劉中原 ， 劉玉萍 ， 孫 燕 ， 徐 坤 ， 王建琳 ， 秦志華 ， 張啟迪 ， 丁 娜 ， 王述柏

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) ， 山東 青島 266109)

多年來我國家禽養(yǎng)殖規(guī)模位居世界前列，但寄生蟲類疾病頻發(fā)一直是家禽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的制約因素。規(guī)?；B(yǎng)殖過程中雛雞球蟲病發(fā)病率可達(dá)50%～70%，病愈雞及攜帶球蟲成年雞生產(chǎn)性能受到顯著不利影響[1]。地克珠利等抗球蟲藥的研發(fā)和應(yīng)用使球蟲病得以有效防控，但藥物殘留問題突出，制約了我國肉雞產(chǎn)品出口和消費(fèi)[2]。地克珠利屬三嗪苯乙腈化合物，為高效低毒抗球蟲藥[3]。本試驗(yàn)研究了飼糧中添加地克珠利預(yù)混劑對肉雞肌肉和內(nèi)臟器官中該藥物的沉積和消減規(guī)律及主要臟器組織學(xué)結(jié)構(gòu)的影響，并分析了藥物沉積量與肉雞血清生化指標(biāo)變化的相關(guān)性，可從藥物作用機(jī)制角度為肉雞無抗養(yǎng)殖的實(shí)施和推行提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 288只1日齡AA肉雞隨機(jī)平均分為4個(gè)組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)(12只/重復(fù))。1～7 d 所有試驗(yàn)雞均飼喂基礎(chǔ)飼糧；8～35 d，對照組(1組)繼續(xù)飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組(2、3、4組) 分別飼喂添加不同劑量[1、2 mg/(kg·bw)和4 mg/(kg·bw)]0.5%地克珠利預(yù)混劑的試驗(yàn)飼糧；35 d 停藥后，所有試驗(yàn)雞均飼喂基礎(chǔ)飼糧至49 d。

1.2 檢測指標(biāo)與方法

1.2.1 地克珠利含量檢測 分別于35 d(停藥日)、38 d(停藥3 d)、42 d(停藥7 d)和49 d(停藥14 d)自每組每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取肉雞2只，頸部放血宰殺，迅速采集肝臟(去膽囊)和胸肌于自封口袋密封，-20 ℃冷凍保存待測。肝臟和胸肌中地克珠利含量檢測方法參照文獻(xiàn)[5]。

1.2.2 血清生化指標(biāo)檢測 于35 d(停藥日)自每組每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取肉雞2只，翅靜脈采血，離心取血清分裝于1.5 mL EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。血清淀粉酶活性、總超氧化物歧化酶活性、總蛋白和葡萄糖含量，均采用南京建成生物工程有限公司試劑盒進(jìn)行檢測[4]。

1.2.3 主要臟器組織學(xué)檢測 分別于28 d、35 d(停藥日)、42 d(停藥7 d)自每組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取肉雞1只，解剖取肝臟(去膽囊)、腎臟和脾臟，吸水紙吸干表面血液，修剪成5 mm×5 mm×5 mm的組織小塊，置于10%甲醛溶液中室溫固定待測。參照文獻(xiàn)[6]方法制作組織切片。在普通光學(xué)顯微鏡下，用40、100倍或400倍觀察肝臟、腎臟和脾臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，EViews 6.0軟件進(jìn)行殘留動(dòng)態(tài)預(yù)測模型的建立[4]。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 地克珠利在肉雞肝臟和胸肌中的沉積和消減規(guī)律 肉雞胸肌和肝臟中地克珠利的沉積量見表1，隨停藥時(shí)間延長，肝臟和胸肌中地克珠利含量均呈明顯下降趨勢。4組胸肌和肝臟地克珠利含量于停藥0～14 d顯著高于2組(P<0.05)；3組肝臟地克珠利含量于停藥第0、3天和14天均顯著高于2組(P<0.05)。

2.2 胸肌和肝臟中地克珠利沉積量動(dòng)態(tài)預(yù)測模型 根據(jù)表1數(shù)據(jù)繪制散點(diǎn)圖，采用指數(shù)函數(shù)模型對胸肌和肝臟地克珠利沉積量動(dòng)態(tài)進(jìn)行模擬，建立其沉積量預(yù)測模型：

