劉 馨 ， 田永路 ， 王海良 ， 李夏瑩 ， 潘保良

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 ， 北京 海淀 100871 ；3.北京市獸藥監(jiān)察所 ， 北京 大興 102629)

寄生于皮毛上的螨蟲(chóng)是實(shí)驗(yàn)小鼠常見(jiàn)的病原體，常見(jiàn)的有鼷鼠肉螨(Myobiamusculi)、親近雷螨(Radfordiaaffinis)、鼠癬螨(Myocoptesmusculinis)[1]。其中，鼷鼠肉螨對(duì)小鼠的致病性最強(qiáng)。螨感染后會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)潰瘍性皮炎[2-3]、全身免疫反應(yīng)[4-5]、生殖指數(shù)下降[2]，從而影響科學(xué)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。有數(shù)據(jù)表明，在北美洲實(shí)驗(yàn)小鼠螨的感染率達(dá)到12%[6]。實(shí)驗(yàn)小鼠被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究當(dāng)中，在我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中偶有發(fā)現(xiàn)鼷鼠肉螨的感染，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)鼷鼠肉螨感染的報(bào)道較少，鼷鼠肉螨的具體形態(tài)學(xué)觀察的文獻(xiàn)大多是模式圖，很少有鏡下形態(tài)學(xué)相關(guān)圖片，并且目前國(guó)內(nèi)對(duì)于鼷鼠肉螨的分子鑒定方面尚未有報(bào)道。本試驗(yàn)報(bào)道實(shí)驗(yàn)小鼠感染鼷鼠肉螨的案例，收集整理了鼷鼠肉螨的鏡下形態(tài)學(xué)圖像，并建立了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)分子鑒定方法，以期為從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的工作人員提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)C57BL/6J小鼠，10周齡，飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠具(IVC)系統(tǒng)，感染小鼠撥開(kāi)體表被毛后可見(jiàn)體表有毛屑樣物質(zhì)，其他臨床癥狀不明顯。

1.2 儀器設(shè)備 倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)，奧林巴斯有限公司產(chǎn)品；基因擴(kuò)增儀，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試劑 丁香油、樹(shù)膠，均購(gòu)自阿拉丁公司；乙醇，購(gòu)自北京化工廠；通用基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；2×TaqPCR Mix，購(gòu)自北京匯天東方科技有限公司。

1.4 診斷方法

1.4.1 透明膠紙法 在小鼠清醒狀態(tài)下，固定小鼠，在每只小鼠的頭部、頸部、腹部、背部粘貼1條4 cm ×2 cm的透明膠帶。之后將膠帶粘貼到載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下檢查是否存在螨蟲(chóng)或螨蟲(chóng)卵。

1.4.2 被毛采集法 小鼠進(jìn)行輕微麻醉或安樂(lè)死后，立即將其置于解剖光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行全身毛皮檢查，用鑷子分開(kāi)毛發(fā)，從口角開(kāi)始到尾基部結(jié)束，重點(diǎn)檢查后頸部、腹部?jī)蓚?cè)和腹股溝區(qū)域，采集被毛觀察并收集螨蟲(chóng)卵或成蟲(chóng)，用于形態(tài)學(xué)詳細(xì)觀察和PCR檢測(cè)。

1.5 螨蟲(chóng)封片的制作 用解剖針挑取小鼠皮膚上的螨蟲(chóng)，或采集螨蟲(chóng)感染部位的皮毛，將其放到載玻片上，分別于30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%等不同濃度的酒精中浸泡脫水(各0.5～1 h)，之后用1∶1無(wú)水乙醇和丁香油混合溶液、丁香油原液分別透明0.5～1 h，用樹(shù)膠封片后在顯微鏡下觀察。

