金家豪，趙寶生，劉玉珍△

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院胸外科，2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院生命科學研究中心，河南 衛(wèi)輝 453100)

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率均居第一位的對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]。近年來，中國肺癌的發(fā)病率逐年升高，盡管目前外科手術(shù)和放化療技術(shù)已取得顯著進展，并且靶向藥物也在不斷更新，但由于肺癌病程進展快加之其高轉(zhuǎn)移性，導致肺癌患者五年生存率普遍較低[2]。目前對肺腺癌轉(zhuǎn)移缺乏有效治療方法，因此闡明肺腺癌細胞在低氧條件下遷移的機制對于治療肺腺癌、提高患者生存率十分必要。

腫瘤細胞遠高于普通細胞的能量需求注定了其具有特殊的能量代謝途徑。與正常細胞相比，腫瘤組織的能量供應(yīng)更依賴于增加內(nèi)源性脂質(zhì)的生成[3]，脂質(zhì)代謝在腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4]。低氧影響脂肪酸代謝，通過調(diào)控多個相關(guān)酶改變腫瘤細胞代謝進程[5]。低氧對于肺癌的進展尤其是轉(zhuǎn)移具有重要的影響[6]，低氧的直接效應(yīng)因子HIF-1α在肺癌組織的壞死區(qū)域含量高[3]并被證實與腫瘤轉(zhuǎn)移的不良預后相關(guān)[7]，ACC1是脂肪酸合成的限速酶，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)低氧處理肺腺癌A549細胞會促進其遷移并上調(diào)ACC1表達，影響EMT相關(guān)蛋白E-cadherin與Vimentin的表達[8]，但低氧如何調(diào)控ACC1并促進A549細胞遷移，相關(guān)機制尚不明確。本研究旨在探討低氧在肺腺癌細胞中上調(diào)ACC1表達的機制及低氧通過上調(diào)ACC1促進肺腺癌細胞遷移的機制。本研究通過使用HIF-1α抑制劑及RNA干擾技術(shù)先后抑制HIF-1α作用，并分別敲低ACC1、SREBP-1，觀察低氧對于A549細胞遷移的影響，進一步探討低氧促進A549細胞遷移的分子機制，為探索肺腺癌新的治療靶點提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細胞A549購于上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司。采用含10%胎牛血清、100 U/ml 青鏈霉素、100 mg/ml 青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和抗體

胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Clark，DMEM培養(yǎng)基購自Coming；青鏈霉素購自北京索萊寶科技有限公司，慢病毒ACC1-shRNA及對照shRNA由上海吉瑪基因生物公司合成；PX-478購自美國 APExBIO 公司，LA購自碧云天，Transwell小室購自美國Corning公司；用以敲減SREBP-1的si-RNA序列(5'-CUCCUGCUUGAGUUUCUGGTT-3')由上海吉瑪基因公司合成，PCR試劑盒QuantiNova? Reverse Transcription Kit與QuantiNova? SYBR? Green PCR Kit購自QIAGEN公司，兔源單克隆抗體E-cadherin(1∶1 000)購自CST公司，兔源多克隆抗體ACC1(1∶1 000)購自CST公司，兔源多克隆抗體Vimentin(1∶1 000)、SREBP-1(1∶1 000)抗體購自萬類生物技術(shù)有限公司，兔源多克隆抗體HIF-1α(1∶1 000)購自Proteintech公司，兔源多克隆抗體β-actin(1∶1 000)購自武漢博士德公司。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶8 000)二抗購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，P0018M超敏化學發(fā)光試劑盒(enhanced chemiluminescence,ECL)購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 主要儀器

低氧小室購自STEMCELL(Catalog # 27310)，SW-CJ-2D層流超凈臺購自中國蘇州凈化公司，Scientific1385生物安全柜購自美國Thermo公司，55i DS-Filc倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)購自日本Nikon公司，QuantStudioTM實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)系統(tǒng)購自美國Life technologies公司，Multiskan Spectrum酶標儀購自美國Thermo公司，蛋白電泳、轉(zhuǎn)印儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.4 細胞培養(yǎng)

將A549接種在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2.5 d傳代一次，細胞呈單層貼壁生長。