表1 肌肉和肝臟中地克珠利的沉積量

公式中P是沉積量(ng/g)，A和B是待估參數(shù)，e是對數(shù)，t是停藥后時(shí)間(d)。

采用EViews 6.0軟件計(jì)算，2、3、4組胸肌中地克珠利沉積量動(dòng)態(tài)預(yù)測模型分別為：P1=307.625 151e-0.011 350t，R2=0.970 376，其半衰期為：t(P1/2)=61.070 237 d；P2= 327.882 725 e-0.011 856t，R2=0.970 147，其半衰期為：t(P1/2)=58.463 832 d；P3=362.261 019e-0.013 226t，R2= 0.980 198，其半衰期為：t(P1/2)=52.407 923 d。

2、3、4組肝臟中地克珠利沉積量動(dòng)態(tài)預(yù)測模型分別為：P4=599.507 909e-0.034 171t，R2=0.836 882，其半衰期為：t(P1/2)=20.284 544 d；P5=656.136 601e-0.033 141t，R2=0.810 245，其半衰期為：t(P1/2)=20.915 096 d；P6=803.188 154e-0.0348 98t，R2=0.808 386， 其半衰期為：t(P1/2)= 19.862 089 d。

上述動(dòng)態(tài)預(yù)測模型表明，地克珠利在胸肌中半衰期長達(dá)52.4～61.1 d，在肝臟中為19.9～20.9 d。由預(yù)測模型公式計(jì)算得知，2、3、4組胸肌中地克珠利沉積量衰減到高效液相色色譜法(HPLC)的最低檢測限(249.60 ng/g)分別為停藥后19 d、24 d和29 d；2、3、4組肝臟中地克珠利沉積量衰減到HPLC的最低檢測限(249.60 ng/g)分別為停藥后26 d、30 d和34 d。

2.3 胸肌和肝臟地克珠利沉積量與血清生化指標(biāo)的相關(guān)性分析 胸肌和肝臟中地克珠利沉積量(停藥當(dāng)天)與血清生化指標(biāo)相關(guān)系數(shù)見表2。血清淀粉酶和總超氧化物歧化酶活性4組顯著低于2、3組(P<0.05)。胸肌和肝臟地克珠利沉積量與血清淀粉酶(AMS)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05或P<0.01)，與血清葡萄糖含量無顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)；肝臟地克珠利沉積量與血清總蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

表2 胸肌和肝臟地克珠利沉積量與血清生化指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)

2.4 地克珠利對肉雞主要臟器組織學(xué)結(jié)構(gòu)的影響 肉雞肝臟的組織學(xué)觀察結(jié)果如圖1所示，對照組(1組)肉雞肝臟、脾臟和腎臟均發(fā)育正常(圖1A、2A、3A)，各試驗(yàn)組于不同日齡發(fā)生不同程度的病理變化。試驗(yàn)28 d時(shí)各組肉雞肝臟組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，2組肝臟靜脈輕微淤血，3組和4組肝小葉中央靜脈擴(kuò)張，內(nèi)部充盈大量紅細(xì)胞(圖1B)，4組匯管區(qū)和小葉內(nèi)出現(xiàn)不同程度炎性細(xì)胞浸潤，炎性細(xì)胞分散于肝細(xì)胞索間、間質(zhì)內(nèi)，部分肝小葉壞死區(qū)呈灶狀分布，膽管周圍聚集分布，導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹、肝索紊亂，細(xì)胞胞漿中充盈淡紅色顆粒狀物，部分細(xì)胞核消失，細(xì)胞壞死。試驗(yàn)35 d(即停藥當(dāng)天)時(shí)各試驗(yàn)組肝臟病變程度加重，肝臟出血，肝細(xì)胞腫脹。其中，2組肝細(xì)胞索紊亂，血管周圍炎性細(xì)胞浸潤，3組中央靜脈淤血，部分細(xì)胞壞死，4組肝臟中央靜脈淤血，血管周圍有明顯炎性細(xì)胞增生灶(圖1C)。試驗(yàn)42 d(停藥7 d)時(shí)各試驗(yàn)組肝臟損傷均有所減輕，2組肝臟中央靜脈淤血，肝細(xì)胞無腫脹變性等病理變化；3組和4組肝臟(圖1D)除中央靜脈淤血外，血管周圍仍有大量炎性細(xì)胞浸潤。

圖1 肉雞肝臟的組織病理學(xué)變化(H.E.染色，100×)

肉雞脾臟的組織學(xué)觀察結(jié)果如圖2所示，試驗(yàn)28 d時(shí)，隨地克珠利添加量增加，脾臟出血加劇，2組白髓有明顯炎性細(xì)胞增生灶(圖2B)，3組紅髓內(nèi)充盈紅細(xì)胞且有明顯炎性細(xì)胞增生灶，4組血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤。試驗(yàn)35 d(停藥當(dāng)天)時(shí)各試驗(yàn)組脾臟均明顯出血且有明顯炎性細(xì)胞增生灶(圖2C)。試驗(yàn)42 d(停藥7 d)時(shí)各試驗(yàn)組脾臟損傷均有所減輕，2組脾臟輕微出血，3組和4組脾臟除出血外，均有炎性細(xì)胞增生灶(圖2D)。

