張利娜，杜相欣，張雨彤，郭 霞，郝 娜，趙 欣，張 宇

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系 細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001)

腦機(jī)接口(brain computer interface，BCI)可獨(dú)立于機(jī)體的外周神經(jīng)和肌肉將大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生的信號(hào)傳送至電腦設(shè)備并與之互通交換[1]。BCI作為臨床康復(fù)治療的重要手段之一，已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)假肢[2,3]、疼痛緩解[4,5]、帕金森癥抑制[6-8]、視覺恢復(fù)[1,9]等領(lǐng)域。腦機(jī)接口的連接方式有植入式和非植入式之分[10]，其中植入式具有時(shí)空分辨率高、定位精準(zhǔn)、記錄信號(hào)質(zhì)量好等優(yōu)勢(shì)[11]。植入式腦機(jī)接口通過(guò)手術(shù)的方式將微絲電極陣列、硅電極陣列和光電極等神經(jīng)微電極植入至具體目標(biāo)腦區(qū)[11,12]，以實(shí)現(xiàn)對(duì)電極記錄點(diǎn)周圍神經(jīng)元放電信號(hào)的直接采集和記錄。

微絲電極陣列(microwire electrode array,MWEA)作為BCI的重要媒介之一，因其高通量記錄[12-14]、耗材便宜、制作簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定[11]等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于多通道電生理等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。MWEA一般采用直徑為20～50 μm的被一層絕緣材料包裹的金屬絲制成[9]，這些金屬絲主要包括鎳鉻合金、鉑銥合金、鎢、鉑和不銹鋼等[11,15]。常規(guī)電生理實(shí)驗(yàn)一般選用導(dǎo)電性能、物理機(jī)械性能、電化學(xué)性能和制作成本均較為優(yōu)異的鎳鉻合金絲作為制作微絲電極的材料[9,11]。微絲電極的發(fā)展歷史悠久，早在1950年，已有人制作出金屬微絲電極并用于神經(jīng)電信號(hào)的記錄[16]，此時(shí)的單根金屬電極并不能滿足科學(xué)家對(duì)大腦8×1011神經(jīng)元的探索與研究，因此，科研人員逐漸研制出多根電極絲排列的MWEA。Tsai等人[17]制備的16和32通道的微絲電極陣列為腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的多通道電生理研究提供了堅(jiān)實(shí)的媒介支撐，也是目前電生理實(shí)驗(yàn)廣泛使用的微絲電極陣列原始模板[18]。雖然MWEA在記錄神經(jīng)元放電方面有諸多優(yōu)勢(shì)，但是其記錄到的電信號(hào)存在信噪比低、電壓幅度小，且易受被記錄對(duì)象的運(yùn)動(dòng)干擾等缺點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中，可以通過(guò)適當(dāng)增加電極尖端的表面積(如在尖端電鍍修飾材料)來(lái)減小電極阻抗，但是阻抗過(guò)小會(huì)增加背景噪音，降低信噪比[9]。連接地線可降低一部分噪音干擾，提高記錄信號(hào)的信噪比，但是這種排噪方式比較隨機(jī)，個(gè)體差異較大。目前在多通道電生理實(shí)驗(yàn)中，商品化的微絲電極陣列已經(jīng)逐步進(jìn)入市場(chǎng)，但由于其高昂的價(jià)格，并不適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)中，常常通過(guò)修正地線連接的部位找到排干擾的最佳方式，但效果并不理想，在此背景下，優(yōu)化微絲電極的制作無(wú)疑成為最便利實(shí)惠的途徑。我們之前的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)提示，制作合適的參考電極可適當(dāng)降低實(shí)驗(yàn)對(duì)象運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的高頻干擾，提高信噪比，但是具體的制作方法和實(shí)驗(yàn)效果并沒有經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的對(duì)比。

