梁曉天，韓春蕾，林本成，石 玥，謝曉倩，李 康△，襲著革△

(1.濱州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院,山東 煙臺 264000；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050)

世界衛(wèi)生組織的最新數(shù)據(jù)表明，全球每年約650萬人因空氣污染而死亡，占所有死亡人數(shù)的1/8，已成為全球最大的健康風(fēng)險因素之一[1]。對公眾健康影響較大的空氣污染物包括顆粒物、一氧化碳、臭氧、二氧化氮和二氧化硫。

顆粒物按照其空氣動力學(xué)直徑(aerodynamic diameter,AD)可分為總懸浮顆粒物(AD≤100 μm)、可吸入顆粒物(AD≤10 μm)以及細(xì)顆粒物(AD≤2.5 μm)。其中細(xì)顆粒物(PM2.5)是健康風(fēng)險的一個特別重要的來源，因為這些細(xì)小的顆?？梢猿练e肺部，進(jìn)入血液循環(huán)，并進(jìn)入器官，對人體產(chǎn)生更大危害。關(guān)于PM2.5暴露所引發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病[2,3]和心血管系統(tǒng)疾病[4]已經(jīng)有了許多深入研究，近年來越來越多的研究已經(jīng)開始注意PM2.5暴露與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的聯(lián)系。

神經(jīng)發(fā)育障礙又稱廣泛性發(fā)育障礙，美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊(第5版 DSM-Ⅴ)將神經(jīng)發(fā)育障礙歸納為8種：智力障礙、交流障礙、孤獨癥(自閉癥)譜系障礙、注意缺陷/多動障礙、特定學(xué)習(xí)障礙、運動障礙、抽動障礙和其他神經(jīng)發(fā)育障礙[5]。流行病學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露會導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙(如：自閉癥)發(fā)病率的升高，動物實驗發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露能夠引起海馬炎性反應(yīng)[6]，且發(fā)現(xiàn)妊娠期[7]和出生早期[8,9]的PM2.5暴露均對正常神經(jīng)發(fā)育造成影響。

雖然流行病學(xué)研究和動物實驗的結(jié)果表明，妊娠期和出生早期暴露于PM2.5都會影響正常的神經(jīng)發(fā)育，但是在哪一時期暴露于PM2.5更容易對神經(jīng)發(fā)育造成影響此前尚未有相關(guān)研究。在本研究中，我們采用PM2.5全身系統(tǒng)性吸入式暴露的方法建立生命早期不同階段PM2.5暴露動物模型，以神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病常見受累腦區(qū)——前額皮層為切入點，研究PM2.5暴露對神經(jīng)發(fā)育影響的關(guān)鍵敏感期。

1 材料與方法

1.1 PM2.5采樣和處理

在天津市環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所二樓實驗室，于2020年11月至2020年12月期間，使用動物全身動態(tài)暴露系統(tǒng)(HRH-MNE3026型，北京慧榮和科技有限公司)和PM2.5在線濃縮富集系統(tǒng)(HRH-PM286型，北京慧榮和科技有限公司)，為模擬人體在大氣中暴露于PM2.5的真實情況，通過實時在線采樣8倍恒定濃縮以富集大氣環(huán)境中的PM2.5，在此期間嚴(yán)格控制全身系統(tǒng)性吸入暴露過程中對顆粒物沉積造成影響的相關(guān)因素。外界大氣在渦旋氣泵的作用下由管道進(jìn)入顆粒物虛擬切割系統(tǒng)，經(jīng)過含有PM10和PM2.5沖擊模塊的沖擊切割器，這一過程能夠有效除去大氣中粒徑>2.5 μm的顆粒，將≤2.5 μm的顆粒通入稀釋系統(tǒng)。實驗方案預(yù)先在空壓機(jī)控制界面設(shè)置完成，將過濾后的清潔空氣與顆粒物混合后通入暴露艙室，進(jìn)行全身系統(tǒng)性吸入暴露。

1.2 動物分組及暴露

本實驗經(jīng)天津市環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所動物倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：IACUC of AMMS-04-2020-002)，所有動物實驗均按照相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行。

