唐鑫， 曹翠香， 梁云霄， 劉敏， 萬(wàn)苗堅(jiān)

1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510630；2.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091

脫發(fā)影響全球一半以上人口，對(duì)患者的生活質(zhì)量和社會(huì)心理健康有著嚴(yán)重的影響[1]。目前，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration， FDA)批準(zhǔn)的兩種治療脫發(fā)的藥物(口服非那雄胺和局部外用米諾地爾)存在不良反應(yīng)及停藥后易復(fù)發(fā)等局限性[2]。脫發(fā)的治療仍然是世界性難題和研究的熱點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells， MSCs)是一類(lèi)具有自我更新及多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可來(lái)源于骨髓、脂肪、臍帶等,具有高度的自我更新、多向分化及免疫調(diào)節(jié)能力。其中，ADSCs 取材來(lái)源廣泛，容易獲取及分離培養(yǎng),并具有促進(jìn)細(xì)胞再生等功能。外泌體(exosomes,Exos)是一類(lèi)直徑大小約為30～150 nm膜性囊泡,可由絕大多數(shù)細(xì)胞分泌產(chǎn)生, 可通過(guò)其包裹的脂類(lèi)、核酸、蛋白質(zhì)等參與細(xì)胞間通訊，調(diào)節(jié)細(xì)胞生物活性。MSCs外泌體廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,如營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)組織、促進(jìn)傷口愈合、改善血管再生等[3-4]。最近的研究表明多種細(xì)胞來(lái)源的Exos參與了毛囊生理和周期循環(huán)過(guò)程中發(fā)生的細(xì)胞間通訊，能夠刺激毛發(fā)的生長(zhǎng)[5-10]。真皮毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells，DPCs)是一群毛球部的間充質(zhì)細(xì)胞，是毛囊生長(zhǎng)和周期調(diào)節(jié)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，提供毛囊生長(zhǎng)所必需信號(hào)及決定毛囊的分化方向，毛囊誘導(dǎo)能力是DPCs的特殊功能[11-12]。目前脂肪干細(xì)胞外泌體(adipose-derived stem cell exosomes，ADSC-Exos) 對(duì)毛乳頭細(xì)胞影響的研究較少[13-14]。本研究通過(guò)初步探究ADSC-Exo對(duì)毛乳頭細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)能力的影響，從而探討脫發(fā)治療新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素(Gibco，美國(guó))；CD9、TSG101、calnexin、β-catenin、versican、ALP、GAPDH抗體(abcam，美國(guó))；人毛乳頭細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(ScienCell，美國(guó))；0.2%膠原酶Ⅰ(BioFroxx，德國(guó))； 成脂、成軟骨培養(yǎng)基(Cyagen，中國(guó))；PKH67染料(Sigma，美國(guó))；BCA蛋白濃度試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))； CCK-8試劑盒(DOJINDO，日本);SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad，美國(guó))；4%多聚甲醛溶液、細(xì)胞凍存液、全蛋白提取試劑盒(凱基生物，中國(guó))；化學(xué)發(fā)光液(艾菲，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 ADSCs: 收集大腿抽脂術(shù)后多余的廢棄脂肪組織(28歲健康女性志愿者，已簽署知情同意書(shū)， 且通過(guò)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn))。用含1%青-鏈霉素雙抗的PBS洗滌3次，去除血液及多余雜質(zhì)，用無(wú)菌鑷子去除較大的纖維組織,并用眼科剪剪碎脂肪組織，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入等體積的0.2% Ⅰ型膠原酶，37 ℃水浴振蕩至管中組織呈乳糜狀(約30 min)，加入等體積的含10% FBS的低糖DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min, 離心3 min，輕輕吸掉最上層的脂肪及中層上清液，保留下層沉淀，用含有體積分?jǐn)?shù)為10% FBS及1%青-鏈霉素的DMEM低糖完全培養(yǎng)基重懸，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞融合度約90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，本研究使用第3代脂肪干細(xì)胞。誘導(dǎo)分化及免疫熒光染色法檢測(cè)ADSCs表面標(biāo)記物對(duì)ADSCs進(jìn)行鑒定。