基于此，本實(shí)驗(yàn)室聚焦于參考電極的改良，從而優(yōu)化微絲電極陣列的制作，致力于記錄到比較理想的鋒電位(Spike)或動(dòng)作電位(action potential,AP)，這也是多通道電生理學(xué)研究面臨的挑戰(zhàn)之一。針對(duì)這一難題，我們通過(guò)將參考電極內(nèi)置或外置，同時(shí)自制內(nèi)置參考和外置參考微絲電極陣列，對(duì)比研究以探尋出穩(wěn)定排噪、高信噪比和抗環(huán)境干擾、高放電幅度的微絲電極陣列，為在體多通道電生理研究和腦機(jī)接口提供更可靠的植入橋梁。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司200～250 g的雄性SD大鼠，飼養(yǎng)在山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室，溫度：22～24℃，12/12 h晝夜循壞光照，食物充足、隨意飲水。電極埋置術(shù)前3～4只/籠飼養(yǎng)，術(shù)后1～2只/籠飼養(yǎng)。術(shù)后腹腔注射青霉素(2×105U)。動(dòng)物隨機(jī)分內(nèi)置參考電極組和外置參考電極組，術(shù)后一周連續(xù)檢測(cè)體重，剔除體重降低或增加不明顯、電極脫落或松動(dòng)的大鼠，最終內(nèi)置參考電極組(內(nèi)置組)8只、外置參考電極組(外置組)9只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及處理均經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與器材

制備電極耗材：鎳鉻合金絲、電路板、電極引腳、地線(Samtec)，AB膠(哥倆好)，1∶1攪拌混勻，Crazy膠，顯微鏡、冷光源、電烙鐵。

手術(shù)過(guò)程用品：1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)，手術(shù)器械(眼科剪、鑷子、碘伏、棉簽)，顱骨鉆、顱骨釘(長(zhǎng)2 mm，直徑1 mm)、液體石蠟，牙托水凝和牙托水(1∶1混合)，青霉素(2×105U)，大鼠腦立定位儀(NARISHIGE，JAPAN)。

BlackRock多通道記錄設(shè)備及Cerebus記錄系統(tǒng)及數(shù)據(jù)分選分析系統(tǒng)：

Cerebus(BlackRock，USA)，Central(BlackrRock,USA)，Offline Sorter3(Plexon，USA)，NeuroExplorer4(neuroexplorer，USA)。

1.3 微絲電極陣列制作過(guò)程

(1)Samtec接口的針腳對(duì)準(zhǔn)電路板的銅片(圖1a-1)，首先用焊錫固定電極兩側(cè)邊端(圖1a-2)，再逐步粘合其余接口，相鄰接口之間的焊錫不能接觸，以免發(fā)生短路(電極另一側(cè)同樣操作)；(2)將電極絲剪成200 mm左右的小段；(3)擺排電極絲(圖1a-4)，將剪好的電極絲并列擺放在電路板上,共8根，兩兩間隔200 μm左右；(4)剝掉絕緣層，用鑷子或電烙鐵刮掉電極絲外層包裹的絕緣層，暴露出鎳鉻合金電極導(dǎo)電部分；(5)將剝掉絕緣層的電極端插入已被焊錫焊接的Samtec接口與電路板的銅片之間(圖1a-5)。

Fig. 1 Schematic diagram of microwire electrode array and amplifier adapter

制作電極另一側(cè)，重上述2-5步驟；焊接地線，內(nèi)置參考電極(圖2a)：在電極一側(cè)的任意一端焊接一根銀絲作為地線，將剝掉一部分絕緣層的排列在電極陣列最外側(cè)的電極絲作為參考電極，焊接到電極另一端；外置參考電極(圖2b)：在電極一側(cè)的兩端焊接兩根銀絲，一根作為地線，另一根作為參考電極，在下置電極時(shí)，兩根電極均纏繞在顱骨釘上；AB膠1∶1混合粘粘電極引腳針腳與電路板銜接處(圖2c,2d)，一方面起到絕緣的作用，另一方面可保護(hù)裸露在外面的電極絲；在手術(shù)前，用眼科剪減掉電路板多余的部分，如圖1a中紅色“×”所示；根據(jù)目標(biāo)腦區(qū)的定位，剪斷電極絲(圖1a)，剩余電極絲應(yīng)長(zhǎng)出目標(biāo)腦區(qū)深度1～2 mm。