受孕的SPF級Sprague-Dawley孕鼠12只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK(京)2016-0006。將孕鼠按體重隨機(jī)分為對照組(Control group，CG)、母親孕期暴露組(Maternal pregnancy exposure group，MG)、出生早期暴露組(Early postnatal exposure group，EP)和全圍產(chǎn)期暴露組(Perinatal period exposure group，PP)，每組3只，進(jìn)行孕鼠與子鼠的清潔空氣或8倍濃縮PM2.5的暴露。其中CG組全程暴露于清潔空氣；MG組從妊娠第1日(Gestational Day 1，GD1)起暴露到子鼠出生，即GD21(大鼠妊娠期為21 d)，暴露完成后置于清潔空氣環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)；EP組孕鼠先于清潔空氣環(huán)境中飼養(yǎng)至分娩，子鼠從出生第1日(Postnatal Day 1，PND1)起暴露到PND21，PP組從GD1一直暴露到PND21。暴露時間為4 h/d。監(jiān)測結(jié)果顯示，GD1～21及PND1～21期間暴露艙內(nèi)PM2.5平均濃度分別為0.398 mg/m3和0.354 mg/m3。實驗設(shè)計見圖1。

為了避免不確定的性別依賴性差異，在這項研究中我們選擇雄性子鼠進(jìn)行相關(guān)實驗，且對各組的雄性子鼠進(jìn)行組內(nèi)平均處理，以排除子鼠數(shù)量不同對其體重的影響。最終各組受試雄性子鼠數(shù)量為：CG組n=6、MG組n=6、EP組n=6、PP組n=6。所有動物都被飼養(yǎng)在天津市環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心一個光照/黑暗周期為12 h，溫度(22±2)℃，相對濕度為50%～70%的房間里。實驗過程中大鼠自由攝取食物和水。

1.3 組織收集

暴露結(jié)束之后，使用快速斷頭法處死子鼠，以避免麻醉劑對神經(jīng)化學(xué)的影響。應(yīng)用4%多聚甲醛對完整剝離的部分大腦進(jìn)行組織固定，其余大腦迅速在冰上分離出子鼠的前額皮層，并立即放入液氮中冷凍儲存，直至使用。

Fig. 1 Experimental protocol for PM2.5 exposure

1.4 病理學(xué)檢測

子鼠前額皮層組織經(jīng)過乙醇脫水和石蠟包埋后，切成厚度3 μm的切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，并在Olympus DP26顯微鏡下觀察。

1.5 神經(jīng)炎性因子檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測子鼠前額皮層神經(jīng)炎性因子白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及相關(guān)生物標(biāo)志物褪黑素(melatonin，MT)和催產(chǎn)素(oxytocin，OT)的水平。將冷凍的子鼠前額皮層在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行勻漿?？偟鞍椎臏y定使用BCA法，使用市售的酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒(Omnimabs)，按照說明書測定IL-1、IL-6、TNF-α、MT和OT水平。

1.6 神經(jīng)遞質(zhì)檢測

采用高效液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行子鼠前額皮層神經(jīng)遞質(zhì)(乙酰膽堿，acetylcholine，Ach)檢測。選擇前額皮層組織稱重，加入4倍量冰冷的0.2%甲酸水，在低溫下研磨儀中勻漿得組織勻漿液。取組織勻漿液0.2 ml，加入冰冷的乙腈(0.2%甲酸)0.4 ml，混勻后于4℃靜置30 min，然后于4℃離心機(jī)中12 000 r/min離心5 min，取上清，每200 μl上清液中加入內(nèi)標(biāo)液(0.3 g/L DHBA) 20 μl，取20 μl 上機(jī)檢測。上機(jī)條件：柱溫35℃，流動相為乙腈：6 mmol甲酸銨水pH5.5(v∶v)=67.5∶32.5，流速為0.2 ml/min，電噴霧電離方式進(jìn)行離子化，以正離子多反應(yīng)檢測(MRM)模式進(jìn)行掃描，離子源及其他相關(guān)參數(shù)優(yōu)化為噴霧電壓4 500 V，加熱溫度為450℃，Gas1為50Psi，Gas2為50Psi。

1.7 星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物檢測

采用免疫印跡實驗(Western blot)檢測子鼠前額皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。稱取凍存的前額皮層組織，放入離心管中，加入適量的組織裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑Cocktail，低溫下于研磨儀中進(jìn)行研磨勻漿，冰上裂解30 min，于4℃離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，取上清并加入等體積2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃金屬浴10 min，使蛋白充分變性。然后將10 μl總蛋白加樣到聚丙烯酰胺凝膠電泳中，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h。然后將PVDF膜與Ⅰ抗(CST #80788、GTX 100118)4℃孵育過夜，第2日，用TBST洗滌3次PVDF膜，每次5 min。在室溫下與抗兔辣根過氧化物酶Ⅱ抗(ABS20031)孵育90 min后，使用增強化學(xué)發(fā)光溶液對PVDF膜進(jìn)行顯影。通過使用Image J進(jìn)行定量的密度分析腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的變化。