1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染

常規(guī)培養(yǎng)細胞，獲得2小皿(每皿2×105cells)A549細胞。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，取出待用。取1.5 ml 離心管2個，各加入500 μl DMEM完全培養(yǎng)基及500 μl DMEM基本培養(yǎng)基，分別加入Polybrene各1.6 μl，關(guān)掉風機，EP管中加入提前分裝好的ACC1-shRNA及對照shRNA，混勻靜置5 min，打開風機。用PBS沖洗細胞2遍，每皿加入1 ml病毒，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱。6 h后每皿各加1 ml DMEM完全培養(yǎng)基，次日每皿加嘌呤霉素4 μl，待細胞長滿后檢測ACC1是否敲低。數(shù)次篩選后培養(yǎng)出穩(wěn)定敲低ACC1的A549細胞系。

1.6 siRNA轉(zhuǎn)染方法

細胞接種于小皿中，待融合度達到35%后進行轉(zhuǎn)染。采用Lipo 2000細胞轉(zhuǎn)染試劑盒，按照說明書進行轉(zhuǎn)染。設(shè)置對照組(NC，空白細胞)與敲減組，細胞轉(zhuǎn)染48 h后，進行后續(xù)Transwell細胞遷移實驗及蛋白質(zhì)免疫印跡實驗。

1.7 Transwell細胞遷移實驗

將Transwell小室放入24孔板內(nèi)，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基制備細胞懸液，調(diào)整濃度為2 × 105cells/ml，取200 μl(含細胞數(shù)4×104)加入Transwell上室，24孔板下室加入600 μl含胎牛血清的培養(yǎng)基，將常氧對照組置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將低氧組24孔板放入5% O2的專用低氧裝置中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出小室；采用4%的多聚甲醇固定15 min后0.1%結(jié)晶紫染色8 min，棉簽擦去上室內(nèi)的細胞。顯微鏡下每孔選取5個視野在10倍鏡下進行拍照計數(shù)，取平均值表示細胞的遷移數(shù)目；同樣方法檢測亞油酸(LA)處理后sh-NC及sh-ACC1組遷移的變化。

1.8 Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達

檢測低氧處理以及低氧處理并加入HIF-1α抑制劑PX-478(25 μmol)后A549細胞HIF-1α、SREBP-1、ACC1、E-cadherin、Vimentin蛋白表達變化，檢測常氧及低氧條件下分別給予sh-NC與sh-ACC1的A549細胞以LA(20 μmol)處理后E-cadherin與Vimentin蛋白表達變化；將處于對數(shù)生長期的細胞按照分組進行處理36 h，用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解細胞后提取細胞總蛋白，通過 BCA 法測定蛋白濃度(根據(jù)BCA試劑盒說明書進行操作)。以每組30 μg的等量蛋白樣品上樣，用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，再用5%的脫脂奶粉在常溫下封閉1 h，加入ACC1、E-cadherin、Vimentin等一抗4℃過夜，用TBST洗膜后(10 min × 3次)，加入辣根過氧化物酶標記兔抗 IgG (1∶8 000)室溫搖床上孵育1 h，再洗膜30 min，除去未結(jié)合的二抗，最后根據(jù)說明書按照1∶1配置ECL工作液,用凝膠成像儀成像；利用計算機軟件Image J(版本號：V1.48)進行灰度值分析。

1.9 實時熒光PCR檢測相關(guān)mRNA的表達

分別收集經(jīng)常氧，5%O2，常氧 + PX-478(25 μmol)及5% O2+ PX-478(25 μmol)處理24 h后的A549細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，通過QUANT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。所需引物由吉凱基因公司合成，引物序列見表1。采用QuantStudioTMRT-qPCR系統(tǒng)，以SYBR1法檢測ACC1與SREBP-1表達水平，β-actin作為內(nèi)參，得到擴增曲線和Ct值，應(yīng)用2-ΔΔCt法分析基因相對表達量?；蛳鄬Ρ磉_量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(待測組目的基因平均Ct值-待測組管家基因平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct值-對照組管家基因平均Ct值)。

