劉子寧 ， 湯新明 ， 梁 琳 ， 崔尚金

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 ， 北京 海淀 100193 ； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)北京科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站 ， 北京 海淀 100193)

疫苗免疫是防控人類(lèi)和動(dòng)物疫病最經(jīng)濟(jì)有效的策略。以適宜的病毒、細(xì)菌等微生物或寄生蟲(chóng)為載體的活載體疫苗具有安全性高、能激發(fā)宿主多類(lèi)型免疫應(yīng)答、不需要佐劑等優(yōu)勢(shì)，是目前疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。其中，以病毒為疫苗載體的研究最為廣泛，技術(shù)也最為成熟，并且已有許多商品化的重組病毒載體疫苗。副流感病毒5型(Parainfluenza virus type 5，PIV5)為單負(fù)鏈RNA病毒，感染宿主范圍廣，單獨(dú)感染一般不引起臨床癥狀，致病性低。其基因組相對(duì)穩(wěn)定，易于培養(yǎng)和進(jìn)行遺傳操作，具有作為疫苗載體的潛能。本文闡述PIV5的病原學(xué)特點(diǎn)、作為疫苗載體的優(yōu)勢(shì)，及表達(dá)異源抗原的重組PIV5激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的能力和針對(duì)相應(yīng)抗原的免疫保護(hù)力，為載體疫苗的設(shè)計(jì)與研制提供參考。

1 副流感病毒5型概述

PIV5屬副黏病毒科(Paramyxoviridae)、腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)成員，為單股負(fù)鏈RNA病毒，能夠從多種哺乳動(dòng)物及細(xì)胞培養(yǎng)物中分離得到。根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)學(xué)委員會(huì)(ICTV)網(wǎng)站公布的記錄顯示，首次將該病毒命名為PIV5的時(shí)間為2009年。已報(bào)道的PIV5宿主包括人、猴、犬、豬、牛、虎和小熊貓等[1]。盡管PIV5可感染多種哺乳動(dòng)物，但PIV5各毒株間基因序列較為保守，突變水平低，基因組在體內(nèi)和體外都展現(xiàn)出較低的多樣性，且無(wú)跡象顯示其基因組間差異存在免疫或宿主特異性[2]；PIV5多由人類(lèi)圈養(yǎng)的家畜、寵物以及動(dòng)物園動(dòng)物體內(nèi)分離得到，其首次分離報(bào)道來(lái)自一圈養(yǎng)猴，但同時(shí)在野生猴體內(nèi)未檢測(cè)到PIV5抗體，提示了動(dòng)物可能是通過(guò)接觸人類(lèi)而感染的，人類(lèi)更可能是PIV5的自然宿主。PIV5致病力弱，單純的PIV5感染一般不引起臨床癥狀，一些PIV5毒株與其他病原混合感染可出現(xiàn)臨床癥狀，如犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)與支氣管敗血波氏桿菌(B.bronchiseptica)、犬腺病毒(Canine adenovirus，Ad)、犬支原體(M.canis)等病原體混合感染可引起犬傳染性呼吸道病(Canine infectious respiratory disease,CIRD)[3]，常在犬舍引起整窩幼犬感染，臨床癥狀為鼻塞、咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱、嗜睡和下呼吸道感染[4]，俗稱(chēng)“犬窩咳”。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，反向遺傳操作技術(shù)成為生物體基因功能及應(yīng)用研究的主要工具。對(duì)病毒而言，其基因組一般較小，基因序列較易獲得，借助細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選，在體外條件下拯救病毒已不是障礙。由于負(fù)鏈RNA病毒的組裝需依賴(lài)RNA聚合酶和病毒結(jié)構(gòu)蛋白組成的核糖核蛋白復(fù)合體(Ribonucleo-protein complex,RNPs)，其拯救相對(duì)DNA病毒和正鏈RNA病毒來(lái)說(shuō)難度較大。近來(lái)年反向遺傳操作技術(shù)不斷發(fā)展，已有PIV5感染性克隆平臺(tái)成功建立的報(bào)道，構(gòu)建重組PIV5載體疫苗成為了可能。PIV5作為疫苗載體具有安全性高(致病力弱)、穩(wěn)定性強(qiáng)(基因組變異小)、感染宿主范圍廣泛、易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)，不斷有其作為載體表達(dá)狂犬病病毒[5]、高致病性禽流感病毒(HPAI)[6]、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)[7]等高危病原體的保護(hù)性抗原，制備重組PIV5載體疫苗并進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià)的報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)主要從事寵物疫病免疫防控產(chǎn)品的研制，針對(duì)PIV5和本實(shí)驗(yàn)室分離的CPIV5毒株的病原學(xué)特性，認(rèn)為CPIV5是理想的疫苗活載體，具有開(kāi)發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。

