馬 媛，荀 敬，王波濤，李棣華，張 琦，王震宇，吳 瑜

(1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)南開臨床學(xué)院，天津市急腹癥器官損傷與中西醫(yī)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300100；3.天津醫(yī)科大學(xué)南開臨床學(xué)院，肝膽胰外科三，天津 300100；4.天津醫(yī)科大學(xué)南開臨床學(xué)院，胃腸外科三，天津 300100)

食管癌(esophageal cancer,EC)是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一[1]。研究表明，腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是腫瘤細(xì)胞中具有自我更新和分化潛能并具有起始腫瘤發(fā)生能力的細(xì)胞亞群，這種無限制的增殖和分化，且能夠轉(zhuǎn)移和侵襲其他器官和組織的特性，即為癌細(xì)胞干性，同時(shí)也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的根本原因[2]。因此，探尋有效的抗CSCs藥物，對于抑制食管癌進(jìn)展具有重要的意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，旋覆代赭湯(Xuanfu Daizhe decoction,XDD)具有“和胃降逆”之功效，旋覆代赭湯出自張仲景《傷寒論·辨太陽病脈證并治下》：“傷寒發(fā)汗，若吐若下，解后心下痞硬，噫氣不除者，旋覆代赭湯主之”。全方由旋覆花、代赭石、半夏、生姜、人參、炙甘草、大棗7味藥組成[3]，主治胃虛痰阻氣逆證，證見胃脘痞悶或脹滿，按之不痛，頻頻噯氣，或見納差、呃逆、惡心，甚或嘔吐，舌苔白膩，脈緩或滑。此方為理氣劑，具有降逆化痰，益氣和胃之功效，根據(jù)中醫(yī)“異病同治”理論，“胃失和降，胃氣上逆”者，應(yīng)用此方辨證論治均具有顯著療效，例如旋覆代赭湯在抗炎[4,5]、鎮(zhèn)吐[6]、促胃動(dòng)力上[7]療效顯著，臨床上常用于治療胃食管反流病、功能性消化不良、胃癱等疾病[8]，但多為臨床療效觀察，對其明確療效及作用機(jī)制研究仍不清楚。因此，研究旋覆代赭湯對食管癌的發(fā)生發(fā)展具有非常重要的意義。

已有報(bào)道指出，胃食管反流病是導(dǎo)致食管癌發(fā)生的至關(guān)重要因素[9,10]，但關(guān)于旋覆代赭湯抗腫瘤作用的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究通過檢測旋覆代赭湯對食管癌腫瘤生長及干性相關(guān)標(biāo)志物NANOG(Nanog homeobox)、OCT4(organic cation/carnitine transporter4)、SOX2(SRY-box transcription factor 2)[11]的表達(dá)、ALDH(aldehyde dehydrogenase)活性以及腫瘤細(xì)胞的成球能力等，研究旋覆代赭湯對食管癌細(xì)胞干性的影響，為旋覆代赭湯作為抑制食管癌惡性轉(zhuǎn)化的有效藥物提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 旋覆代赭湯組方的配制

按照《傷寒論》中旋覆代赭湯的配比，制備湯劑，組方為：旋覆花15 g，代赭石5 g，生姜25 g，半夏15 g，人參10 g，炙甘草15 g，大棗10 g(4枚)，一副藥共95 g(飲片，購自天津市南開醫(yī)院中藥房)。加入十倍水，提取2次，每次1 h，煎煮后用旋蒸器濃縮至1 g/ml的含藥液，-20℃保存。組方中的中藥材購買于天津市南開醫(yī)院中藥房。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10只健康6～8周齡SPF級(jí)BALB/c雌性裸鼠，動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(津)2015-0007。經(jīng)天津市南開醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(NKYY-DWLL-2020-001)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

BALB/c裸鼠隨機(jī)分為對照組與實(shí)驗(yàn)組，每組5只，實(shí)驗(yàn)組每日旋覆代赭湯按9.89 g/kg灌胃(根據(jù)人與動(dòng)物等效劑量系數(shù),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量為常規(guī)用藥6.25倍，按成年人體重為60 kg計(jì)算，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥量:95 g/60 kg×6.25)，對照組每日等容積生理鹽水灌胃處理，一日一次，在給予灌胃第8日時(shí)右側(cè)背部皮下接種5×106細(xì)胞數(shù)量的人源食管癌ECA-109細(xì)胞，之后連續(xù)灌胃28 d。