1.10 低氧小室低氧處理細胞

按照說明書進行，具體步驟簡要如下：打開低氧小室的進氣口和出氣口，將進氣端口Tygon? 管連接到含有5% O2-5% CO2-90% N2混合氣的氣源，以20 L/min的速度吹掃腔室5 min，隨后在斷開氣源的同時迅速關(guān)閉進氣口與出氣口環(huán)形夾，密封腔室后置于常規(guī)的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。低氧處理結(jié)束后，將低氧小室取出，打開出氣口環(huán)形夾時若能聽到“噗”的放氣聲音，說明小室未漏氣，低氧處理成功。

1.11 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 低氧通過HIF-1α對A549細胞遷移的影響

常氧及5% O2分別處理A549細胞，Western blot 檢測到A549細胞低氧處理后上調(diào)HIF-1α與ACC1表達(P均<0.01)；與常氧組相比，Transwell實驗顯示低氧處理促進A549細胞遷移(175.0±7.3vs245.0±11.2，P<0.01)；給予A549細胞低氧并給予HIF-1α抑制劑PX-478(25 μmol)，與低氧組相比，加入HIF-1α抑制劑PX-478(25 μmol)后，抑制低氧對A549細胞的促遷作用(245.0±11.2vs203.0±10.3，P<0.05，圖1，表2)。

Fig. 1 The effect of hypoxia on the migration of A549 cells via HIF-1α

2.2 低氧通過HIF-1α對A549細胞SREBP-1 mRNA水平與ACC1 mRNA水平的影響

常氧及5% O2分別處理A549細胞；PCR檢測到低氧處理后A549 細胞ACC1 mRNA上升(P<0.05)，SREBP-1 mRNA上升(P<0.01)；低氧并使用PX-478處理A549細胞24 h后，A549細胞ACC1 mRNA水平較低氧對照組下降(P<0.05)，SREBP-1 mRNA水平較低氧對照組下降(P<0.01，表3)。

Tab. 2 The expression levels of HIF-1α and ACC1 determined by Western blot analyses under hypoxia and inhibition HIF-1α n=3)

Tab. 3 Comparison of ACC1 and SREBP-1 mRNA in A549 cells in each n=3)

2.3 低氧通過HIF-1α對SREBP-1、ACC1及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin變化的影響

使用常氧及5% O2分別處理A549細胞；與常氧對照組相比，低氧上調(diào)A549細胞ACC1與SREBP-1蛋白表達(P均<0.05)，E-cadherin蛋白表達下降(P<0.01)，Vimentin蛋白表達上升(P<0.05)；低氧并給予A549細胞以HIF-1α抑制劑PX-478(25 μmol)處理，ACC1和SREBP-1蛋白水平均較低氧對照組下降(P均<0.05)；E-cadherin蛋白表達上升(P<0.01)，Vimentin蛋白表達下降(P<0.05，圖2，表4)。

Fig. 2 Representative bands of HIF-1α,SREBP-1,ACC1,E-cadherin and Vimentin expressions after inhibiting HIF-1α in A549 cells

Tab. 4 The expression levels of HIF-1α,SREBP-1,ACC1,E-cadherin and Vimentin detected by Western blot analyses under hypoxia and inhibition HIF-1α n=3)

2.4 低氧通過SREBP-1對A549細胞的遷移及ACC1表達的影響

轉(zhuǎn)染si-RNA獲得敲低SREBP-1的A549細胞；與常氧組相比，Transwell實驗顯示si-SREBP-1組細胞遷移數(shù)較對照組減少(223±11vs137±6，P<0.01)；給予si-SREBP-1組低氧處理，與低氧對照組相比si-SREBP-1組細胞遷移數(shù)減少(351±11vs153±9，P<0.01)，與常氧對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(153±9vs137±6，P>0.05)；Western blot檢測到si-SREBP-1組較常氧組相比，ACC1與Vimentin蛋白表達下降，E-cadherin蛋白表達上升(P均<0.01)；低氧處理si-SREBF-1組后，與低氧對照組相比，ACC1蛋白表達下降，E-cadherin蛋白表達上升(P均<0.01)，Vimentin蛋白表達下降(P<0.05，圖3，表5)。

Fig. 3 The effect of si-RNA transfection to knock down SREBP-1 on the migration of A549 cells under normoxia and 5% O2 conditions

Tab. 5 The expression levels of HIF-1α,SREBP-1,ACC1,E-cadherin and Vimentin detected by Western blot analyses under normoxia and 5% O2 conditions after si-RNA transfection to knock down SREBP-1 n=3)