1.4 電極埋置手術(shù)

稱重：200～250 g的SD雄性大鼠；麻醉：45 mg/kg 的1%戊巴比妥鈉，腹腔注射；剃毛、碘伏消毒和剪皮；棉簽擦除粘膜和結(jié)締組織，暴露顱骨；定位：腦立體定位儀確定目標(biāo)腦區(qū)前扣帶皮層(anterior cingulate cortex,ACC)的范圍(圖3)；顱骨釘固定、開顱窗；夾持電極、將外置參考電極的地線和參考電極繞在已固定好的兩個(gè)顱骨釘上(圖3)，不少于10圈；內(nèi)置參考電極的地線繞在同側(cè)顱骨釘上，參考電極同微絲陣列一并植入至ACC腦區(qū)，電極植入速度1 μm/s、牙托水凝固定；蘇醒后放回鼠籠單獨(dú)或兩只一籠飼養(yǎng)，腹腔每天注射2×105U的青霉素，以防感染。

Fig. 2 Self-made microwire electrode array with built-in and external reference electrode

Fig. 3 The map of ACC location

1.5 多通道電生理記錄

術(shù)后監(jiān)測(cè)大鼠體重變化，7 d后挑選體重穩(wěn)定增長(zhǎng)、腦部電極無(wú)松動(dòng)、無(wú)脫落的健康大鼠進(jìn)行多通道電生理檢測(cè)，連接多通道記錄系統(tǒng)(圖4)，分別記錄內(nèi)置和外置參考電極組大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元放電情況，并對(duì)比觀察。

使用BlackRock公司的Cerebus系統(tǒng)實(shí)時(shí)記錄大鼠ACC神經(jīng)元的鋒電位(spike)或動(dòng)作電位(action potential,AP)。Central軟件用于實(shí)時(shí)記錄，設(shè)置采樣率為1 kS/s，場(chǎng)電位濾波為低頻250 Hz，動(dòng)作電位或峰電位(Spike)參數(shù)為神經(jīng)元特有的BP 250 Hz～5 kHz；Offline Sorter3軟件用于分選動(dòng)作電位，可過(guò)濾掉實(shí)時(shí)記錄到的意外噪音，根據(jù)神經(jīng)元放電特征和差異，用主成分分析法篩選出每個(gè)記錄通道不同神經(jīng)元的放電類型；NeuroExplorer4軟件用于導(dǎo)出放電圖譜和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，經(jīng)Sorter之后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入NeuroExplorer可直觀不同通道不同神經(jīng)元放電頻率和對(duì)應(yīng)的原始圖譜。

Fig. 4 Schematic diagram of a multi-channel electrophysiological connection device

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩種電極記錄到的大鼠ACC腦區(qū)的神經(jīng)元放電情況

電極埋置一周后，將大鼠放在可自由活動(dòng)的用錫箔紙包裹的屏蔽箱內(nèi)(排除干擾)，記錄大鼠自由活動(dòng)時(shí)ACC腦區(qū)神經(jīng)元的放電活動(dòng)。內(nèi)置和外置參考電極組大鼠均可記錄到ACC的神經(jīng)元放電信號(hào)(圖5)，證明兩種電極被成功制作。

Fig. 5 Neuron firings recorded by microwire electrode array with built-in and external reference electrode

2.2 兩種電極記錄到的大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的放電信噪比情況

信噪比可顯示出混在背景噪音里的神經(jīng)元實(shí)際的放電信號(hào)[12]。在多通道電生理記錄中，最常使用連接地線的方法排除環(huán)境和自身運(yùn)動(dòng)干擾，或者采用不同直徑的電極絲來(lái)適當(dāng)降低阻抗，但在特定直徑的電極耗材和無(wú)法完全杜絕環(huán)境噪音的情況下，記錄到大鼠神經(jīng)元放電的信噪比還不能達(dá)到理想的目標(biāo)，尤其是面對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象自由活動(dòng)這一難題。