每周兩次測量腫瘤大小，用游標(biāo)卡尺測出腫瘤最長和最寬處，再用公式長×寬2/2計(jì)算出腫瘤體積；小鼠處死后，取血置于EP管中，4℃靜置4 h后，取上層血清至新的EP管中，-20℃保存；腫瘤組織稱量大小并拍照，分別取50 mg提取RNA和蛋白質(zhì)，另取一部分放入4%的多聚甲醛中，剩余部分-80℃ 保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)試劑:培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、雙抗、生理鹽水、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，游標(biāo)卡尺(艾瑞澤，ARZ-150)，成球?qū)嶒?yàn)及相關(guān)成長因子B-27、hEGF、hFGF(Gibco公司，批號(hào)2226812；BIO-TECH公司，批號(hào)E10504121、J10402062)，病理、包埋盒，蘇木素染液(批號(hào):70060020)，RT-PCR和熒光定量PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào):O10306)，蛋白定量試劑盒(Thermo公司，批號(hào):VA289349) ，兔源 ALDH、NANOG、COT4、SOX2抗體(Abcam公司，批號(hào)：GR3236296-11)，HRP偶聯(lián)二抗(中杉金橋公司，批號(hào):ZA-2301)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳液，聚偏氟乙烯(PVDF)膜，等滲緩沖鹽溶液(TBST)，DAB底物緩沖液(Burlingame公司，批號(hào):ZG0901)，ALDH活性檢測試劑盒(STEMCELL公司，批號(hào)：1000020662)。

實(shí)驗(yàn)儀器:細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal Force，型號(hào)：HF240)，倒置顯微鏡(美國Leica公司，型號(hào):D-35578)，水浴鍋(上海一恒，型號(hào)：HWS-26)，水平搖床(Thermo公司，型號(hào):SHKE2000-1CE)，電泳儀 (美國BioRad公司，型號(hào):042BR18385)，轉(zhuǎn)膜儀(美國BioRad公司，型號(hào)：221BR55398)化學(xué)發(fā)光分析儀(美國BioRad公司，型號(hào):ChemiDoc XRS)，PCR擴(kuò)增儀(美國BioRad公司，型號(hào):T100)，離心機(jī)(美國Eppendorf公司，型號(hào):5404EK418270)，酶標(biāo)儀(上?？迫A，型號(hào)：ST-360)，全自動(dòng)自動(dòng)脫水儀(美國Leica公司，型號(hào)：ASP200S)，包埋機(jī)(美國Leica公司，型號(hào)：EG1150H+C)，切片機(jī)(美國Leica公司，型號(hào)：RM2235)，攤片機(jī)(美國Leica公司，型號(hào)：H1210)，烤片機(jī)(美國Leica公司，型號(hào)：H1220)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

將食管癌細(xì)胞ECA-109接種到六孔板上，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后，分別用動(dòng)物模型中取的體積分?jǐn)?shù)10%的正常裸鼠血清和旋覆代赭湯含藥血清處理食管癌細(xì)胞48 h。

1.6 RT-PCR(實(shí)時(shí)熒光定量 PCR)

在PubMed基因數(shù)據(jù)庫查得人GAPDH、NANOG、OCT4、SOX2、ALDH mRNA信息，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物如下：GAPDH，上游引物:5’CTCTGATTTGGTCGTATTGGG3’，下游引物:5’TGGAAGATGGTGATGGGATT 3’；NANOG，上游引物:5’TCTGGACACTGGCTGAATCCT，下游引物:5’CGCTGATTAGGCTCCAACCAT；OCT4，上游引物:5’GCTCGAGAAGGATGTGGTCC，下游引物:5’CGTTGTGCATAGTCGCTGCT；SOX2，上游引物:5’GCCTGGGCGCCGAGTGGA，下游引物:5’GGGCGAGCCGTTCATGTAGGTCTG；ALDH，上游引物:5’CGGGAAAAGCAATCTGAAGAGGG，下游引物:5’GATGCGGCTATACAACACTGGC各組細(xì)胞PBS洗一次(各組腫瘤組織取黃豆粒大小至EP管中)，提取RNA，立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR檢測，分析各樣品的CT值，采用2-ΔΔt法分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.7 Western blot (蛋白質(zhì)印跡法)

各組細(xì)胞PBS洗一次(各組腫瘤組織取黃豆粒大小)，提取蛋白質(zhì)，檢測蛋白質(zhì)濃度，加入Loading Buffer金屬浴變性后，在SDS-PAGE電泳液中進(jìn)行電泳1 h，之后在濕轉(zhuǎn)槽中將蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜，5%TBST配的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜，TBST洗3次，加入二抗，室溫1 h，ELC化學(xué)發(fā)光法曝光條帶。