2.5 低氧通過ACC1調(diào)控LA對A549細胞遷移的影響

轉(zhuǎn)染慢病毒獲得敲低ACC1的A549細胞；敲低ACC1后A549細胞在常氧和5% O2條件下遷移細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(99±10.6vs80±6.43，P>0.05)；5% O2條件下Vimentin與E-Cadherin蛋白表達較常氧組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；低氧處理敲低ACC1的A549細胞并給予LA(25 μmol)，A549細胞的遷移數(shù)較低氧組上升(134±14vs79±6，P<0.05)且Vimentin蛋白表達較低氧組增加(P均<0.05)，E-Cadherin蛋白表達較低氧組下降(P<0.01，圖4，圖5，表6)。

Fig. 4 The effect of LA on the migration of A549 cells that knockdown of ACC1 under normoxia and hypoxic conditions (Scale=200 μm)

Fig. 5 Representative bands of ACC1,E-cadherin and Vimentin expressions in A549 cells that knockdown of ACC1 and supplement LA under normoxia and hypoxia conditions n=3)

Tab. 6 The expression levels of ACC1,E-cadherin and Vimentin detected by Western blot analyses in A549 cells that knockdown of ACC1 and supplement LA under normoxia and hypoxia conditions n=3)

3 討論

實體腫瘤由于氧擴散障礙、腫瘤微血管系統(tǒng)異常等因素，導致腫瘤細胞處于一種難以糾正的低氧環(huán)境，稱為腫瘤低氧微環(huán)境[9]。腫瘤低氧微環(huán)境影響包括血管生成、能量代謝、腫瘤遷移在內(nèi)的多種生物學行為[10]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞在低氧微環(huán)境中的代謝重編程，其與脂質(zhì)代謝的改變及腫瘤細胞的遷移有密切聯(lián)系，但其機制尚不清晰[11，12]。本課題組在前期的研究中，通過Transwell實驗檢測到低氧可促進A549細胞遷移，Western blot檢測到低氧處理A549細胞后ACC1蛋白表達上升，同時使E-Cadherin蛋白表達下降，Vimentin蛋白表達上升，該結(jié)果證實低氧通過上調(diào)ACC1促進肺腺癌A549細胞遷移及EMT轉(zhuǎn)化[8]，但具體機制不明。

HIF-1α是腫瘤低氧微環(huán)境中調(diào)控腫瘤進展的重要轉(zhuǎn)錄因子，其在低氧條件下結(jié)合HIF-1β形成轉(zhuǎn)錄復合體,結(jié)合許多基因啟動子的HRE序列，調(diào)節(jié)包括能量代謝與浸潤轉(zhuǎn)移在內(nèi)的多種腫瘤生物學行為。研究報道，HIF-1α在低氧條件下可以增加丙酮酸激酶-2、磷酸激酶-1、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(glucose transporter 1，GLUT1)和乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)基因的表達，促進腫瘤細胞糖類的代謝，促進細胞的生長與轉(zhuǎn)移[13，14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)低氧處理A549細胞促進其遷移，同時RT-qPCR檢測到ACC1 mRNA的上升，Western blot檢測到ACC1蛋白水平表達的增加，而HIF-1α在低氧條件下降解減少引起其含量相對增多。由此推測，ACC1在低氧條件下轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)可能與HIF-1α有密切聯(lián)系。為驗證該假設(shè)，本實驗使用HIF-1α抑制劑處理A549細胞并給予低氧處理，結(jié)果顯示使用HIF-1α抑制劑后低氧對A549細胞的促遷作用減弱，同時RT-qPCR檢測到ACC1 mRNA水平較低氧組明顯下降，但與常氧組相比差異無統(tǒng)計學意義。Western blot檢測到ACC1蛋白表達與低氧組相比下降但與常氧組相比差異無統(tǒng)計學意義。此外，EMT相關(guān)蛋白較低氧對照組相比，E-Cadherin表達上升，Vimentin表達下降，即低氧促進EMT的表型被逆轉(zhuǎn)，結(jié)果顯示低氧通過HIF-1α上調(diào)ACC1促進A549細胞遷移。