DPCs:購(gòu)于美國(guó)ScienCell 公司，按照說(shuō)明書(shū)配制間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，加入胎牛血清、青霉素-鏈霉素及間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)因子，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 外泌體提取與鑒定 用低糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)第三代的ADSCs,待其融合度達(dá)80%～90%時(shí)，更換無(wú)外泌體血清低糖DMEM培養(yǎng)基處理48 h，收集培養(yǎng)上清，按照超速離心法步驟進(jìn)行離心提取外泌體，最后用預(yù)冷PBS重懸ADSC-Exos,所收集的外泌體置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｓ眉{米顆粒粒度分析儀(nanoparticle tracking analysis, NTA)檢測(cè)粒徑大小和濃度；透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)分析ADSCs-Exos形態(tài)特征；蛋白免疫印跡檢測(cè)外泌體表面標(biāo)記物[15]。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) DPCs接種于96孔板，5 000 cells/孔,待細(xì)胞貼壁后加入外泌體處理，48 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h, 測(cè)量吸光度值并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.4 蛋白免疫印跡 用適量細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞蛋白并測(cè)定其蛋白濃度，進(jìn)行凝膠電泳，電泳完成后恒流轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h。1×TBST 洗膜4遍，每次8 min，加入相應(yīng)一抗置于4 ℃過(guò)夜，吸走一抗，用1×TBST 洗膜4遍，每次8 min，加入二抗孵育 1 h，1×TBST 洗膜 4遍，每次8 min。用化學(xué)發(fā)光液顯色發(fā)光，使用Image J軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定

如圖1所示：鏡下ADSCs呈長(zhǎng)梭形，排列緊密；分化實(shí)驗(yàn)中，ADSCs順利向成脂和成軟骨誘導(dǎo)分化，體現(xiàn)其具有多向分化的干細(xì)胞潛能。免疫熒光提示ADSCs表達(dá)CD13、CD29、CD44和CD90等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物,不表達(dá)CD34、ISO等陰性標(biāo)記物 (圖2)。

圖1 ADSCs鏡下形態(tài)及分化實(shí)驗(yàn)Figure 1 Identification of ADSCs.

圖2 免疫熒光染色法檢測(cè)ADSCs表面標(biāo)記物(100×)Figure 2 Immunofluorescence staining was used to detect the surface markers of ADSCs (100×).

2.2 外泌體提取與鑒定

透射電鏡下外泌體形態(tài)完整、大小均一，呈圓杯形(圖3A)； 蛋白免疫印跡顯示:與ADSCs細(xì)胞裂解蛋白相比，外泌體高表達(dá) TSG101和CD9的典型表面標(biāo)記物，不表達(dá)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白calnexin(圖3B)；納米顆粒追蹤分析(NTA)外泌體粒徑大小為30 ～ 150 nm，平均粒徑為66.00 nm(圖3C)，表明本研究成功提取脂肪干細(xì)胞外泌體。

圖3 脂肪干細(xì)胞外泌體的特征 3A：透射電鏡圖像(比例尺100 nm)；3B：CD9、TSG101和calnexin蛋白免疫印跡檢測(cè)；3C： NTA測(cè)量的外泌體粒徑大小分布Figure 3 Characteristics of adipose-derived stem cell exosomes. 3A: TEM image, scale bar 100 nm；3B: Western blot detection of CD9, TSG101 and calnexin proteins；3C: Particle size distribution of exosomes measured by NTA.

2.3 ADSC-Exos促進(jìn)DPCs增殖，增強(qiáng)毛囊誘導(dǎo)能力

采用熒光染料PKH67標(biāo)記ADSC-Exos，分別用加和未加PKH67標(biāo)記的ADSC-Exos與DPCs孵育，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察到綠色熒光的ADSC-Exos在DPCs內(nèi)分布，即ADSC-Exos被成功攝取(圖4A),表明ADSC-Exos可有效內(nèi)化到DPCs中。

將ADSC-Exos與DPCs共培養(yǎng)48 h，DPCs細(xì)胞數(shù)量及密度明顯增加(圖4B)。CCK-8結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比，ADSC-Exos對(duì)DPCs增殖明顯促進(jìn)(t=14.38，P<0.01，圖4C)。提取各組細(xì)胞總蛋白進(jìn)行毛囊誘導(dǎo)能力相關(guān)蛋白ALP及Versican檢測(cè)，以 GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行均一化處理，外泌體組的ALP蛋白相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的1.47倍(t=7.75，P<0.01)，Versican蛋白相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的1.95倍(t=29.34，P<0.01)，提示ADSC-Exos可以上調(diào)DPCs的ALP和Versica蛋白的表達(dá)(圖4D、4E)，DPCs的誘導(dǎo)能力顯著提高。

