徐 暢，吳曉玲，程 凱，李 娜

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京100029)

慢性骨盆疼痛綜合征(chronic pelvic pain syndrome,CPPS)是男性泌尿生殖系統(tǒng)中的常見(jiàn)病和多發(fā)病，約占到前列腺炎的90%以上，主要是由于前列腺受到某些非感染因素刺激而發(fā)生的炎癥反應(yīng)[1]。CPPS典型的臨床特征為尿頻、尿急、排尿困難等排尿異常以及腰、骶神經(jīng)所支配的會(huì)陰部、外生殖器、膀胱及尿道等部位的疼痛不適，嚴(yán)重者還可影響正常性功能，給患者帶來(lái)極大的精神負(fù)擔(dān)[2]。CPPS的病因、發(fā)病機(jī)制及病理生理過(guò)程十分復(fù)雜，可能與自身免疫異常、氧化應(yīng)激、內(nèi)分泌失調(diào)等多種因素有關(guān)[3，4]。因此，為了更好地了解CPPS的發(fā)病機(jī)制以及找到有效的診治方法，建立可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型尤為重要。

基于不同的研究目的，國(guó)內(nèi)外研究者已建立的前列腺炎模型包括自身免疫誘導(dǎo)模型，老齡動(dòng)物自發(fā)模型，激素和去勢(shì)誘導(dǎo)模型以及化學(xué)物質(zhì)刺激模型等，這些方法的操作難度、成功率以及炎癥能維持的時(shí)間各不相同，且對(duì)模型的檢測(cè)方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)也不統(tǒng)一?；瘜W(xué)物質(zhì)刺激法是將角叉菜膠、完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)、福爾馬林等物質(zhì)直接注射到動(dòng)物前列腺組織，其操作方便，使用相對(duì)廣泛。且化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的前列腺炎模型不僅能引起無(wú)菌性炎癥，還可成功模擬盆腔疼痛[5]。因此，本研究采用向大鼠前列腺組織注射化學(xué)物質(zhì)的方法建立CPPS炎性痛模型。炎癥性疼痛有急性和慢性之分，如角叉菜膠、福爾馬林誘發(fā)的炎性反應(yīng)可在一周后消失，所以多用于制備急性和亞急性炎癥模型[6]。CFA誘導(dǎo)的炎癥性疼痛可持續(xù)2～3周(1～2周以上相當(dāng)于人類(lèi)患者的慢性期)，且與臨床癥狀最為相關(guān)，所以是誘導(dǎo)慢性炎癥疾病最經(jīng)典、穩(wěn)定的造模藥[7，8]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向大鼠前列腺腹側(cè)葉注射CFA原液，以建立并評(píng)估CPPS慢性炎性痛模型，為CPPS的發(fā)病機(jī)制及抗炎鎮(zhèn)痛治療提供可靠的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，(由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)[SYXK(京)2016-0006])。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)校區(qū)動(dòng)物房(23±2)℃，濕度45%～55%，光照/黑暗循環(huán)12 h，自由攝食飲水。

1.2 主要儀器與試劑

CFA、青霉素鈉(北京百諾威生物科技有限公司)；水合氯醛(上海源葉生物科技有限公司)；4%固定液(北京酷來(lái)搏科技有限公司)；蘇木精-伊紅染色試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；熱刺痛儀(PL-200，成都泰盟科技有限公司)；正置顯微鏡(德國(guó)Leica)；EG1150H石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)、攤片機(jī)(德國(guó)Leica)。

1.3 分組與模型制備

60只SD雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組，假手術(shù)組和模型組，每組20只。參考洪志明[9]等的方法，向大鼠前列腺腹側(cè)葉注射CFA原液0.1 ml以制備CPPS模型。具體操作為：60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將假手術(shù)組和模型組大鼠稱(chēng)重，以0.35 ml/100 g 10% 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉。麻醉滿意后，將大鼠仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，剃除右下腹部毛發(fā)，用75%酒精消毒皮膚，于大鼠腹正中線右側(cè)旁開(kāi)1 cm的位置做一縱向切口，長(zhǎng)約2 cm。分離肌肉、腹膜，先找到膀胱，然后沿著膀胱頸部找到前列腺組織并充分暴露。用鑷子固定前列腺腹側(cè)葉，在兩側(cè)前列腺腹側(cè)葉分別注射0.05 ml CFA原液，且分離多個(gè)注射部位。假手術(shù)組以同樣的方法注射等量無(wú)菌生理鹽水溶液。用可吸收縫合線逐層縫合肌肉、皮膚，碘伏消毒傷口(圖1)。術(shù)后將大鼠放置于毛絨毯上等待蘇醒，單籠飼養(yǎng)，連續(xù)3 d用碘伏消毒傷口并腹腔注射青霉素鈉溶液1.6×106U，以防止傷口化膿感染[10]。