1.8 腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

采用比色法檢測子鼠前額皮層中的氧化應(yīng)激指標(biāo)。低溫下利用生理鹽水在研磨儀中對子鼠前額皮層進(jìn)行勻漿，于4℃離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，取上清使用 BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白濃度，采用相關(guān)試劑盒測定過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 生命早期PM2.5暴露對組織結(jié)構(gòu)的影響

病理學(xué)檢測結(jié)果見圖2。CG組：腦皮層組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，神經(jīng)元排列整齊，未見神經(jīng)元固縮壞死，神經(jīng)元數(shù)量未見明顯減少。MG組：腦皮層組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，神經(jīng)元排列整齊，未見神經(jīng)元固縮壞死，神經(jīng)元數(shù)量未見明顯減少。EP組：腦皮層組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，神經(jīng)元排列整齊，個別神經(jīng)元固縮壞死。PP組：腦皮層組織整體結(jié)構(gòu)異常，部分神經(jīng)元固縮壞死，可見病理性纖維纏結(jié)。

Fig. 2 Pathological examination results

2.2 生命早期PM2.5暴露對神經(jīng)炎性因子的影響

與MG組和CG組子鼠相比，PP組和EP組子鼠的神經(jīng)炎性因子IL-1、IL-6和TNF-α水平均有顯著升高(P<0.01，表1)；MT水平顯著減少(P<0.05，表1)；我們只觀察到了OT的下降趨勢，但是沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(表1)。

2.3 生命早期PM2.5暴露對神經(jīng)遞質(zhì)的影響

與MG組(0.552±0.043)和CG組(0.493± 0.061)子鼠相比PP組(0.808±0.106)和EP(0.763±0.087)組子鼠Ach水平顯著增加(P<0.01)。

2.4 生命早期PM2.5暴露對星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的影響

與MG組(0.697±0.236)和CG組(0.728± 0.239)子鼠相比，PP組(1.091±0.190)和EP組 (0.910±0.167)子鼠GFAP水平呈升高趨勢(圖3)，但是我們發(fā)現(xiàn)MG組(0.697±0.236)子鼠的GFAP低于CG組(0.728±0.239)子鼠(圖3)。

Tab. 1 Neuroinflammatory factor test results n=6)

Fig. 3 The levels of astrocyte markers were detected by Western blot

2.5 生命早期PM2.5暴露對氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響

與CG組子鼠比較，PP組子鼠的CAT顯著減少(P<0.01)，與MG組子鼠比較PP組子鼠的CAT顯著減少(P<0.05，表2)；與CG組子鼠比較,EP組子鼠的CAT顯著減少(P<0.05)。與MG組和CG組子鼠比較，PP組和EP組子鼠的SOD顯著減少(P<0.01)。與MG組和CG組子鼠比較，PP組和EP組子鼠的ROS顯著增加(P<0.01)。

Tab. 2 Results of oxidative stress in brain n=6)

3 討論

神經(jīng)發(fā)育從胚胎期延伸到青春期，依賴增殖、遷移、分化、突觸形成、髓鞘形成和凋亡等關(guān)鍵發(fā)育過程，處于這些發(fā)育關(guān)鍵過程中的神經(jīng)系統(tǒng)比較脆弱，容易受到干擾，導(dǎo)致各種疾病(如精神分裂癥和自閉癥)的發(fā)生[10]。妊娠期和出生早期是神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育的關(guān)鍵期，也是PM2.5暴露導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育毒性的關(guān)鍵期。我們采用PM2.5全身系統(tǒng)性吸入式的方法對大鼠進(jìn)行暴露，從前額皮層水平對PM2.5暴露影響神經(jīng)發(fā)育的敏感時期進(jìn)行探索研究，此前相關(guān)的研究尚未有報道。

病理學(xué)結(jié)果顯示，全圍產(chǎn)期暴露組子鼠和出生早期暴露組子鼠的前額皮層受到PM2.5影響，部分神經(jīng)元固縮壞死，在一定程度上發(fā)生了病理學(xué)的改變。而母親孕期暴露組子鼠和對照組子鼠的前額皮層未發(fā)生變化。乙酰膽堿是中樞及周邊神經(jīng)系統(tǒng)中常見的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，于自主神經(jīng)系統(tǒng)及體運動神經(jīng)系統(tǒng)中參與神經(jīng)傳導(dǎo)。已有研究表明乙酰膽堿偏高可能會導(dǎo)致思維遲緩、記憶力下降、反應(yīng)能力遲緩等癥狀。本研究中全圍產(chǎn)期暴露組子鼠和出生早期暴露組子鼠神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水平高于母親孕期組暴露子鼠和對照組子鼠。表明PM2.5暴露能夠引起前額皮層出現(xiàn)病理損害，而這種病理損害可能是神經(jīng)性疾病發(fā)生的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