2 副流感病毒5型病原學(xué)特點(diǎn)

PIV5屬單負(fù)鏈RNA病毒目、副黏病毒科、副黏病毒亞科、腮腺炎病毒屬病毒。病毒粒子呈多形性，直徑在50～300 nm。病毒粒子的核衣殼呈螺旋對(duì)稱(chēng)，厚度約17 nm，外有囊膜包被，主要成分為來(lái)源于宿主細(xì)胞的脂質(zhì)體。囊膜表面有密集的纖突結(jié)構(gòu)，包括血凝素-神經(jīng)酪氨酸酶糖蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein,HN)和融合蛋白(Fusion protein,F)2種纖突蛋白，該纖突結(jié)構(gòu)與病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞有關(guān)，也是抗體中和病毒的靶標(biāo)。PIV5可在多種人和動(dòng)物細(xì)胞上生長(zhǎng)并獲得高滴度培養(yǎng)產(chǎn)物，常用Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞和MDBK細(xì)胞，較少引起細(xì)胞病變[2]。

PIV5基因組為不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA，基因片段大約15.5 kb，共包括7個(gè)基因，編碼8種蛋白，從3′端到5′端依次為核衣殼蛋白(Neucleocapsid,NP)、磷酸化蛋白(Phosphoprotein,P)或輔助蛋白(Accessory protein,V)、膜基質(zhì)蛋白(Matrix protein，M)、融合蛋白F、小疏水性蛋白(Small hydrophobic protein,SH)、血凝素-神經(jīng)酪氨酸酶蛋白HN和大聚合酶蛋白(Large polymerase protein,L)，它們?cè)赑IV5整個(gè)生命周期里的總表達(dá)量依次遞減[8]，具有梯度轉(zhuǎn)錄的特性，這8種蛋白在病毒粒子表面的排布結(jié)構(gòu)如圖1所示。盡管PIV5可以從人和多種不同哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離得到，但對(duì)來(lái)自人、猴、豬和犬的多個(gè)PIV5毒株進(jìn)行序列分析和比對(duì)顯示，其總核苷酸差異不超過(guò)7.8%，兩兩毒株間的平均差異僅為2.1%，且差異氨基酸隨機(jī)分布，在不同宿主來(lái)源的毒株間無(wú)特定規(guī)律，提示該病毒的宿主特異性較低[2,9]。其中變化最顯著的是SH基因編碼的氨基酸，一些犬源和豬源PIV5的SH基因功能不全或缺失，可作為PIV5毒株間的差異化分子標(biāo)記。由于SH蛋白可以抑制TNF-α分泌，阻斷其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10]，缺失SH基因的PIV5細(xì)胞病變作用增強(qiáng)，同時(shí)誘導(dǎo)更強(qiáng)大的清除性免疫，比野生型PIV5更適合作為疫苗載體[11]。

