李敏英， 黃歡， 劉紅芳， 曾維英， 席麗艷,2

1.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510120

著色芽生菌病(chromoblastomycosis, CBM)是一種誘因復(fù)雜的、多因素作用引起的疾病，不僅與致病菌本身的毒力因子(如硬殼小體、細(xì)胞壁黑素、胞外蛋白酶等)有關(guān)，還與宿主的免疫密切相關(guān)[1-2]。黑素作為一種重要的真菌毒力因子，在多種病原真菌的致病性中發(fā)揮著重要作用，比如白念珠菌、隱球菌和曲霉等[3-4]。黑素不僅使病原真菌具有較強的抵御外界壓力的能力(比如離子輻射、氧化條件、pH 值改變、溫度變化)，還與真菌耐藥有關(guān)，在與宿主的免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用[5]，但具體機制尚不明確。

在我國南方，F(xiàn).monophora是主要的病原菌[6]，黑素是其重要的毒力因子。F.monophora著色霉主要合成DHN-黑素，分布在細(xì)胞壁的外層。研究表明，真菌黑素不僅能抑制巨噬細(xì)胞凋亡，也能促進其凋亡。在煙曲霉中，色素株(DHN-黑素)通過激活PI3K/Akt通路，上調(diào)Mcl-1抗凋亡基因的表達，抑制FoxO1、IκB促凋亡基因的磷酸化，抑制巨噬細(xì)胞凋亡[7]。而在馬爾尼菲藍狀菌當(dāng)中，黑素(L-DOPA黑素)促進巨噬細(xì)胞的裂解，促進其凋亡，并且抑制巨噬細(xì)胞的吞噬[8]。但目前尚未見F.monophora著色霉黑素是否對巨噬細(xì)胞凋亡有影響的相關(guān)報道。細(xì)胞凋亡受多個基因表達調(diào)控影響,其中BCL-2、Bax及聚二磷酸腺苷核糖聚合酶PARP-1基因的表達與凋亡密切相關(guān)。本研究通過觀察F.monophora色素株對巨噬細(xì)胞凋亡相關(guān)基因BCL-2、Bax及PARP-1表達的影響，從而探討F.monophora色素株對巨噬細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和菌株

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保存中心China Center TypeCulture Collection (CCTCC)。F.monophora色素株(CBS122845，SUMS0505)分離自一位 81 歲CBM 患者的皮損[9]，是一種分生孢子突變株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列測序分析鑒定為F.monophora，具有黑素，無菌絲結(jié)構(gòu)；F.monophora白化株(CBS125149，SUMS0510)是由色素株多次傳代后得到的天然白化菌株，不含黑素，也無菌絲結(jié)構(gòu)。

1.2 主要試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)(BD，美國)；DMEM 培養(yǎng)基(Gibco，美國)；青霉素/鏈霉素混合液(雙抗)(Gibco，美國)；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)(Gibco，美國)；PBS緩沖液(廣州鼎國生物技術(shù)有限公司)；RIPA裂解液(廣州鼎國生物技術(shù)有限公司)；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(廣州永津生物科技有限公司)；BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific，美國)；抗PARP-1 抗體(Abcam，英國)；凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Trizol RNA提取試劑(Invitrogen，美國)；Thermo Scientific DreamTaq Green PCR Master Mix (2×)(Thermo Scientific，美國)；RevertAid Master Mix(Thermo Scientific，美國)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及培養(yǎng) 在無菌超凈臺內(nèi)，無菌操作復(fù)蘇 RAW264.7細(xì)胞株，用提前配制好的含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。經(jīng)傳代狀態(tài)穩(wěn)定后，用血細(xì)胞計數(shù)板計算細(xì)胞密度，接種1×105個細(xì)胞至24孔板。

1.3.2 制備F.monophora孢子懸液 將F.monophora色素株和白化株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)2周后，用接種針刮取菌體到PBS緩沖液中，制備菌懸液，血球計數(shù)板調(diào)整菌懸液的分生孢子濃度為 1×107CFU/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 細(xì)胞和F.monophora共培養(yǎng)和觀察 實驗分為3組：PBS對照組、色素株組和白化株組。待接種到細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞完全貼壁后，按細(xì)胞∶孢子為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20的比例，每孔加入提前配制好的菌懸液 100 μL，在含 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞和F.monophora的變化并拍照記錄。

