肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的肝臟惡性原發(fā)腫瘤，區(qū)分肝癌和肝良性病變對患者病情預(yù)測及管理具有非常重要的價值。甲胎蛋白(AFP)是HCC較為常見的血清診斷標(biāo)志物，但AFP也常見于其他腫瘤患者中，缺乏足夠的敏感度和特異性

。婆羅雙樹樣基因-4(SALL4)已被廣泛用作多數(shù)生殖細(xì)胞瘤(GCTs)標(biāo)志物，包括原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性病癥

。SALL4是位于染色體20q13.13-13.2中的一個鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在維持胚胎肝細(xì)胞的自我更新和多能性方面發(fā)揮著重要作用

。研究表明，SALL4蛋白能在體細(xì)胞癌中表達(dá)，其中包括原發(fā)癌(高達(dá)95%)、轉(zhuǎn)移性胃腺癌(33%)和經(jīng)常轉(zhuǎn)移的食管和結(jié)腸腺癌(分別高達(dá)20%及8%)

。然而，在HCC中發(fā)現(xiàn)SALL4蛋白表達(dá)，說明SALL4蛋白存在潛在的診斷價值。本研究采用免疫組化分析SALL4蛋白在肝癌中的表達(dá)，旨在分析其在惡性和良性肝臟病變中的診斷價值。

運用SPSS 21.0的統(tǒng)計學(xué)軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用“%”表示，采用x2檢驗，計量資料患用（±s）來表示，以（P＜0.05）作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取入住我院的HCC和肝良性病變患者113例，采用Edmondson-Steiner分級對HCC患者進(jìn)行疾病分級。本研究經(jīng)相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)會審批通過且患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲的患者；②病理顯示HCC；③包括肝腺瘤和局灶性結(jié)節(jié)增生患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有多發(fā)性腫瘤疾病的患者；②患者病例資料缺失或不愿意提供資料者；③患者懷孕或處于哺乳期。

1.3 方法

1.3.2 ShRNA SALL4轉(zhuǎn)染 ShRNA抑制采用GIPZ慢病毒ShRNA靶向人SALL4(Waltham，MA)，慢病毒表達(dá)SALL4 Sh’RNA顆粒在HEK293T細(xì)胞中產(chǎn)生。采用穩(wěn)轉(zhuǎn)方式，按照每孔8×10

Hu7人HCC細(xì)胞數(shù)量接種于6孔板中，且每孔加入2 ml不含抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基；孵育過夜后，離心棄去培養(yǎng)基，并加入1 ml含有慢病毒顆粒(在10 μg/ml聚凝胺中)的培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，離心除去培養(yǎng)基，并在每孔中加入2 ml新鮮的培養(yǎng)基；48 h后，棄去培養(yǎng)基，在每孔中加入含有2 mg/ml的嘌呤霉素；每3～4天更換1次以作菌株選擇，這樣經(jīng)過2周的霉素篩選后獲得單一菌株。

1.3.1 免疫組化分析 SALL4蛋白表達(dá)的檢測采用免疫組化分析。免疫反應(yīng)采用半定量評估法，陰性為0(0～5%細(xì)胞染色)，弱陽性為1+(5%～10%細(xì)胞染色)，陽性為2+(10%～50%細(xì)胞染色)，強(qiáng)陽性為3+(50%以上細(xì)胞染色)，其中染色強(qiáng)度為0～3+。鄰近的肝組織為良性肝細(xì)胞癌的切片，也進(jìn)行了百分比評估細(xì)胞染色。

2.1 患者一般臨床指標(biāo) 見表1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以表示，計數(shù)資料數(shù)據(jù)以%表示。計量指標(biāo)采用獨立樣本

檢驗進(jìn)行組間比較；計數(shù)指標(biāo)采用卡方檢驗進(jìn)行組間比較(必要時輔以精確概率法直接計算

值)；采用向采用Spearman相關(guān)性分析探究SALL4與肝病變類型，HCC分級及分期的相關(guān)性。

<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

(2)教學(xué)內(nèi)容可重復(fù)使用。除了時空自主性強(qiáng)外，異步在線教育也是信息網(wǎng)絡(luò)時代教育資源的組成部分。大量傳統(tǒng)教學(xué)資源上傳后，形成優(yōu)秀教學(xué)案例的共享空間，是對傳統(tǒng)課堂教學(xué)的延伸，是傳播和擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)教學(xué)內(nèi)容及教學(xué)方法的重要方式。

2.3 SALL4在肝癌病變中染色等級與腫瘤分期的相關(guān)性分析 見表3。病變類型與SALL進(jìn)行Sprarman相關(guān)性分析顯示，病變類型與SALL4呈正相關(guān)(

=0.830，

<0.001)；而從HCC分級來看，主要存在于1級和2級，HCC分級與SALL4經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示，兩者未見統(tǒng)計學(xué)相關(guān)(