1.8 免疫組化

收取小鼠的腫瘤組織，取適量大小放入包埋盒中,4%多聚甲醛浸泡，脫水進(jìn)蠟，包埋，切片(4 mm)，烘箱中過夜，脫蠟，抗原修復(fù)，全程避光，PBS洗3次，滴加去除內(nèi)源性過氧化物酶室溫孵育10 min，PBS洗3次，5%的山羊血清室溫封閉30 min，之后滴加一抗，4℃過夜，PBS洗3次，滴加二抗，37℃水浴30 min，PBS洗3次，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素37℃水浴30 min，PBS洗3次，滴加現(xiàn)配的DAB顯色液，2～5min后明顯變色，自來水中終止變色并水洗，滴加蘇木素后自來水終止染色并水洗反藍(lán)，脫水處理，擦干切片后滴加中性樹膠封片，晾干后顯微鏡下觀察。

1.9 ALDH活性檢測

將旋覆代赭湯血清處理48 h后的食管癌細(xì)胞與對照組的食管癌細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，取1×106個(gè)，用1 ml活化后的ALDEFLUORTMbuffer重懸細(xì)胞于流式管①中，在①中加入5 μl的ALDEFLUORTM試劑，混勻，吸取500 μl細(xì)胞懸液于流式管②中，在②中加入5 μl DEAB試劑混勻，將處理好的細(xì)胞置于37℃孵育40 min，之后4℃離心4 000 r/min，5 min，棄上清，用0.5 ml ALDEFLUORTMbuffer重懸細(xì)胞，置于冰上待上機(jī)，之后上機(jī)分析檢測結(jié)果。

1.10 成球?qū)嶒?yàn)

用非黏附的六孔板，分別為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每孔加入5 000個(gè)食管癌ECA-109細(xì)胞，2.7 ml DMEM(其中每10 ml DMEM中加入生長因子B-27 50 × 200 μl、hEGF 1 μl、hFGF 1 μl)，300 μl動(dòng)物模型中收取的正常裸鼠血清和旋覆代赭湯含藥血清，7 d后顯微鏡下拍照并分析結(jié)果。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 旋覆代赭湯對小鼠食管癌腫瘤生長的影響。

對構(gòu)建的食管癌皮下腫瘤小鼠給予不同處理(圖1A)，結(jié)果顯示，對照組小鼠形態(tài)消瘦、活動(dòng)遲緩、少動(dòng)、出現(xiàn)聲音時(shí)迅速聚在角落、目光晦暗無神、皮膚疏松無光澤；實(shí)驗(yàn)組小鼠體型較瘦，一般狀況良好，飲水?dāng)z食正常，皮膚略疏松。而且，與對照組相比，旋覆代赭湯組(實(shí)驗(yàn)組)組顯著抑制小鼠腫瘤的生長和腫瘤大小(P<0.01，P<0.05，圖1B,C,D)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，旋覆代赭湯具有抑制食管癌腫瘤生長的作用。

2.2 旋覆代赭湯對小鼠腫瘤組織中干性相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響。

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示(表1)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NANOG、OCT4、SOX2以及ALDH的mRNA水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)；Western blot檢測結(jié)果顯示(圖2A，表2)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中NANOG、OCT4、SOX2的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)；免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果顯示(圖2B，表3)，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中NANOG、OCT4、SOX2的陽性細(xì)胞的分布顯著低于對照組(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，旋覆代赭湯抑制腫瘤組織中干性相關(guān)基因的表達(dá)。

Fig. 1 Xuanfu Daizhe decoction inhibits the growth of esophageal cancer xenografts in mice

Fig. 2 Expressions of stemness-related genes in tumor tissues of mice in each group

Tab. 1 The mRNA expression levels of tumor-related stemness transcription factors NANOG,OCT4,SOX2 and ALDH in mouse tumor tissues n=5)

Tab. 2 The protein expression levels of tumor-related stemness transcription factors NANOG,OCT4,SOX2 in mouse tumor tissues n=5)

Tab. 3 The levels of tumor-related stem transcription factors NANOG,OCT4 and SOX2 determined by immunohistochemistry in mouse tumor tissues n=5)

2.3 旋覆代赭湯復(fù)方血清對食管癌細(xì)胞干性的影響

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示(表4)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞中干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NANOG、OCT4、SOX2以及ALDH的mRNA水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)；Western blot檢測結(jié)果顯示(圖3A，表5)，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞中干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NANOG、OCT4和SOX2的蛋白水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示(圖3B，表6)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞中ALDH酶活性顯著低于對照組(P<0.01)；成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示(圖3C，表6)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞的成球數(shù)量顯著減少(P<0.01)。以上體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，旋覆代赭湯復(fù)方血清抑制食管癌細(xì)胞的干性。

Fig. 3 The effects of mouse serum in each group on the stemness of esophageal cancer cells