Fig. 1 The process of surgical operation to inject CFA solution into the ventral prostate lobes

1.4 大鼠一般情況觀察

觀察各組大鼠的一般狀況，包括活動(dòng)度、排尿量、毛發(fā)光澤度等。

1.5 熱刺激疼痛閾值測(cè)定

參考Hargreaves[11]等的熱痛閾值測(cè)定方法，分別于造模第7，14，21，28,35日測(cè)定各組大鼠足底和陰囊熱刺激疼痛閾值。設(shè)置熱刺痛儀(PL-200，成都泰盟科技有限公司)實(shí)驗(yàn)參數(shù)為光照強(qiáng)度為50%，照射停止時(shí)間為30 s。然后將大鼠用密閉可拆卸的透明有機(jī)玻璃盒子隔開(kāi)，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境30 min，待大鼠不再四處張望、走動(dòng)后開(kāi)始測(cè)量。移動(dòng)熱刺痛儀控制桶，使其中心刺激光源分別對(duì)準(zhǔn)大鼠后肢足底中心正下方及陰囊部位。當(dāng)大鼠出現(xiàn)閃躲、抬腿、舔腳以及舔陰囊時(shí)則標(biāo)記為陽(yáng)性反應(yīng)(圖2)。機(jī)器自動(dòng)記錄的時(shí)間為熱刺激疼痛閾值(以s為單位)。每只大鼠重復(fù)測(cè)定3次，每次測(cè)量中間至少間隔10 min，以防止散熱不夠?qū)Υ笫笤斐蓚σ约坝绊憸y(cè)定結(jié)果，以3次測(cè)定的平均值為熱刺激疼痛閾值。

1.6 大鼠前列腺濕重以及前列腺指數(shù)觀察

熱刺激疼痛閾值測(cè)定結(jié)束后，大鼠稱(chēng)重，麻醉處死。快速分離前列腺組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗去除附著的血液和脂肪組織，吸水紙吸干水分后稱(chēng)重，分析前列腺指數(shù)。前列腺指數(shù)計(jì)算公式：前列腺指數(shù) = 前列腺質(zhì)重(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)。

Fig. 2 Measurement of pain threshold of heat stimulation

1.7 大鼠組織學(xué)切片觀察

取大鼠前列腺組織部分右側(cè)腹側(cè)葉，4%多聚甲醛溶液中固定2 d，乙醇梯度脫水(75%、80%、90%、95%、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ)，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后進(jìn)行切片，片厚4 μm，蘇木素-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組前列腺組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)變化。參考文獻(xiàn)[12]，半定量法評(píng)價(jià)前列腺組織損傷程度，根據(jù)前列腺組織病理學(xué)改變的嚴(yán)重程度進(jìn)行記分制：前列腺腺體形態(tài)正常，腺泡內(nèi)分泌物均勻充盈，間質(zhì)無(wú)纖維增生，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或僅有極少量炎性細(xì)胞，記為0分；腺腔輕度萎縮，腺泡內(nèi)分泌物減少，間質(zhì)有輕度纖維增生、少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)記為1分；腺腔嚴(yán)重萎縮，腺泡內(nèi)分泌物明顯減少，間質(zhì)纖維增生嚴(yán)重，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)記為2分；腺腔嚴(yán)重萎縮至破壞，上皮細(xì)胞破壞，腺泡內(nèi)分泌物完全消失，間質(zhì)纖維增生嚴(yán)重，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)記為3分。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察

空白組和假手術(shù)組大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)度、毛發(fā)光澤度以及排尿量均正常，無(wú)死亡。與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠精神萎靡，活動(dòng)度降低，食欲減退。毛發(fā)光澤度降低，且術(shù)后3 d呈現(xiàn)暗黃色。排尿量顯著增加(同等時(shí)間內(nèi)墊料濕度增加)，尿道口偶見(jiàn)乳白色異常分泌物。造模期間3只模型組大鼠出現(xiàn)腹脹、腹瀉、消瘦甚至死亡，考慮與術(shù)后腸蠕動(dòng)減緩及CPPS伴發(fā)腸易激綜合征有關(guān)。