1.6 PCR方法檢測(cè)并鑒定鼷鼠肉螨 建立鼷鼠肉螨PCR快速檢測(cè)方法，首先需要選取適合的基因。在大多數(shù)研究中，18S rRNA基因通常用于螨蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育分析，該基因也能用于螨的分子鑒定。本試驗(yàn)選定18S rRNA基因(引物MC-18S-F1：5′-CTTGCTCAAAGATTAAGCCATGCA-3′，MC-18S-F2：5′-TGA TCCTTCCGCAGGTTCACCT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增[7]，應(yīng)用于小鼠體表鼷鼠肉螨的檢測(cè)。首先采集皮毛通過(guò)顯微鏡進(jìn)行觀察，選擇含有疑似鼷鼠肉螨和卵的樣品。之后篩選出陽(yáng)性樣本，用組織DNA提取試劑盒提取DNA，于-20 ℃保存。未感染小鼠的毛發(fā)作為陰性對(duì)照。PCR檢測(cè)總反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×TaqPCR Mix，1 μL正向引物，1 μL反向引物，6 μL 模板DNA，2 μL Nuclease-free water。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 10 s，1個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司使用ABI 3730XL DNA分析儀進(jìn)行測(cè)序，將得到的測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在顯微鏡下，所檢出的螨蟲(chóng)大體形態(tài)特征如圖1～4所示：蟲(chóng)體呈白色，長(zhǎng)橢圓形，中央稍寬，前后兩端稍窄，與其他種類(lèi)的螨蟲(chóng)一樣，有4對(duì)足，第1對(duì)足壓縮變短，位于頭部頂端，螨用其抓附鼠毛，后3對(duì)足均由5節(jié)組成，且跗節(jié)末端各有1根爪樣的構(gòu)造(爪間突爪)，呈鐮刀狀[8]。螨蟲(chóng)后3對(duì)足的體側(cè)緣有明顯外突的現(xiàn)象。口器小，有的蟲(chóng)體伸出的口器較長(zhǎng)，有小而簡(jiǎn)單的須肢及匕首狀的螯肢。背部、腹部均分布有剛毛，其中尾端有2根特征性的后端毛，從尾乳突中長(zhǎng)出。

圖1 雄性鼷鼠肉螨(腹面)

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，初步確定小鼠感染螨蟲(chóng)為鼷鼠肉螨(M.musculi)。鼷鼠肉螨與另一種親近雷螨(Radfordiaaffinis)形態(tài)上非常相近，但其與鼷鼠肉螨的區(qū)別是第2對(duì)足有1對(duì)跗爪，而本試驗(yàn)觀察到的蟲(chóng)體只有1只跗爪，所以該螨很可能為鼷鼠肉螨。

2.1.1 鼷鼠肉螨雄蟲(chóng)形態(tài)學(xué) 鼷鼠肉螨雄蟲(chóng)大小為(0.325～0.479) mm×(0.186～0.217) mm(n=5)，體型與雌蟲(chóng)相比較小，有較長(zhǎng)的口器，體表分布有剛毛，尾端有1對(duì)相互靠近的尾乳突，每個(gè)尾乳突上各有1根明顯的剛毛。雄螨的尾乳突相互靠近，依靠尾乳突之間的距離可以辨別雄螨和雌螨。體表有清晰的條紋狀紋路結(jié)構(gòu)。背面和腹面結(jié)構(gòu)無(wú)可清晰分辨的特殊性結(jié)構(gòu)(圖1、圖2)。

圖2 雄性鼷鼠肉螨(背面)

2.1.2 鼷鼠肉螨雌蟲(chóng)形態(tài)學(xué) 鼷鼠肉螨雌蟲(chóng)大小為(0.404～0.529) mm×(0.211～0.233) mm(n=5)，體表分布有剛毛，尾端的尾乳突與雄性相比相距較遠(yuǎn)，2根剛毛從尾乳突中長(zhǎng)出，長(zhǎng)而明顯，肛門(mén)位于體后緣。雌螨體表紋路模糊，腹部可見(jiàn)大量圓形孕卵存在。背面和腹面結(jié)構(gòu)無(wú)可清晰分辨的特殊性結(jié)構(gòu)(圖3、圖4)。

圖4 雌性鼷鼠肉螨(背面)

2.1.3 鼷鼠肉螨蟲(chóng)卵形態(tài)學(xué) 鼷鼠肉螨的蟲(chóng)卵形態(tài)如圖5所示：蟲(chóng)卵呈寬橢圓形，大小約為0.196 mm×0.09 mm(n=5)，緊密附著在小鼠的絨毛基部或中部。蟲(chóng)卵黏著處有一層膠性物質(zhì)，除去膠性物質(zhì)后，光鏡下的蟲(chóng)卵卵殼表面光滑，無(wú)特殊構(gòu)造。

圖5 鼷鼠肉螨卵

2.2 鼷鼠肉螨的分子鑒定 對(duì)鏡檢螨陽(yáng)性樣本所提取的DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示，樣本均可檢出鼷鼠肉螨靶標(biāo)基因特異性目的片段，大小約1 807 bp，與預(yù)期片段大小相符。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序得到基因序列。將獲得的鼷鼠肉螨基因序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示得到的DNA序列與國(guó)際上公布的鼷鼠肉螨18S rRNA序列(GenBank登錄號(hào)為JF934703.1)同源性達(dá)98.68%。本試驗(yàn)中檢測(cè)出的鼷鼠肉螨18S rRNA基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的部分蟲(chóng)株18S rRNA序列構(gòu)建的分子進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖7。PCR擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果從分子水平證明了鼷鼠肉螨的感染。