圖1 副流感病毒5型結(jié)構(gòu)示意圖

3 副流感病毒5型感染性克隆平臺(tái)的構(gòu)建

3.1 反向遺傳學(xué) PIV5載體的構(gòu)建主要利用反向遺傳學(xué)(Reversed genetics)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。反向遺傳學(xué)技術(shù)是通過(guò)操縱基因組來(lái)進(jìn)行基因突變、替換、插入和缺失，進(jìn)而觀察其對(duì)表型的影響的技術(shù)。病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)即是以病毒為研究對(duì)象，將病毒的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在DNA層面對(duì)病毒基因組進(jìn)行研究和改造，再將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞或生物體內(nèi)組裝為新的病毒，稱(chēng)為病毒拯救。基于反向遺傳操作平臺(tái)，既可實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒基因功能及致病機(jī)理的基礎(chǔ)研究，又可實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒致弱或插入外源基因等的改造，是人類(lèi)在病毒研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)。

3.2 PIV5反向遺傳操作平臺(tái)構(gòu)建 相較于正鏈RNA病毒，負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳操作系統(tǒng)較難建立。負(fù)鏈RNA病毒裸露的負(fù)鏈基因組或正鏈反基因組都不能作為啟動(dòng)感染循環(huán)的模板，產(chǎn)生的子代病毒不具有感染性，只有在宿主RNA聚合酶作用下與結(jié)構(gòu)蛋白NP、P、L共同構(gòu)成RNP后才能產(chǎn)生具有感染性的子代病毒。PIV5反向遺傳操作系統(tǒng)建立的要點(diǎn)首先是構(gòu)建正確的全長(zhǎng)質(zhì)粒，再分別構(gòu)建表達(dá)NP、P、L蛋白的輔助質(zhì)粒，將4種質(zhì)粒以適當(dāng)?shù)谋壤厕D(zhuǎn)染能夠提供T7聚合酶的真核細(xì)胞系，實(shí)現(xiàn)病毒拯救。由于真核細(xì)胞不表達(dá)T7聚合酶，需額外引入，目前常用的方式有4種：(1)使用能提供T7聚合酶的重組痘病毒MVA-T7在轉(zhuǎn)染前感染細(xì)胞[12]；(2)構(gòu)建表達(dá)T7聚合酶的重組細(xì)胞系，如以BHK-21細(xì)胞系為基礎(chǔ)構(gòu)建的BSR-T7細(xì)胞系；(3)使用編碼T7聚合酶的質(zhì)粒與4個(gè)病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞[13]；(4)使用真核細(xì)胞自身的RNA聚合酶系統(tǒng)(Pol Ⅱ系統(tǒng))，這種方法不需要添加T7聚合酶，適用細(xì)胞種類(lèi)更廣，據(jù)報(bào)道對(duì)副黏病毒科病毒的拯救效率高于T7聚合酶系統(tǒng)[14]。

3.3 外源基因的插入 副黏病毒科病毒的NP蛋白需要結(jié)合6個(gè)堿基才能與病毒基因組相互作用，因此病毒基因組的堿基數(shù)目必須是6的倍數(shù)才能有效復(fù)制，該復(fù)制原則被稱(chēng)為“六堿基原則”。當(dāng)插入外源基因后不滿足該原則時(shí)，需要額外補(bǔ)充堿基使重組病毒總長(zhǎng)度為6的倍數(shù)。PIV5從3′末端起始轉(zhuǎn)錄，基因起始序列(GS)和終止序列(GE)指引RNP按順序依次對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。拯救重組不分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒(Nonsegmented negative-strand RNA virus，NNSV)時(shí)，外源基因會(huì)以獨(dú)立的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)。第1個(gè)被插入至PIV5基因組的外源基因是綠色熒光蛋白(GFP)基因，表達(dá)GFP蛋白的PIV5(rPIV5-GFP)具有與野生型PIV5一樣的活性，為PIV5作為疫苗載體表達(dá)其他病毒保護(hù)性抗原成分的研究奠定了基礎(chǔ)[12]。早期的研究指出，插入外源基因片段越大對(duì)PIV5載體在體內(nèi)復(fù)制的影響越大，而增加小片段插入基因的數(shù)量未發(fā)現(xiàn)對(duì)載體的復(fù)制有明顯影響，但重組病毒基因組總長(zhǎng)度不能太長(zhǎng)，PIV5可接受1～3個(gè)外源基因的插入，總長(zhǎng)度在4～5 kb，為了容納更多的外源核苷酸可以移除PIV5的SH基因[7]。此外，由于PIV5具有梯度轉(zhuǎn)錄的特性，外源基因的插入位置離啟動(dòng)子越近，表達(dá)效率越高，越遠(yuǎn)則越低；但是，有報(bào)道指出外源基因插入啟動(dòng)子和NP基因之間無(wú)法產(chǎn)生有活性的病毒粒子，插入NP基因和V/P基因之間病毒在生長(zhǎng)時(shí)存在缺陷[11]，提示外源基因插入越靠近啟動(dòng)子處，載體的衰減作用越強(qiáng)?，F(xiàn)存的PIV5載體疫苗多采用將外源基因插入HN基因和L基因之間的保守方法[6,11,15-16]，但也有將外源基因插入SH基因和HN基因之間[17]能夠誘導(dǎo)宿主更強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答的報(bào)道。