此實(shí)驗(yàn)分別使用內(nèi)置或外置參考電極的微絲電極陣列，通過(guò)對(duì)比觀察，內(nèi)置組大鼠的Spike放電信噪比均顯著高于外置組(內(nèi)置vs外置：4.738± 0.368vs2.878±0.434，n=8)，P<0.05，圖6)。此外，在大鼠自由活動(dòng)或有不可避免的環(huán)境噪音干擾時(shí)，內(nèi)置電極組可顯示出較好抗干擾能力，具有較穩(wěn)定的Spike波形，適合長(zhǎng)時(shí)間記錄；外置電極組神經(jīng)元電信號(hào)則會(huì)受大鼠運(yùn)動(dòng)和環(huán)境噪音的干擾，放電波形不穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間記錄不理想。

Fig. 6 Spike waveform and signal-to-noise ratio statistic graph of built-in and external groups

2.3 兩種電極記錄到的大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的放電幅度情況

實(shí)驗(yàn)記錄過(guò)程中，還發(fā)現(xiàn)參考電極內(nèi)置后記錄的放電信號(hào)波幅更深，幅度更大。用NeuroExplorer導(dǎo)出原始放電圖(圖7a-b)后可以明顯看到內(nèi)置組電信號(hào)幅度較外置組大，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，內(nèi)置組的波幅為：(0.339±0.014)mv，n=380，外置組波幅為：(0.177±0.008)mv，n=675，兩者之間有顯著性差異(P<0.05)。

Fig. 7 The original discharge diagram and the statistical results of the amplitude of the built-in and the external groups

2.4 兩種電極記錄到的大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的放電頻率情況

雖然上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)置或外置微絲電極陣列的參考電極后均能記錄到大鼠ACC的神經(jīng)元放電信號(hào)，內(nèi)置參考電極組大鼠具有更高的信噪比和抗干擾能力，且內(nèi)置參考電極記錄的放電信號(hào)具有更大放電幅度。但是應(yīng)用這兩種方法制作的電極是否會(huì)影響大鼠腦區(qū)的放電頻率的記錄？為了解決這一疑惑，我們將大鼠的放電頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，發(fā)現(xiàn)兩組大鼠的放電頻率并沒有顯著差異(內(nèi)置vs外置：1.800(1.201，2.625)vs1.700(1.075，2.325)，n=54，P>0.05)，說(shuō)明內(nèi)置或外置參考電極的微絲電極陣列均可穩(wěn)定記錄大鼠的放電頻率。

3 討論

多通道電生理技術(shù)采用細(xì)胞外記錄的方法[19]，采集電極記錄點(diǎn)附近神經(jīng)元集群產(chǎn)生的場(chǎng)電位和動(dòng)作電位(圖4-5),雖然細(xì)胞外記錄采集到的神經(jīng)元放電波幅僅是細(xì)胞內(nèi)記錄的百分之一[15]，但因其操作簡(jiǎn)易、高通量記錄、可長(zhǎng)期多次重復(fù)測(cè)試以及實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在體記錄等優(yōu)點(diǎn)[20]而廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域[21,22]。當(dāng)機(jī)體受到外界不同刺激時(shí)，應(yīng)用多通道電生理監(jiān)測(cè)多個(gè)腦區(qū)神經(jīng)元群體的放電特征，通過(guò)數(shù)模轉(zhuǎn)化和集成分析對(duì)具體事件的神經(jīng)元信息進(jìn)行編碼[19]。同時(shí)，將已經(jīng)編碼的神經(jīng)元信號(hào)輸入至攝像機(jī)和人工耳蝸等治療器械，特異性刺激已受損的神經(jīng)中樞，從而激活相應(yīng)核團(tuán)，實(shí)現(xiàn)腦機(jī)接口的治療目的。

