的研究,然而,擬除蟲菊酯對甲狀腺系統(tǒng)的具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步補(bǔ)充研究.

芳香烴受體基因(AhRs)作為一種配體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子,可以協(xié)助維持免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)行. AhRs能誘導(dǎo)CYP1A1和CYP1A2表達(dá),參與輻射、感染、炎癥和氧化應(yīng)激等應(yīng)激刺激,介導(dǎo)多種細(xì)胞毒性反應(yīng)和重要的生物學(xué)過程,如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤演進(jìn)、生長發(fā)育和再生等[34-35].外源污染物會影響哺乳動物芳香烴受體基因的表達(dá),根據(jù)已有的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的研究,聯(lián)苯菊酯和功夫菊酯暴露均會影響大鼠CYP1A的表達(dá),從而影響其氧化代謝功能[36].已有研究表明,某些外源性污染物也會影響魚類芳香烴受體的表達(dá),對魚類的氧化代謝造成干擾,如低劑量三唑錫對雌性斑馬魚暴露處理后可抑制卵巢芳香化酶基因的表達(dá),而高劑量組則促進(jìn)了芳香化酶基因的表達(dá),此外,各濃度組三唑錫均顯著抑制雄性斑馬魚精巢芳香化酶基因的表達(dá)[37];類二噁英多氯聯(lián)苯(PCB126)能明顯誘導(dǎo)斑馬魚胚胎EROD活性及CYP1A基因mRNA相對表達(dá)量,呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系[38].CYP對氯菊酯的代謝具有保護(hù)作用[39],而氯氰菊酯可以介導(dǎo)斑馬魚幼魚和成魚體內(nèi)CYP酶的轉(zhuǎn)錄水平和催化活性[40].本研究結(jié)果表明,0.11μg/L的溴氰菊酯暴露便開始干擾稀有鮈鯽幼魚AhRs基因的表達(dá),從而影響體內(nèi)CYP的表達(dá),對稀有鮈鯽幼魚的代謝水平產(chǎn)生影響.

4 結(jié)論

4.1 考察濃度范圍內(nèi)的溴氰菊酯暴露對稀有鮈鯽胚胎的孵化無顯著影響(LOEC＞3.0μg/L),但1.0和3.0μg/L的溴氰菊酯暴露7～9d可以誘導(dǎo)稀有鮈鯽仔魚發(fā)育出現(xiàn)顯著的畸形,包括軀體彎曲、體軸彎曲和卵黃囊水腫等癥狀.綜合早期生命階段稀有鮈鯽的發(fā)育和死亡毒性終點(diǎn),溴氰菊酯對其LOEC=1.0μg/L, NOEC=0.33μg/L.

4.2 低至0.04μg/L的溴氰菊酯暴露31d可以影響稀有鮈鯽幼魚性激素受體基因表達(dá)和甲狀腺激素受體基因表達(dá),從而干擾魚類生殖系統(tǒng)和甲狀腺系統(tǒng).其中,溴氰菊酯對其雄激素受體基因和雌激素受體基因均存在抑制作用,且對AR基因表達(dá)的抑制作用要高于ERs基因;溴氰菊酯通過干擾稀有鮈鯽幼魚TRβ基因的表達(dá)對其甲狀腺系統(tǒng)產(chǎn)生干擾效應(yīng).

4.3 0.11～0.33μg/L的溴氰菊酯暴露通過下調(diào)稀有鮈鯽幼魚芳香烴受體基因(AhR1a、AhR1b、AhR2)表達(dá)量,從而影響體內(nèi)CYP的表達(dá),對稀有鮈鯽幼魚的代謝水平產(chǎn)生影響.

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Developmental toxicity and endocrine disrupting effects of deltamethrin on rare minnow () during early life stage.

JIANG Jin-lin*, LYU Jian-wei, CAO Shao-hua, LIU Ren-bin, SHI Jia-qi, LONG Tao, SHAN Zheng-jun

(Key Laboratory of Soil Environmental Management and Pollution Control, Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Ecology and Environment, Nanjing 210042, China)., 2022,42(5)：2395～2403

The developmental toxicity and endocrine disrupting effects of decamethrin on rare minnow () during early life stage were studied using semi-static water exposure method. The LOEC (lowest observed effect concentration) of decamethrin to the incubation of rare minnow embryo was above 3.0μg/L. The LOEC and NOEC (no observed effect concentration) of decamethrin to the developmental malformations and death indicators were 1.0 and 0.33μg/L, respectively. Exposure to the lowest concentration of decamethrin (0.04μg/L) could significantly down-regulate the expression of androgen receptor gene (AR) and up-regulate the expression of thyroid homone receptor gene (TRβ) in rare minnow larvae. Exposure to 0.11μg/L decamethrin down-regulated the expressions of AR, estrogen receptor genes (ER1, ER2b) and aromatic hydrocarbon receptor gene (AhR1a) in rare minnow larvae, and up-regulated the expressions of TRβ. Exposure to 0.33μg/Ldecamethrin inhibited the expressions of AR, estrogen receptor genes (ER1, ER2b) and aromatic hydrocarbon receptor genes (AhR1a, AhR1b, AhR2), as well as induced the expression of TRβ in rare minnow larvae. Given that these concentration levels have been in the range of detectable decamethrin concentrations in multiple natural water bodies, more attention should be paid to the endocrine disrupting effects of decamethrin on fish.

decamethrin；rare minnow；early life stage；developmental toxicity；endocrine disruption

X171,Q89

A

1000-6923(2022)05-2395-09

姜錦林(1984-),男,浙江溫州人,研究員,博士,主要從事污染生態(tài)毒理學(xué)和風(fēng)險(xiǎn)評估研究.發(fā)表論文40余篇.

2021-10-18

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(GYZX220202);國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2017ZX07602)

* 責(zé)任作者, 研究員, jjl@nies.org