4 副流感病毒5型作為表達(dá)載體的優(yōu)勢(shì)

PIV5作為新型疫苗載體有許多突出的優(yōu)勢(shì)：(1)PIV5安全性高，單獨(dú)感染人和大多數(shù)動(dòng)物均不造成臨床疾病，而同屬副黏病毒科的其他病毒如新城疫病毒(NDV)、犬瘟熱病毒(CDV)等，由于它們本身對(duì)易感動(dòng)物的致病性較強(qiáng)，以這些病毒制備的疫苗發(fā)生毒力返強(qiáng)、毒力殘留的風(fēng)險(xiǎn)比PIV5更高、影響更大。即便CPIV與其他病原體混合感染對(duì)犬具有一定致病性，但其弱毒疫苗株長(zhǎng)期與犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬傳染性肝炎病毒制成聯(lián)苗應(yīng)用于犬只[18]，提示致弱的CPIV疫苗株作為疫苗載體也具有較高的安全性；(2)PIV5基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，便于多種外源基因的插入，插入的外源基因以獨(dú)立的開(kāi)放閱讀框轉(zhuǎn)錄翻譯，在病毒傳代過(guò)程中不易丟失和突變[19]，且外源基因插入合適的位點(diǎn)載體毒力不變，使PIV5比許多正鏈RNA病毒如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)[10]和豬塞內(nèi)卡病毒[20]更加適用于作為疫苗載體；此外，PIV5遺傳穩(wěn)定，各毒株間差異小，幾乎不與其他病毒發(fā)生基因重排，進(jìn)一步增加了其作為疫苗載體的安全性；(3)PIV5僅在胞漿中進(jìn)行復(fù)制，遺傳物質(zhì)為RNA，不存在DNA階段，病毒基因組不會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，幾乎不與宿主基因發(fā)生交換，不會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生負(fù)面影響；傳統(tǒng)DNA病毒載體如痘病毒、腺病毒、皰疹病毒等，雖然易于構(gòu)建感染性克隆平臺(tái)，但其基因組復(fù)制需要在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行，病毒DNA有錯(cuò)配遺留在宿主細(xì)胞內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)，體外細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中也存在細(xì)胞轉(zhuǎn)化，相比負(fù)鏈RNA病毒存在一定風(fēng)險(xiǎn)[21]；(4)PIV5易于培養(yǎng)，大規(guī)模生產(chǎn)成本低，可用多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系培養(yǎng)并獲得高滴度培養(yǎng)產(chǎn)物，Vero細(xì)胞培養(yǎng)可得到8×108PFU/mL的病毒液；(5)動(dòng)物先前暴露于PIV5野毒或疫苗株均不會(huì)妨礙PIV5載體疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度[18]，提示PIV5載體疫苗可以使用或重復(fù)使用于任何免疫背景的動(dòng)物，如有報(bào)道指出PIV5為載體的疫苗所誘導(dǎo)的抗體滴度是目前在美國(guó)市場(chǎng)流通的其他種類(lèi)疫苗的3倍[13]；(6)PIV5免疫途徑多樣，不局限于注射給藥，鼻內(nèi)給藥或口服給藥都能達(dá)到良好的免疫效果，適用于動(dòng)物群體的大面積應(yīng)用；(7)PIV5能夠全面的激活宿主的免疫應(yīng)答，調(diào)動(dòng)全身性體液免疫、細(xì)胞免疫及局部黏膜免疫，產(chǎn)生高效、廣范、持續(xù)的免疫應(yīng)答，特別是具有高效誘導(dǎo)呼吸道黏膜免疫的能力。