SREBP-1是細胞內(nèi)維持脂類代謝穩(wěn)定的重要因子[15]，通過調(diào)節(jié)與脂肪酸從頭合成途徑有關(guān)基因調(diào)節(jié)脂類在腫瘤細胞內(nèi)的代謝[16，17]，其中包括ACC1。研究報道，HIF-1α在低氧條件下進入細胞核促進SREBF-1轉(zhuǎn)錄[18]。然而關(guān)于低氧條件下A549細胞中SREBP-1水平變化及其對ACC1的影響尚不明確。因此本研究檢測低氧處理A549細胞后SREBP-1蛋白及mRNA的變化，發(fā)現(xiàn)低氧上調(diào)SREBP-1蛋白及mRNA水平，并且使用HIF-1α抑制劑后這種促進作用消失。隨后，本研究通過轉(zhuǎn)染si-RNA獲得敲低SREBP-1的A549細胞，低氧對于該細胞的促遷作用減弱且ACC1表達較對照組明顯降低。因此上述結(jié)果提示SREBP-1在低氧條件下通過HIF-1α上調(diào)ACC1促進A549細胞遷移的過程中發(fā)揮作用。敲低SREBP-1能夠減弱低氧對于A549細胞的促遷作用，該作用可能與下調(diào)ACC1進而影響脂肪酸合成有關(guān)。

ACC1是脂肪酸代謝的限速酶[19]，文獻報道敲除ACC1會抑制肺腺癌細胞的增殖，并且這種作用是以脂肪酸合成為基礎(chǔ)[20]。以高脂飲食飼養(yǎng)的小鼠其肺部腫瘤結(jié)節(jié)明顯高于正常飲食組，說明高脂肪飲食有助于癌癥細胞的轉(zhuǎn)移[21]，提示脂類代謝與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。有研究報道，敲低脂肪酸代謝的另一種關(guān)鍵酶-脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)可以抑制膀胱癌細胞的UMUC3的遷移能力[22]。該結(jié)果表明，干預腫瘤細胞的脂肪酸代謝可能影響腫瘤細胞的遷移，然而關(guān)于低氧、ACC1和肺腺癌細胞遷移之間的聯(lián)系則鮮見報道。為進一步探索低氧條件下ACC1與肺腺癌細胞遷移的聯(lián)系，本課題組在前期研究中給予敲低ACC1的A549細胞以脂肪酸處理，檢測A549細胞遷移能力的變化，結(jié)果顯示補充脂肪酸可部分恢復低氧對于敲低ACC1的A549細胞的促遷作用[8]；隨后進一步檢測該條件下A549細胞處理后EMT相關(guān)蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)蛋白E-Cadherin表達下降，Vimentin表達上升，即與低氧促進A549細胞遷移相關(guān)的EMT表型得到恢復。因此推測低氧通過HIF-1α/SREBP-1/ACC1途徑促進肺腺癌A549細胞遷移可能與脂肪酸合成有關(guān)。關(guān)于脂肪酸與腫瘤細胞遷移之間的聯(lián)系，目前認為主要有兩個關(guān)鍵點：1)能量合成，2)脂筏合成。腫瘤細胞通過重編程脂代謝途徑獲取遷移所需能量，同時利用脂肪酸合成遷移所需結(jié)構(gòu)(如脂筏等)[23]。通過干涉HIF-1α/SREBP-1/ACC1途徑可能對肺腺癌的進展具有抑制作用。此外，亦有研究報道低氧能夠促進乳腺癌細胞MCF-7及膠質(zhì)瘤細胞U87等多種腫瘤細胞遷移且其機制與EMT有密切聯(lián)系[24，25]，這提示本研究結(jié)果可能存在于其他非肺腺癌細胞系中，但具體機制仍有待深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，低氧能夠通過HIF-1α/SREBP-1途徑上調(diào)肺腺癌A549細胞的ACC1表達進而促進肺腺癌A549細胞遷移，并且這種促進作用與脂肪酸的合成相關(guān)。本研究證明低氧通過HIF-1α/SREBP-1/ACC1途徑參與肺腺癌細胞的遷移，確定ACC1在肺腺癌細胞遷移中的作用，有助于加深對肺腺癌細胞遷移的分子機制的了解，為肺腺癌的新型靶向治療提供理論依據(jù)，通路所涉及的分子可能成為肺腺癌治療新的靶點。