PM2.5暴露不僅會導(dǎo)致腦組織形態(tài)發(fā)生病理學(xué)改變 ，與膠質(zhì)細(xì)胞活性的改變及神經(jīng)炎癥反應(yīng)亦密切相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露通過引發(fā)腦內(nèi)神經(jīng)炎癥對神經(jīng)發(fā)育(如：自閉癥)產(chǎn)生影響[12]。炎性因子在PM2.5暴露所致神經(jīng)毒性中扮演的角色至關(guān)重要，在已有研究中，炎性因子在PM2.5暴露后的改變是最為顯著和常見的[13]。多項研究表明，神經(jīng)發(fā)育障礙(自閉癥)患者體內(nèi)促炎因子IL-1、IL-6和TNF-α濃度顯著高于正常人[14,15]。膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中的固有免疫細(xì)胞，實時監(jiān)測腦內(nèi)環(huán)境變化，膠質(zhì)細(xì)胞活性的改變也是PM2.5神經(jīng)毒性的潛在機(jī)制之一。神經(jīng)炎癥通常涉及星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活[16]，GFAP為中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或者應(yīng)激之后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的最佳標(biāo)記之一[17]。有研究發(fā)現(xiàn)無論在圍產(chǎn)期的PM2.5暴露中還是在出生早期的PM2.5暴露中，GFAP的表達(dá)都會發(fā)生顯著變化[18,19]。MT具有很強的抗炎和抗氧化應(yīng)激作用，能夠通過減緩炎癥反應(yīng)，抑制膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，進(jìn)而降低神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。MT在自閉癥患者體內(nèi)的合成異常，致使其表達(dá)水平降低，從而加劇神經(jīng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展。臨床研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)性疾病如自閉癥、焦慮癥等多存在社會功能的異常，而催產(chǎn)素能有效改善社會行為，緩解焦慮情緒[20,21]。研究證實，自閉癥兒童患者的外周血中的OT水平低于正常人群[22]。本研究結(jié)果顯示，與母親孕期暴露組子鼠和對照組子鼠相比，全圍產(chǎn)期暴露組子鼠和出身早期暴露組子鼠的促炎因子IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)水平升高，MT水平和OT表達(dá)水平降低，GFAP的蛋白表達(dá)水平升高。表明炎性反應(yīng)是PM2.5暴露造成神經(jīng)損害的基本機(jī)制，促炎因子的釋放能直接導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，促使其釋放更多的細(xì)胞因子，對神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，誘導(dǎo)神經(jīng)性疾病的發(fā)生。

研究表明，氧化應(yīng)激是PM2.5暴露引起神經(jīng)毒性的重要機(jī)制[23]。當(dāng)機(jī)體遭受PM2.5暴露等外界毒物刺激時，干擾機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)，產(chǎn)生大量的 ROS，破壞原有氧化還原狀態(tài)的平衡，導(dǎo)致組織細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。PM2.5通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[24]。氧化應(yīng)激的發(fā)生，伴隨著CAT、SOD水平的降低和ROS水平的升高。本研究中，與母親孕期暴露組和對照組子鼠相比，全圍產(chǎn)期暴露組和出生早期暴露組子鼠的CAT和SOD的水平均降低，ROS水平升高。表明PM2.5暴露環(huán)境下，與母親孕期暴露組和對照組子鼠相比，全圍產(chǎn)期暴露組和出生早期暴露組子鼠更易發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷。

綜上所述，在PM2.5暴露環(huán)境下，全圍產(chǎn)期暴露組和出生早期暴露組子鼠在病理學(xué)表現(xiàn)、神經(jīng)遞質(zhì)、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥方面的變化要比母親孕期暴露組子鼠和對照組子鼠更為顯著，且全圍產(chǎn)期暴露組子鼠與出生早期暴露組子鼠之間無顯著性差異。表明出生早期子鼠對PM2.5暴露更為敏感，在此期間PM2.5暴露對子鼠前額皮層發(fā)育造成的不利影響更為嚴(yán)重。