圖4 ADSC-Exos對(duì)DPC生物活性的影響 4A：分別用加和未加PKH67標(biāo)記的ADSC-Exos與DPCs孵育，ADSC-Exos可被DPCs攝取吸收，PKH67為綠色熒光，細(xì)胞核被DAPI染為藍(lán)色(200×，比例尺:50 μm)； 4B：ADSC-Exos與DPCs共培養(yǎng)細(xì)胞圖，以PBS為對(duì)照(100×，比例尺:100 μm)； 4C：ADSC-Exos促進(jìn)DPCs增殖；4D:ADSC-Exos處理DPCs后 ALP 和 Versican蛋白表達(dá)的變化；4E：蛋白條帶灰度定量圖Figure 4 Effect of ADSC-Exos on DPC bioactivity. 4A: ADSC-Exos was labeled with PKH67 and absorbed by DPC. PBS was used as negative control, PKH67 was green fluorescence, and the nucleus was stained blue by DAPI (200×, scale:50 μm); 4B: Map of ADSC-Exos and DPCs co-cultured cells, PBS as control(100×， scale:100 μm); 4C: ADSC-Exos promotes DPCs proliferation; 4D: Changes of ALP and Versican protein expression after ADSC-Exos treatment of DPCs; 4E: gray scale quantitative map of protein bands.

3 討論

脫發(fā)日益成為危害全球男女身心健康的疾病，亟需開(kāi)發(fā)效果顯著、持久且副作用小的治療方法。外泌體作為細(xì)胞通訊的介質(zhì)，通過(guò)轉(zhuǎn)移各種生物活性物質(zhì)核酸、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)等去調(diào)節(jié)目的細(xì)胞或參與組織再生，并且保持與來(lái)源細(xì)胞相同的生物活性[16]。干細(xì)胞移植在治療疾病方面具有巨大的潛力，ADSCs最近成為一種極具吸引力的間充質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型。本研究成功地從ADSCs細(xì)胞培養(yǎng)基中分離出了外泌體，同時(shí)，使用PKH67熒光標(biāo)記的外泌體證明DPCs順利攝取ADSC-Exos。將ADSC-Exos與DPCs共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),ADSC-Exos促進(jìn)DPCs增殖，上調(diào)ALP和Versican蛋白的表達(dá)。

研究表明，ADSCs可分泌各種生長(zhǎng)因子，利用脂肪來(lái)源的干細(xì)胞、條件培養(yǎng)基及富含ADSCs的血管基質(zhì)成分(stromal vascular fraction, SVF)在脫發(fā)治療領(lǐng)域應(yīng)用的治療方法已被不斷報(bào)道[17-19]，但既往對(duì)脂肪干細(xì)胞促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的研究主要是細(xì)胞以及條件培養(yǎng)基，存在干細(xì)胞及培養(yǎng)基治療的局限性，如免疫排斥、存活時(shí)間短、總體含量低等缺點(diǎn)。本研究通過(guò)酶消法從脂肪組織分離出ADSCs，在體外進(jìn)行培養(yǎng)及傳代，原代脂肪干細(xì)胞形態(tài)為梭形，高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)陽(yáng)性表面標(biāo)記物，并向成脂及成軟骨誘導(dǎo)分化等多向分化潛能。通過(guò)超速離心法獲取外泌體，電鏡下外泌體形態(tài)呈圓杯形；粒徑在30～150 nm；高表達(dá)CD9、CD81等外泌體標(biāo)記物，不表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異蛋白Calnaxin，均與以往報(bào)道的研究結(jié)果[20-21]較一致，表明本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)ADSCs并獲取未受細(xì)胞器污染的較純的ADSC-Exos。因此，本研究中使用的ADSC-Exos具有大量生產(chǎn)、倫理限制少的優(yōu)勢(shì)，可克服干細(xì)胞及其條件培養(yǎng)基的局限性，利于后續(xù)進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化治療及開(kāi)展組織工程研究。