1.3.4 蛋白提取和Western blot 吸除24孔板中的培養(yǎng)液，加入100 μL的RIPA裂解液，裂解細(xì)胞后，取10 μL樣品進行BCA的檢測，按照BCA蛋白定量說明書操作，加入loading buffer后，每個樣品取20 μg蛋白上樣至配制好的1% SDS-PAGE膠中，然后進行電泳，先用80 v，30 min，使各樣本處于同一水平，待marker開始分離后，將電壓調(diào)至120 v，1 h。然后進行常規(guī)轉(zhuǎn)膜，200 mA，1 h，再封閉和孵育一抗(PARP-1和GADPH)，一抗4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗1 h后顯影。

1.3.5 總RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR 采用常規(guī)trizol提取法進行總RNA提取。逆轉(zhuǎn)錄及定量 PCR 反應(yīng)操作均依據(jù)試劑的說明書進行。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 1 min；95 ℃變性 30 s，60 ℃擴增30 s 并采集熒光信號，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)，72 ℃最后延伸5 min。引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.3.6 細(xì)胞免疫熒光 按照凋亡檢測試劑盒說明書操作，吸除24孔板中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1次；加入250 μL的檢測工作液，孵育5 min后，在熒光顯微鏡下觀察熒光染色效果，并且拍照記錄，注意整個過程均需注意避光操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，組間實時定量PCR結(jié)果比較使用t檢驗，對巨噬細(xì)胞的影響采用單因素方差分析進行統(tǒng)計，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 F.monophora不同菌株對巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響

色素株和白化株與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，可發(fā)現(xiàn)孢子附著在巨噬細(xì)胞上；色素株和白化株的孢子由于粘連在一起，成團狀，體積較大，均不能被有效吞噬；孢子量加入越多，色素株組存活的貼壁巨噬細(xì)胞越少，而白化株組巨噬細(xì)胞無明顯變化(圖1)。

圖1 F.monophora不同菌株與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)圖(400×)Figure 1 Co-culture of different strains of F.monophora and macrophages (400×).

2.2 F.monophora色素株對巨噬細(xì)胞PARP-1、BCL-2、BAX表達的影響

在不同的細(xì)胞與孢子的比例下，F(xiàn).monophora不同菌株與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，如圖2所示，隨著色素株的孢子濃度增多，PARP-1被剪切得更多，濃度1 ∶20與1 ∶5的相比，1 ∶20的PARP-1被完全剪切，無完整條帶，而1 ∶5組與PBS組對比，雖然具有分子量更小的被剪切的條帶，但明顯還有尚未被剪切的PARP-1條帶，說明色素株的孢子濃度越大，PARP-1越容易被剪切，凋亡的細(xì)胞越多。而白化株與PBS處理組一樣，不同孢子濃度下，PARP-1均無明顯被剪切。巨噬細(xì)胞與F.monophora不同菌株在細(xì)胞與孢子比例為1 ∶10時共培養(yǎng)24 h，實時定量PCR檢測BCL-2、BAX的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與白化株相比，色素株能明顯降低BCL-2/BAX的比值(t=3.20,P=0.033)，而白化株與PBS處理組相比無明顯差異(t=0.66,P=0.540)，說明色素株能明顯引起巨噬細(xì)胞的凋亡，與Western blot檢測結(jié)果一致。

圖2 F.monophora不同菌株對巨噬細(xì)胞PARP-1、BCL-2、BAX基因表達的影響Figure 2 The effects of different strains of F.monophora on the gene expression of PARP-1, BCL-2 and BAX in macrophages.

2.3 F.monophora色素株對巨噬細(xì)胞凋亡的影響

各菌與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，免疫熒光檢測Annexin V FITC的陽性細(xì)胞，每組統(tǒng)計300個細(xì)胞，計算陽性率，陽性即為凋亡細(xì)胞。如圖3所示，隨著時間的延長，色素株組凋亡細(xì)胞明顯增多，4 h組與8 h組相比，F(xiàn)=82.01。4 h色素株組與8 h組相比，MOI為1 ∶5時，P=0.001；MOI為1 ∶10時，P=0.003；MOI為1 ∶20時，P<0.01。不同劑量組比較，4 h組，F(xiàn)=62.58，色素株MOI 1 ∶5組與MOI 1 ∶10組相比,P=0.006；MOI 1 ∶10與MOI 1 ∶20組相比,P=0.003。在8 h組，F(xiàn)=254.6，色素株MOI 1 ∶5組與MOI 1 ∶10組相比,P=0.004，MOI 1 ∶10組與MOI 1 ∶20組相比,P<0.01，可見其呈劑量依賴。而白化株無論劑量多少均與PBS處理組一樣，組間無統(tǒng)計學(xué)差異(4 h組，F(xiàn)=2.93；8 h組，F(xiàn)=0.89，均P>0.05)。

圖3 F.monophora不同菌株對巨噬細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effects of different strains of F.monophora on apoptosis of macrophages.