Tab. 4 The mRNA expression levels of stem-related genes NANOG,OCT4,SOX2 and ALDH in the cells n=3)

Tab. 5 The protein expression levels of stem-related genes NANOG,OCT4 and SOX2 in the cells n=3)

Tab. 6 The changes in intracellular ALDH enzyme activity and cell numbers into spheroids n=3)

2.4 旋覆代赭湯復(fù)方血清對食管癌細(xì)胞中AKT磷酸化水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示(圖4，表7)，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞中p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05)。結(jié)果提示，旋覆代赭湯可能通過抑制p-AKT抑制食管癌細(xì)胞的干性。

Fig. 4 The effects of mouse serum in each group on the expression of AKT and p-AKT in esophageal cancer cells

Tab. 7 The protein levels of AKT and p-AKT in esophageal cancer ECA-109 cells treated with mouse serum in each group n=3)

3 討論

食管癌是我國腫瘤類型中的高發(fā)疾病[1,12]，其全球發(fā)病率也呈上升趨勢[13,14]。研究表明，食管癌干細(xì)胞是具有自我更新、多向分化潛能及致瘤能力的細(xì)胞亞群，是引起腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥等的根本原因[2]。因此，探尋有效的抑制食管癌細(xì)胞干性的藥物具有重要意義。

從中醫(yī)理論上講，食管癌的病因病機(jī)多為飲食不節(jié)，七情內(nèi)傷，久病體虛所導(dǎo)致的痰凝，氣郁，氣結(jié)血瘀，而致食道窒塞不通，故本病在治療時(shí)應(yīng)以健脾理氣，降逆化痰，活血散結(jié)，滋陰清熱為治療原則。全方中旋覆花苦辛，降逆氣消痰；代赭石生血涼血，而其質(zhì)重墜，又善鎮(zhèn)逆氣，降痰涎止嘔吐，通燥結(jié)；甘草、大棗和中；人參、清半夏降氣和胃化痰。因此，該方具有主治汗、吐、下后表邪已解而脾胃中氣受傷，胃氣因虛上逆，以致心下痞硬，噫氣不除之證，主“和胃降逆”之功。全方配伍切中食管癌的病因病機(jī)，臨床上有很好的治療效果[15-18]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，旋覆代赭湯對治療胃食管反流病療效顯著[19,20]。已有報(bào)道指出，胃食管反流病是導(dǎo)致食管癌發(fā)生的至關(guān)重要因素[21]。因此，研究旋覆代赭湯對食管癌發(fā)生發(fā)展的影響，對于尋找治療食管癌的有效藥物具有重要臨床價(jià)值。

本研究對構(gòu)建的小鼠食管癌腫瘤進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)，旋覆代赭湯可顯著抑制腫瘤的生長和大小，說明旋覆代赭湯具有抑制食管癌作用。基于腫瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，提示旋覆代赭湯可能抑制食管癌細(xì)胞的干性。本研究的體內(nèi)和體外結(jié)果顯示，旋覆代赭湯可顯著抑制食管癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性：降低干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH的表達(dá)和活性，顯著抑制干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NANOG、SOX2和OCT4的表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞的成球能力。因此，本研究表明旋覆代赭湯在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑制作用。

此外，研究表明，PI3K/AKT信號(hào)是調(diào)控腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵通路[22]，該信號(hào)的異?；罨c腫瘤惡性程度成正相關(guān)關(guān)系，具有誘導(dǎo)和維持腫瘤細(xì)胞干性的作用[23-25]。Wang.Z等人的研究發(fā)現(xiàn)[26]，AKT能夠促進(jìn)SOX2的過表達(dá)及其磷酸化，抑制SOX2與泛素E3連接酶UBR5的相互作用，從而穩(wěn)定SOX2的蛋白水平，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的干性。因此，本研究檢測了磷酸化的AKT蛋白水平。結(jié)果顯示，旋覆代赭湯復(fù)方血清可顯著抑制食管癌細(xì)胞中AKT的磷酸化水平。這提示，旋覆代赭湯可能通過抑制PI3K/AKT通路抑制食管癌細(xì)胞的干性，進(jìn)而抑制食管癌進(jìn)展。然而，旋覆代赭湯調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)旋覆代赭湯能夠抑制食管癌細(xì)胞的干性：抑制食管癌腫瘤的生長和大小，降低ALDH的表達(dá)和活性，抑制干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NANOG、SOX2和OCT4表達(dá)及腫瘤細(xì)胞的成球能力；PI3K/AKT信號(hào)通路可能介導(dǎo)旋覆代赭湯對食管癌細(xì)胞干性的抑制作用。本研究結(jié)果將為食管癌治療探尋新的有效藥物提供理論依據(jù)。