PIV5為載體的疫苗比其他病毒載體制備的疫苗具有更優(yōu)越的免疫保護(hù)性。以H1N1-NP蛋白為外源基因分別插入VACV、腺病毒5型(Ad5)和PIV5制得VV-NP、Ad5-NP和PIV5-NP，分別研究其免疫原性，結(jié)果表明PIV5-NP的免疫保護(hù)性最佳，單次接種106PFU的PIV5-NP對(duì)攻毒致死劑量H1N1的小鼠的免疫保護(hù)率為100%，且小鼠體重僅減輕10%～20%[22]；而Ad5-NP對(duì)同樣處理的小鼠的免疫保護(hù)率是80%且小鼠體重減輕30%[23]，這可能與腺病毒未成功誘導(dǎo)呼吸道黏膜免疫有關(guān)，在表達(dá)中東呼吸綜合征冠狀病毒刺突蛋白(MERS-S)的Ad5中也可觀察到重組病毒無(wú)法誘導(dǎo)黏膜免疫的現(xiàn)象[24]；而VV-NP在這項(xiàng)試驗(yàn)中未發(fā)揮免疫保護(hù)作用。在使用多個(gè)不同載體表達(dá)MERS-S制備疫苗的對(duì)比試驗(yàn)中，PIV5載體疫苗也具有明顯的優(yōu)勢(shì)，只需單次接種104PFU PIV5-MERS-S即可100%保護(hù)攻毒小鼠免于死亡，而RABV-MERS-S則需3次接種10 μg重組病毒粒子才能達(dá)到相同的保護(hù)效果[25]。在已報(bào)道的MERS載體疫苗中，PIV5載體疫苗的效果較好。

5 重組副流感病毒5型表達(dá)其他病原抗原的免疫保護(hù)力

5.1 重組PIV5表達(dá)流感病毒抗原 流感病毒HA蛋白是PIV5作為疫苗載體首次表達(dá)的外源病毒蛋白[26]，表達(dá)H5N1和H3N2 HA蛋白的重組PIV5(rPIV5-HA)在小鼠體內(nèi)都具有良好的免疫原性。PIV5在表達(dá)膜蛋白時(shí)能夠把外源病毒蛋白展示在重組病毒膜表面，高效地刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)外源蛋白的特異性抗體[27]，在小鼠模型中證實(shí)了其具有良好的免疫保護(hù)性[17]。流感病毒HA蛋白的突變率較高，rPIV5-HA不能提供很好的交叉免疫，而流感病毒NP蛋白序列較為保守，繼rPIV5-HA后即出現(xiàn)了表達(dá)NP蛋白的PIV5(rPIV5-NP)。rPIV5-NP在小鼠模型內(nèi)對(duì)致死劑量的H1N1攻毒具有100%的免疫保護(hù)性，但小鼠存在10%～20%的體重減輕，肺組織仍然會(huì)受到病毒侵襲。NP蛋白重組痘病毒(VV-NP)幾乎不具有免疫保護(hù)性；NP蛋白重組腺病毒(Ad5-NP)免疫的小鼠有20%死亡，存活小鼠的體重減輕達(dá)30%，相比較而言rPIV5-NP的免疫保護(hù)性明顯要優(yōu)越得多[23]，這揭示了PIV5比傳統(tǒng)載體病毒更具作為通用型流感疫苗載體的價(jià)值。此外，由于流感病毒表面蛋白NA較HA的突變率低，表達(dá)NA蛋白的重組PIV5(rPIV5-NA)也比rPIV5-HA能產(chǎn)生更廣泛的交叉免疫。有研究證明，rPIV5-NA可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)H5N1和H1N1高效的中和抗體，且明顯減輕臨床癥狀[6]，為PIV5作為通用型流感疫苗載體的價(jià)值提供了進(jìn)一步證明。