=0.863)。HCC分期與SALL進(jìn)行Sprarman相關(guān)性分析顯示，病變類型與SALL4呈正相關(guān)(

=0.230，

=0.040)。

2 結(jié)果

1.3.3 蛋白提取和免疫印跡分析 采用常規(guī)方法操作。

2.2 HCC和良性肝癌組織中SALL4蛋白表達(dá) 半定量分析SALL4染色顯示結(jié)果顯示，在HCC細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)而彌散的胞質(zhì)和局灶性核SALL4陽性染色77例(96.25%)，其中包括62例強(qiáng)陽性，染色和5例陽性，染色和10例弱陽性，染色局灶性陽性，而另外3例(3.8%)無染色現(xiàn)象，見表2和圖1。

機(jī)械設(shè)計制造與自動化技術(shù)在應(yīng)用中，基礎(chǔ)參數(shù)的準(zhǔn)確性為主要的影響因素。以質(zhì)檢參數(shù)為基準(zhǔn)進(jìn)行分析，如機(jī)械配件生產(chǎn)中螺帽合格內(nèi)徑規(guī)格尺寸為20mm，系統(tǒng)錯誤設(shè)定為25mm，則極大的影響了自動化技術(shù)的應(yīng)用效果，同時對于系統(tǒng)生產(chǎn)運行的安全性也造成了較大的影響。因此實際分析機(jī)械設(shè)計制造與自動化技術(shù)在應(yīng)用中，落實基礎(chǔ)參數(shù)的準(zhǔn)確性則為重要的注意事項。

分析乾隆南巡期間排名前十的游覽景觀，杭州以西湖、孤山和云棲3處景觀列在首位，蘇州和鎮(zhèn)江都以2處景觀即寒山和靈巖山、金山和焦山并列第二，江寧、揚州和常州各以1處景觀即棲霞山、大明寺、惠山位居第三。此外，蘇州的虎丘是乾隆帝賦詩吟誦的重要景觀，揚州的天寧寺和高旻寺、杭州的織造府行宮是乾隆帝題聯(lián)賜匾的重要景觀。

2.4 ShRNA介導(dǎo)人Hu7 HCC細(xì)胞中SALL4沉默 采用ShRNA干擾SALL4在人Hu7 HCC細(xì)胞中動力學(xué)表達(dá)沉默。轉(zhuǎn)染SALL4-ShRNA到兩個獨立的克隆體(分別標(biāo)記為1#和2#)Hu7細(xì)胞中，載體作為對照，與Western Blot結(jié)果(圖2A)均顯示了SALL4表達(dá)的顯著下調(diào)。根據(jù)菌落形成和大小進(jìn)一步證明總菌落數(shù)都有明顯下降，這表明細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生了，同時2個克隆體中SALL4表達(dá)也顯示下調(diào)了，見圖2B、C。沉默SALL4后，Hu7細(xì)胞數(shù)量顯著增加。

3 討論

迄今為止，已有多種腫瘤標(biāo)志物在HCC中被發(fā)現(xiàn)。研究表明，糖皮質(zhì)激素-3免疫染色可用于鑒別非肝硬化肝細(xì)胞癌與腺瘤

，但雖具有較高的靈敏度，但在區(qū)分HCC和肝良性病變中效果較差

。此外，核染色β-連環(huán)素也被證實在鑒別高分化HCC的高危/非典型腺瘤具有積極意義

。本研究發(fā)現(xiàn)婆羅雙樹樣基因-4(SALL4)蛋白可在HCC病例中呈陽性表達(dá)，而在良性肝臟病變中則為陰性或弱陽性，這說明SALL4是一種新的HCC生物標(biāo)志物，并具有潛在的應(yīng)用價值。

本研究證實了SALL4在臨床中的診斷價值。同時結(jié)果還顯示，SALL4在HCC的不同分級中均有發(fā)現(xiàn)，但其表達(dá)水平與HCC的分級無顯著相關(guān)性，對SALL4表達(dá)水平與HCC分期進(jìn)行相關(guān)性分析，其結(jié)果顯示兩者具有顯著統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性，這說明了SALL4在HCC診斷中具有較高的敏感度。本研究還證實了SALL4能明顯抑制Hu7細(xì)胞增殖沉默，這與陳圓圓等

的研究成果有共同之處，SALL4基因沉默可能是癌癥治療的新靶點，可在化療過程增加化療的敏感度?；谶@些研究結(jié)果，SALL4有望成為肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物和潛在的治療新靶點。

SALL4是維持胚胎干細(xì)胞多潛能分化和自我更新的重要調(diào)控基因。研究顯示，該基因突變常導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，且SALL4基因在血液系統(tǒng)腫瘤中高表達(dá)，在腫瘤發(fā)生的信號通路中起著重要的調(diào)節(jié)作用

。同時，SALL4也被證實與白血病、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、乳腺癌和肺癌等其他實體瘤都有著精密聯(lián)系，這也說明研究SALL4具有非常重要的意義。本研究通過動態(tài)沉默ShRNA檢測Hu7細(xì)胞SALL4表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可明顯減少菌落形成和細(xì)胞生長，這進(jìn)一步證實了SALL4在肝細(xì)胞癌發(fā)生中的重要作用。

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