2.2 大鼠各時(shí)期熱刺激疼痛閾值比較

對(duì)大鼠足底和陰囊不同時(shí)期的熱刺激疼痛閾值進(jìn)行測(cè)定，數(shù)據(jù)顯示(圖3)，空白組大鼠足底和陰囊熱刺激疼痛閾值基本恒定。與空白組比較，假手術(shù)組大鼠足底和陰囊熱刺激疼痛閾值在造模第7日明顯降低(P<0.01)，后逐漸提高并趨于穩(wěn)定。與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠各個(gè)時(shí)期足底和陰囊熱刺激疼痛閾值均顯著降低(P<0.01)，并在實(shí)驗(yàn)期間維持穩(wěn)定。同實(shí)驗(yàn)階段，大鼠陰囊熱痛閾值稍低于足底熱痛閾值，但二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Fig. 3 Thermal stimulation pain threshold were assessed at each time point (7,14,21,28,35 day after modeling) n=15)

2.3 大鼠前列腺濕重和前列腺指數(shù)比較

如圖4所示，與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺濕重和前列腺指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Fig. 4 Comparison of prostate wet weight and prostate index in n=15)

2.4 大鼠前列腺組織病理觀察

肉眼觀察(圖5)，空白組和假手術(shù)組大鼠前列腺組織呈粉紅色，質(zhì)地均勻、柔軟、光滑，無(wú)水腫，無(wú)硬結(jié)，與周?chē)螂椎冉M織無(wú)粘連。與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺組織呈暗紅色，水腫明顯，組織表面有較多結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬，與周?chē)M織粘連明顯，不易剝離。

Fig. 5 Anatomy of prostate tissue in control,sham operation and model group

顯微鏡下觀察(圖6)，空白組和假手術(shù)組大鼠前列腺組織結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)大小不一呈類(lèi)圓形的腺泡，腺泡上皮呈柱狀，形成許多復(fù)雜的乳頭嵴突向腺管腔。腺腔內(nèi)充滿均勻的粉紅色分泌物，腺泡周?chē)@有大量平滑肌束，間質(zhì)無(wú)水腫，無(wú)炎性細(xì)胞或僅有散在的炎性細(xì)胞分布。模型組大鼠前列腺腺腔萎縮、折疊，腔內(nèi)分泌物減少甚至完全消失。部分腺泡上皮細(xì)胞由柱狀變成矮柱狀或扁平狀，間質(zhì)內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生，病變嚴(yán)重處前列腺腺泡完全為炎性細(xì)胞及纖維組織所替代。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，模型組大鼠前列腺炎性反應(yīng)高于空白組和假手術(shù)組，組織病理學(xué)分值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，表2)。

Fig. 6 Histology of prostate in control,sham operation and model groups (Scale bar=250 μm),arrows represent inflammatory cell infiltration and atrophic glandular cavity

Tab. 2 Pathological changes of prostate tissues(n=15)

3 討論

慢性盆腔疼痛是CPPS最突出的癥狀表現(xiàn)，由于疼痛部位廣泛且遷延難愈，給患者帶來(lái)巨大的身體痛苦和精神負(fù)擔(dān)[13]。疼痛通常與炎癥有關(guān)，炎性痛是由感染、創(chuàng)傷、化學(xué)物質(zhì)等引起外周組織損傷，刺激炎癥細(xì)胞和神經(jīng)末梢釋放炎性因子導(dǎo)致炎癥反應(yīng)所發(fā)生的疼痛，以痛覺(jué)過(guò)敏和痛覺(jué)超敏為主要臨床特征，同時(shí)可伴有局部紅腫熱痛和功能障礙，是臨床中最常見(jiàn)的疼痛類(lèi)型[9]。研究表明，在CPPS患者前列腺液中通?？梢詸z測(cè)到促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的上調(diào)，證實(shí)CPPS患者機(jī)體常處于炎癥狀態(tài)[14]。而病灶局部釋放的炎性介質(zhì)可持續(xù)刺激傷害性感受器，傷害性信號(hào)的持續(xù)或反復(fù)刺激還可增加中樞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，引起脊髓內(nèi)感覺(jué)神經(jīng)元興奮性發(fā)生改變，這些可能是炎癥驅(qū)動(dòng)下導(dǎo)致機(jī)體痛覺(jué)敏感性提高的重要原因[15，16]。因此，為了進(jìn)一步明確CPPS慢性炎癥性疼痛的病因、發(fā)病機(jī)制以及探索有效的治療方法，本研究采用向大鼠前列腺組織注射CFA原液建立CPPS慢性炎性痛模型。