DPCs作為毛囊生長(zhǎng)的信號(hào)指導(dǎo)中心，通過(guò)分泌信號(hào)因子來(lái)調(diào)控毛囊的周期，其生物活性變化與毛囊生長(zhǎng)及周期調(diào)控息息相關(guān)。其中，ALP及Versican作為DPCs的重要標(biāo)記物及誘導(dǎo)能力指標(biāo)，在生長(zhǎng)期毛囊真皮乳頭中特異性高表達(dá)ALP及Versican可誘導(dǎo)毛囊形成，晚期傳代的DPCs失去誘導(dǎo)活性，無(wú)法產(chǎn)生毛囊而導(dǎo)致脫發(fā)[22-25]。因此，促進(jìn)DPCs增殖和恢復(fù)DPCs的毛發(fā)誘導(dǎo)能力將是一種很有希望的治療脫發(fā)的方法。本實(shí)驗(yàn)采用DPCs作為研究對(duì)象，通過(guò)觀察 DPCs經(jīng)過(guò)處理前后細(xì)胞增殖和毛囊誘導(dǎo)能力的變化，進(jìn)而判斷DPCs生物活性的改變。DPCs的增殖和毛發(fā)誘導(dǎo)能力是毛囊形態(tài)發(fā)生和生長(zhǎng)所必需的。本研究發(fā)現(xiàn)外泌體組DPCs增殖活性增加，外泌體組ALP和Versican蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明ADSC-Exos可改善DPCs的毛囊誘導(dǎo)能力，誘導(dǎo)DPCs向生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。這與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖和增強(qiáng)誘導(dǎo)能力的研究結(jié)果[26]一致。 同時(shí)，也有研究表明，脂肪干細(xì)胞、ADSCs條件培養(yǎng)基以及富含ADSCs的血管基質(zhì)成分(stromal vascular fraction，SVF)可治療脫發(fā)，促進(jìn)毛發(fā)再生[27-28]，ADSC-Exos作為脂肪干細(xì)胞及其條件培養(yǎng)基的重要活性成分同樣具有促毛發(fā)生長(zhǎng)的特性。最近研究表明，ADSC-Exos促進(jìn)毛發(fā)重建和再生[13-14,29]。小鼠ADSC-Exos與真表皮細(xì)胞混合物移植至裸鼠背部后有利于毛發(fā)再生，但因研究的細(xì)胞成分較復(fù)雜，難以明確ADSC-Exos的作用對(duì)象[29]。小鼠ADSC-Exos可促進(jìn)小鼠觸須DPCs的增殖、遷移和抑制其凋亡，并通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路和TNF-α信號(hào)通路促進(jìn)毛發(fā)再生[13]，與本結(jié)果類(lèi)似，但未進(jìn)行DPCs誘導(dǎo)能力相關(guān)探究，而且本研究使用人源ADSC-Exos及人頭皮DPCs進(jìn)行毛發(fā)生長(zhǎng)研究，更能接近人體實(shí)際情況。此外，研究發(fā)現(xiàn)ADSC-Exos促進(jìn)DPCs增殖遷移，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)ALP及Versican的基因表達(dá)[14]，而本研究則在蛋白水平探討ADSC-Exos上調(diào)ALP和Versican蛋白表達(dá)，從而維持DPCs在體外毛發(fā)誘導(dǎo)能力,不僅印證了該研究結(jié)果，而且在不同水平上補(bǔ)充和完善了ADSC-Exos對(duì)DPCs毛發(fā)誘導(dǎo)能力影響的探究。

綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步探討ADSC-Exos對(duì)DPCs生物活性的影響,發(fā)現(xiàn)ADSC-Exos促進(jìn)DPCs增殖，增強(qiáng)其毛發(fā)誘導(dǎo)能力，發(fā)揮誘導(dǎo)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用，提示ADSC-Exos有望為脫發(fā)提供一種新的無(wú)細(xì)胞治療策略。但本研究?jī)H涉及細(xì)胞水平的研究，在毛囊器官、體內(nèi)動(dòng)物水平上有待進(jìn)一步加以證實(shí)，且ADSC-Exos參與毛囊生長(zhǎng)的具體作用機(jī)制仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。