3 討論

CBM大多是病原體經(jīng)傷口感染進入皮下定植，并轉(zhuǎn)化成寄生態(tài)的硬殼小體形成，引起肉芽腫和化膿性感染。本研究使用的是一株F.monophora突變株 CBS122845，菌落形態(tài)為煤渣樣，產(chǎn)生大量的黑素，顯微觀察為酵母狀的磚格樣細(xì)胞，沒有菌絲形態(tài)[9]。該菌株經(jīng)過多次傳代，獲得了白化突變株 CBS125149，細(xì)胞壁無黑素。小鼠感染模型已證實，色素株較白化株引起的感染性肉芽腫更嚴(yán)重，并且持續(xù)時間更長[10]。表明黑素為F.monophora抵抗宿主免疫細(xì)胞的重要毒力因子。目前，F(xiàn).monophora與宿主之間的發(fā)病機制和早期與宿主的相互作用機制知之甚少。已有研究證實F.monophora促進促炎細(xì)胞因子的表達并抑制抗炎細(xì)胞因子的表達，促進 THP-1向經(jīng)典活化型(M1型)巨噬細(xì)胞極化[11]。F.monophora感染巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜分析研究表明黑素影響巨噬細(xì)胞基因的表達，差異表達基因的生物學(xué)功能與免疫反應(yīng)密切相關(guān)，黑素可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的MAPK信號通路影響相互作用[12]。但其如何影響宿主的免疫細(xì)胞，如何影響先天免疫調(diào)節(jié)的機制尚不明確。

眾所周知，細(xì)胞程序性死亡(apoptosis)是一種參與先天免疫調(diào)節(jié)的機制[13]。細(xì)胞凋亡發(fā)生過程受多基因的調(diào)控，由多種促凋亡和抗凋亡的蛋白相互作用，兩者比例失衡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。BCL-2在急性淋巴細(xì)胞白血病中被發(fā)現(xiàn)[14]，后來被證實可以保護細(xì)胞免于程序性細(xì)胞死亡[15]，是一種重要的抗凋亡蛋白。BCL-2相關(guān)的X蛋白(BAX)被鑒定為BCL-2的同源結(jié)合伴侶，作用與BCL-2相反，是促進細(xì)胞凋亡的蛋白[16]。兩者比值是凋亡走向的標(biāo)志，比值升高抑制凋亡，比值降低促進凋亡。本實驗結(jié)果表明，在不被吞噬的情況下，F(xiàn).monophora色素株下調(diào)巨噬細(xì)胞BCL-2與BAX的比值，最終增加巨噬細(xì)胞的凋亡比例。PARP-1是定位在細(xì)胞核內(nèi),與應(yīng)激條件下 DNA修復(fù)密切相關(guān)的一種酶。 PARP-1對于細(xì)胞的穩(wěn)定和存活非常重要，PARP-1失去酶活力會加速細(xì)胞的不穩(wěn)定。Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通過裂解細(xì)胞功能和存活所需的幾種關(guān)鍵蛋白來實現(xiàn)[17]。PARP-1是幾種已知的半胱天冬酶底物之一。半胱天冬酶對PARP-1的裂解被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[18]。本實驗結(jié)果表明,F.monophora色素株在刺激巨噬細(xì)胞時，隨著劑量的增加，能明顯剪切PARP-1，使巨噬細(xì)胞的凋亡比例增多。

綜上所述，F(xiàn).monophora色素株可在胞外通過下調(diào)BCL-2/BAX的比值,剪切PARP-1，進而促進巨噬細(xì)胞的凋亡發(fā)生。推測F.monophora色素株可能通過促進巨噬細(xì)胞凋亡，來抵抗巨噬細(xì)胞的免疫殺傷作用，創(chuàng)造有利于免疫逃逸的條件，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。