5.2 重組PIV5表達(dá)狂犬病病毒抗原 狂犬病是一種高度接觸性、致死性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，盡管已有多種人用滅活狂犬病疫苗取得了不錯(cuò)的免疫效果，但很難應(yīng)用于流浪動(dòng)物和野生動(dòng)物狂犬病的防控，而這恰恰是狂犬病嚴(yán)重威脅人類(lèi)的根源。PIV5重組活載體疫苗免疫途徑多樣，有報(bào)道指出其經(jīng)口免疫的效價(jià)與口服狂犬病弱毒苗相當(dāng)，經(jīng)鼻免疫的效價(jià)甚至優(yōu)于狂犬病弱毒苗[28]，且比后者的生物安全性高，為流浪動(dòng)物和野生動(dòng)物狂犬病疫苗的研制提供了更優(yōu)選擇?？袢〔《咎堑鞍?Rabies virus gloycoprotein,RVG)是狂犬病病毒主要的表面抗原，它不僅決定病毒的致病性，還是刺激宿主產(chǎn)生特異性中和抗體、激活免疫應(yīng)答的主要蛋白。插入RVG基因的重組PIV5(rPIV5-RV)與rPIV5-HA一樣能夠把外源蛋白展示在重組病毒膜表面，高效地刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)狂犬病病毒的免疫應(yīng)答[28]。此外，當(dāng)進(jìn)行狂犬病緊急治療時(shí)，需要同時(shí)注射狂犬病疫苗和單克隆抗體，rPIV5-RV的一大優(yōu)勢(shì)是其不會(huì)被抗狂犬病毒單克隆抗體中和[5]，此時(shí)使用PIV5為載體的狂犬病疫苗比傳統(tǒng)滅活疫苗的效果更好。

5.3 重組PIV5表達(dá)人呼吸道合胞體病毒抗原 人呼吸道合胞體病毒(RSV)主要引起兒童、老人和免疫力低下人群細(xì)支氣管炎和肺炎[29-30]，尚無(wú)得到批準(zhǔn)的疫苗上市，亟待研發(fā)安全高效的RSV疫苗。PIV5載體主要表達(dá)RSV膜表面融合蛋白(PIV5-F)和糖蛋白(PIV5-G)，在小鼠感染模型中已證實(shí)單次接種106PFU的PIV5-F或PIV5-G接種均可誘導(dǎo)有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)，其中PIV5-F可誘導(dǎo)血清中和抗體，PIV5-G免疫小鼠體內(nèi)雖未檢測(cè)到血清中和抗體，但PIV5-G依然能有效降低小鼠肺部的RSV病毒載量。以非洲綠猴為模型的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PIV5-F可以最大程度的降低綠猴呼吸道內(nèi)RSV的病毒滴度，比PIV5-G的免疫保護(hù)效率高[14]。對(duì)PIV5-F和PIV5-G的體外和體內(nèi)培養(yǎng)都顯示，外源RSV基因在重組病毒傳代過(guò)程中持續(xù)保持高度穩(wěn)定，不易突變而丟失。但是，RSV基因的插入會(huì)影響PIV5基因組的穩(wěn)定性，使其在傳代過(guò)程中發(fā)生一定水平的突變[17]。所以PIV5為活載體的RSV疫苗的安全穩(wěn)定性還需進(jìn)一步研究。