微絲電極陣列是多通道電生理技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量記錄必不可少的工具之一，其硬度剛好可以抵抗腦組織產(chǎn)生的阻力，在以一定速度緩慢下降后可順利到達(dá)目標(biāo)腦區(qū)，不會(huì)發(fā)生彎曲或折斷[12]。微絲電極植入特定腦區(qū)后，記錄到的神經(jīng)元放電波形和幅度與電極記錄點(diǎn)距離神經(jīng)元胞體的位置、角度等有關(guān)[9]；所記錄神經(jīng)元放電信號(hào)的質(zhì)量和信噪比與電極自身的制作及手術(shù)過(guò)程有關(guān)[13]，所以，為了盡可能避免制作手藝帶來(lái)的困擾，在電極切割時(shí)使用鋼質(zhì)剪刀干脆利落的剪斷電極絲，減少絕緣層粘連現(xiàn)象，暴露出盡可能多的記錄面積以減小阻抗。然而，原始剪刀切割法與新型的微切割[13]方法相比仍是相形見絀，但目前微切割在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室并不普遍。因此，在實(shí)驗(yàn)室條件允許的情況下，成熟的地線連接方法和選擇適合的參考電極顯得格外重要。在多通道電生理實(shí)驗(yàn)中，地線通過(guò)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與大地相連接以制造零電勢(shì)或等電勢(shì)磁場(chǎng)，達(dá)到排除電磁干擾的目的。

參考電極是整個(gè)微絲陣列記錄電極的參照，以采集到的參考通道里的信號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)差分計(jì)算可得到記錄電極的放電情況，即記錄通道實(shí)際記錄信號(hào)減去參考通道信號(hào)后經(jīng)放大器輸出至電腦顯示器端的濾波是最終放電信號(hào)，所以，當(dāng)參考電極內(nèi)置時(shí)，與微絲記錄電極一同直接采集腦內(nèi)神經(jīng)元放電，具有相同的背景，因此它們所記錄數(shù)值之間的差異較小，即使受到外界或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物自身噪音干擾，差分計(jì)算后差值并不會(huì)有明顯變化。而參考電極外置時(shí)，通過(guò)顱骨釘間接采集腦神經(jīng)元的放電，參考通道與記錄通道環(huán)境差異較大，信號(hào)背景差異大且不穩(wěn)定，更易受外來(lái)噪音和自身活動(dòng)時(shí)自身組織放電的干擾。此外，胞外間接記錄到的神經(jīng)元放電波幅是胞內(nèi)直接記錄的1/100左右[15]，類似的，當(dāng)參考電極內(nèi)置時(shí)，差分得到的記錄電極的放電幅度更高，而外置的參考電極由于離記錄電極較遠(yuǎn)，所以記錄通道中的放電波幅也就更小。

為了提高微絲電極陣列的記錄性能，本實(shí)驗(yàn)室同時(shí)制備了內(nèi)置與外置參考電極的微絲電極陣列，通過(guò)橫縱對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在不影響大鼠放電頻率的同時(shí)，內(nèi)置參考電極微絲電極陣列在記錄ACC神經(jīng)元放電過(guò)程中有更高的信噪比、優(yōu)異的抗干擾能力和較大的放電幅度。除此之外，手術(shù)方面的注意事項(xiàng)有：第一，清除出血和雜質(zhì)，保持創(chuàng)面干凈；第二，下電極之前繞地線(10圈以上)，以免對(duì)電極牽拉影響其位置及電極尖端阻抗；第三，電極下降前期，速度盡可能慢，以1 μm/s為宜，后期可適當(dāng)增快到2 μm/s，以防電極彎曲，同時(shí)可節(jié)省時(shí)間；第四，在用牙托水凝固定電極前，先在傷口部位涂滴液體石蠟，可減小牙托水凝對(duì)創(chuàng)口的刺激；第五，在術(shù)后一周之內(nèi)，每天連接Headstage至少5 min ,使大鼠提前適應(yīng)記錄時(shí)的場(chǎng)景和感覺，以防在正式實(shí)驗(yàn)時(shí)抗拒動(dòng)作過(guò)強(qiáng)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室同時(shí)制做了內(nèi)置和外置參考電極微絲電極陣列，經(jīng)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)置參考電極微絲電極陣列在記錄ACC腦區(qū)神經(jīng)元電活動(dòng)時(shí)，信噪比高、背景信號(hào)幅度小、抗干擾能力強(qiáng)，放電幅度大，為多通道電生理技術(shù)提供更加可靠的工具。