圖6 鼷鼠肉螨核酸瓊脂糖凝膠電泳

圖7 Myobia musculi 18S rRNA基因組序列遺傳進(jìn)化分析

3 討論

實(shí)驗(yàn)小鼠被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥開(kāi)發(fā)、教學(xué)實(shí)驗(yàn)、藥品生產(chǎn)、生物檢定等方面，隨著國(guó)內(nèi)科研水平的提高，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)間動(dòng)物的交換日益頻繁，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的使用數(shù)量日益增加，實(shí)驗(yàn)小鼠寄生蟲(chóng)感染問(wèn)題日益凸顯。

鼷鼠肉螨是小鼠感染最常見(jiàn)的螨蟲(chóng)之一，常寄生在小鼠的頭部、頸部和背部，通過(guò)直接接觸和間接接觸在種群中進(jìn)行傳播。小鼠感染鼷鼠肉螨后會(huì)出現(xiàn)一系列臨床癥狀和生理學(xué)反應(yīng)，這對(duì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性會(huì)造成不良影響。對(duì)鼷鼠肉螨易感程度最高的為野生鼷鼠，這一品種的小鼠即使是感染少數(shù)的鼷鼠肉螨，也會(huì)引起脫毛、皮膚紅斑、瘙癢、表皮剝脫、潰瘍、膿皮病等反應(yīng)[9]。在本試驗(yàn)觀察過(guò)程中，C57BL/6J小鼠未發(fā)生明顯的臨床癥狀，因?yàn)樵撈废敌∈笫且吧蟮淖兎N，在馴化過(guò)程中可能會(huì)降低其對(duì)鼷鼠肉螨的易感性。但是如果長(zhǎng)期不對(duì)患病小鼠進(jìn)行治療處理，可能仍會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀。

有研究對(duì)鼷鼠肉螨成蟲(chóng)大小進(jìn)行了測(cè)量，雌螨體長(zhǎng)400～500μm，雄螨體長(zhǎng)280～320μm，體寬均在160～180μm[10]。本試驗(yàn)對(duì)發(fā)現(xiàn)的螨蟲(chóng)進(jìn)行了體長(zhǎng)和體寬的測(cè)量，雌螨大小為(0.404～0.529)mm×(0.211～0.233)mm(n=5)，大小與文獻(xiàn)所報(bào)道的范圍基本一致；雄蟲(chóng)大小為(0.325～0.479)mm×(0.186～0.217)mm(n=5)，大小略大于文獻(xiàn)報(bào)道的大小范圍。由于鼷鼠肉螨的體型很小，正常情況下肉眼難以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)小鼠感染鼷鼠肉螨時(shí)，往往已經(jīng)感染十分嚴(yán)重，所以需要尋找一種有效、快速的檢測(cè)方法，以便在感染初期就能檢測(cè)到鼷鼠肉螨，有利于早期對(duì)鼷鼠肉螨進(jìn)行有效防控。

有多種方法可采集鼷鼠肉螨并進(jìn)行檢測(cè)，如透明膠紙法、被毛采集法、皮膚刮擦法等。透明膠紙法操作最為簡(jiǎn)便，所以在檢測(cè)初期，本試驗(yàn)采用該方法對(duì)小鼠感染情況進(jìn)行了檢測(cè)，但是在使用該方法過(guò)程中，陽(yáng)性小鼠檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)了假陰性的情況，所以本試驗(yàn)結(jié)合了多個(gè)部位采集毛發(fā)的方法對(duì)小鼠進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合被毛采集法后，能有效提高檢出率。有研究報(bào)道，皮膚刮擦法是最有效的檢測(cè)方法，但該方法需要對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉或安樂(lè)死后方可進(jìn)行，容易對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠造成損傷，而且這種方法工作量大，檢出效率低，不利于快速對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的整體感染情況進(jìn)行檢查[11]。PCR檢測(cè)方法能夠通過(guò)使用拭子對(duì)整個(gè)動(dòng)物、籠舍、架子等進(jìn)行全面采樣，從而減少工作量，提高檢出率[12]，未來(lái)可作為鼷鼠肉螨的檢測(cè)方法之一。建立PCR檢測(cè)方法首先需要找到合適的檢測(cè)基因，本試驗(yàn)選擇了鼷鼠肉螨18S rRNA基因?qū)︾R檢陽(yáng)性樣本進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，該P(yáng)CR方法能有效擴(kuò)增出鼷鼠肉螨的目的片段，與Lee等得出的結(jié)果一致，證明PCR檢測(cè)方法可用于鼷鼠肉螨的檢測(cè)[13]。