CFA是由結(jié)核分支桿菌、液體石蠟、羊毛脂等在高溫下滅活而成的一種混合油劑，可能導(dǎo)致注射部位局部炎癥和肉芽腫性反應(yīng)，慢性炎癥，局部膿腫或組織脫落，關(guān)節(jié)炎等，多用于各種炎性痛疾病模型的制備[17]。根據(jù)CFA注射指南，參考大鼠肌肉注射方法，本研究確定的注射劑量為0.1 ml，注射部位為大鼠前列腺腹側(cè)葉，且分離注射部位以避免聚結(jié)炎性病變。盡管有文獻(xiàn)指出前列腺背側(cè)葉效果更好，但由于背側(cè)葉體積小，且位于精囊內(nèi)側(cè)，不易操作，所以將腹側(cè)葉作為首選注射部位[18]。另外，本研究考慮到后期需要對(duì)大鼠關(guān)元穴、中極穴進(jìn)行針刺，為了避免穴位的損傷，我們?cè)诖笫笙赂共壳罢芯€旁開(kāi)1 cm做切口，保證大鼠生存率不受影響。

前列腺組織學(xué)改變是判斷炎癥是否發(fā)生以及嚴(yán)重程度最直觀的指標(biāo)，研究結(jié)果顯示，CPPS模型組大鼠前列腺組織受損嚴(yán)重，前列腺濕重及前列腺指數(shù)顯著增加，組織間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺腔萎縮嚴(yán)重，組織病理評(píng)分提高，提示CFA成功誘發(fā)前列腺組織的炎癥反應(yīng)。

急性炎癥性疼痛是對(duì)組織損傷或感染的自然生理反應(yīng)，對(duì)于機(jī)體來(lái)說(shuō)具有積極意義，并且有一定的自愈能力。而慢性炎癥性疼痛往往由急性炎癥性疼痛發(fā)展而來(lái)，疼痛可持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年，甚至造成嚴(yán)重的功能障礙[19]。據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)，由于不同的造模藥能維持的成模時(shí)間不同，因此，疼痛持續(xù)時(shí)間是本研究關(guān)注的重點(diǎn)。臨床中對(duì)CPPS疼痛的評(píng)估多采用NIH-CPSI量表，但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)法用語(yǔ)言來(lái)表達(dá)其感受到的傷害性刺激，所以需通過(guò)行為學(xué)表現(xiàn)如探索行為減少、反射縮足行為、搔抓嘶叫等來(lái)間接評(píng)價(jià)其疼痛程度。利用熱刺痛儀對(duì)熱痛閾值進(jìn)行測(cè)定是動(dòng)物模型中常用的定量衡量疼痛的方法之一，測(cè)痛部位常根據(jù)疾病性質(zhì)和疼痛部位而定[20]。結(jié)合CPPS的疼痛部位以及測(cè)痛儀器的限制，我們首先對(duì)大鼠陰囊進(jìn)行測(cè)痛實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，造模第7日時(shí)，假手術(shù)組大鼠陰囊熱痛閾值降低，提示手術(shù)損傷可能會(huì)引起大鼠痛閾值的短暫性波動(dòng)，而隨著傷口恢復(fù)，大鼠痛閾值提高并趨于平穩(wěn)。與同時(shí)期的空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠陰囊的痛閾值顯著降低并可穩(wěn)定維持5周以上，提示CFA可成功誘導(dǎo)大鼠慢性疼痛，且疼痛維持時(shí)間較長(zhǎng)，模型較為穩(wěn)定。

同樣，我們?cè)诖笫笞愕滓矙z測(cè)到痛覺(jué)敏感性的提高，這可以從神經(jīng)傳導(dǎo)與反射來(lái)分析。從神經(jīng)解剖學(xué)來(lái)看，大鼠坐骨神經(jīng)主要由L3-6、S1-2神經(jīng)根參與匯合成腰骶神經(jīng)叢，向下延續(xù)為坐骨神經(jīng)干。其先在骶髂關(guān)節(jié)前走行，后繞過(guò)股骨大轉(zhuǎn)子進(jìn)入股骨后方，發(fā)出3大分支，腓總神經(jīng)、脛神經(jīng)和腓腸神經(jīng)。其中脛神經(jīng)為坐骨神經(jīng)的主要終末支，發(fā)出分支支配腓腸肌和屈趾肌群，并沿其下行至足底支配足內(nèi)側(cè)皮膚及肌肉[21]。因此，大鼠足底痛敏也可以反映其盆腔部位的痛覺(jué)敏感性，且操作性更強(qiáng)。

綜上所述，向大鼠前列腺腹側(cè)葉注射0.1 ml CFA原液可成功制備較持久、穩(wěn)定的CPPS慢性炎癥性疼痛模型，該建模方法可為后期CPPS的機(jī)制研究及鎮(zhèn)痛治療提供良好的工作基礎(chǔ)。但上述方法仍存在不足之處，如實(shí)驗(yàn)中注射造模藥物僅采用一個(gè)劑量，缺少不同劑量之間的比較，因此還需后期不斷完善。