圖2 肉雞脾臟的組織病理學(xué)變化(H.E.染色)

肉雞腎臟的組織學(xué)觀察結(jié)果如圖3所示，試驗(yàn)28 d時(shí)各試驗(yàn)組腎臟出血、腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性脫落，3組腎小管官腔縮小，4組炎性細(xì)胞浸潤，腎小管內(nèi)腔變狹窄，嚴(yán)重者完全閉塞。試驗(yàn)35 d(停藥當(dāng)天)時(shí)各試驗(yàn)組腎臟均出血、淤血，腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性、腫脹，管腔縮小甚至完全閉塞(圖3B)。試驗(yàn)42 d(停藥7 d)時(shí)各組腎臟仍出血、淤血；3組和4組腎小管上皮細(xì)胞腫脹與管壁分離，官腔縮小(圖3C)。

圖3 肉雞腎臟的組織病理學(xué)變化(H.E.染色)

3 討論

3.1 地克珠利在肉雞肝臟和肌肉中的沉積規(guī)律 本試驗(yàn)結(jié)果表明，肉雞肝臟和胸肌地克珠利沉積量隨添加量增高而增大，隨停藥時(shí)間延長，沉積量逐漸降低，通過預(yù)測模型推算出胸肌和肝臟中地克珠利半衰期分別長達(dá)52.4～61.1 d和19.9～20.9 d。張可煜等[7]報(bào)道地克珠利在雛雞體內(nèi)吸收快但消除慢；文麗等[8]研究表明，以3 mg/L地克珠利飲水給藥9 d，地克珠利在雞體內(nèi)的沉積量由高到低順序?yàn)楦闻K、血漿、腎臟、肌肉和皮膚?？梢姷乜酥槔陔u體內(nèi)沉積量具有顯著劑量—效應(yīng)關(guān)系和器官差異。

3.2 地克珠利在組織器官中的沉積量與血清生化指標(biāo)的相關(guān)性 據(jù)報(bào)道地克珠利可顯著提高患球蟲病肉雞血清總蛋白含量和機(jī)體抗氧化能力[9-10]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肉雞胸肌和肝臟中地克珠利沉積量與血清淀粉酶和總超氧化物歧化酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，肝臟中地克珠利沉積量與血清總蛋白含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；地克珠利可導(dǎo)致肉雞肝臟、腎臟組織發(fā)生病理變化，這可能是導(dǎo)致血清生化指標(biāo)發(fā)生變化的原因。

3.3 地克珠利對肉雞主要臟器組織學(xué)結(jié)構(gòu)的影響 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加不同劑量地克珠利預(yù)混劑導(dǎo)致肉雞肝臟、脾臟和腎臟不同程度病理組織學(xué)變化，且隨添加量增大，組織病變加重。胡友蘭等[11]研究報(bào)道，氯苯胍中毒導(dǎo)致雞脾臟表面血管充血，隨用藥時(shí)間延長和藥物劑量加大，脾臟的損害程度加劇。冀貞陽[12]報(bào)道顯示，雛雞連喂8 d磺胺二甲嘧啶，脾臟出現(xiàn)出血性梗死和腫脹等病理變化，雛雞連喂8～10 d磺胺喹噁啉，血液紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞減少，腎臟功能受損。劉秀蘭等[13]報(bào)道顯示，克球粉中毒的羅曼雞脾臟出現(xiàn)淤血。黃言鈞等[14]發(fā)現(xiàn)，地克珠利中毒的病死雞具有典型藥物性肝炎癥狀。本試驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，飼用地克珠利預(yù)混劑對肉雞肝臟、脾臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)有損傷。

3.4 抗球蟲藥停藥期的建議 本試驗(yàn)結(jié)果表明，停藥后3～14 d地克珠利在肉雞肝臟和胸肌的沉積量均未超過《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定限量范圍，但發(fā)現(xiàn)該藥沉積后消除較慢。獸藥殘留對人類健康的危害呈慢性、遠(yuǎn)期和累積性，長期攝入低劑量藥物，其蓄積存在可導(dǎo)致器官病變甚至存在癌變的風(fēng)險(xiǎn)[15-16]?？梢娧娱L停藥期或采用無抗養(yǎng)殖模式對保障雞體健康和肉品質(zhì)量安全是十分必要的。