5.4 重組PIV5表達(dá)痘病毒抗原 PIV5作為載體表達(dá)痘病毒(VACV)L1R和B5R的研究在小鼠感染模型內(nèi)也取得了成功[31]，這2種分泌蛋白是介導(dǎo)VACV胞內(nèi)成熟和囊膜包被的重要蛋白。PIV5-L1R/B5R免疫可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗VACV中和抗體，感染致死劑量VACV的小鼠經(jīng)鼻內(nèi)接種PIV5-L1R/B5R可顯著降低病毒引起的病理學(xué)損傷。盡管免疫PIV5-L1R/B5R的小鼠仍然存在一定程度的體重減輕，但是與對(duì)照組相比其減重較少且較慢。該研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PIV5-L1R/B5R免疫的小鼠可以免于感染VACV長(zhǎng)達(dá)1.5年以上，其VACV抗體水平持續(xù)保持高濃度。這一發(fā)現(xiàn)揭示了PIV5作為長(zhǎng)效疫苗載體的可能性。

5.5 重組PIV5表達(dá)中東呼吸綜合征冠狀病毒抗原 中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)感染人能夠造成嚴(yán)重的致死性呼吸道疾病，與2003年在我國(guó)暴發(fā)的SARS-CoV以及自2019年末至今席卷全球的2019-CoV同屬β屬冠狀病毒，親緣關(guān)系較密切，它們感染宿主細(xì)胞的主要膜蛋白均為刺突蛋白(Spike,S)，是冠狀病毒主要的保護(hù)性抗原成分。最近研究指出，表達(dá)MERS-CoV S蛋白的重組PIV5(PIV5-MERS-S)在hDPP4 KI小鼠模型內(nèi)被證實(shí)可以起到可靠而有效的免疫保護(hù)作用[7]。該研究還指出，PIV5-MERS-S主要依靠激發(fā)宿主強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)來(lái)發(fā)揮抵抗MERS-CoV感染的作用。PIV5-MERS-S免疫小鼠在攻毒MERS-CoV后可喚起強(qiáng)烈的MERS-S特異性CD8+T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，可完全保護(hù)小鼠免于死亡，其肺部的組織病理?yè)p傷也明顯減少。PIV5-MERS-S的免疫保護(hù)效果明顯優(yōu)于MERS滅活苗，單次免疫104PFU的PIV5-MERS-S即可保護(hù)100%的小鼠免于死亡，而滅活MERS-CoV僅可保護(hù)25%的小鼠。除此以外，現(xiàn)存MERS滅活苗和SARS滅活苗易引發(fā)超敏反應(yīng)的缺陷在PIV5-MERS-S免疫小鼠身上得到改善，PIV5-MERS-S造成的肺部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和玻璃樣變較MERS滅活苗少，但尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。盡管PIV5-MERS-S對(duì)肺內(nèi)病毒的清除率高于滅活的MERS-CoV，但尚不能實(shí)現(xiàn)完全的清除性免疫，研究者認(rèn)為，同時(shí)在PIV5載體內(nèi)插入MERS-CoV的M蛋白和N蛋白可以進(jìn)一步提高疫苗的病毒清除率?？傊?，PIV5-MERS-S比現(xiàn)存的滅活疫苗和許多傳統(tǒng)病毒為載體的MERS疫苗都更能少量高效地發(fā)揮免疫保護(hù)作用[25,32-34]，且不易發(fā)生超敏反應(yīng)，是非常有前景的MERS疫苗候選載體。PIV5作為MERS-CoV載體的效果優(yōu)越，預(yù)示著其同樣有潛力成為當(dāng)下流行的2019-CoV的載體。

5.6 重組PIV5表達(dá)結(jié)核桿菌抗原 PIV5除作為其他病毒蛋白的表達(dá)載體外，也可作為細(xì)菌蛋白的表達(dá)載體。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起人和動(dòng)物的結(jié)核病(TB)，是一類(lèi)胞內(nèi)寄生菌，常規(guī)抗生素療效不顯著，常呈現(xiàn)持續(xù)感染，嚴(yán)重危害機(jī)體健康。目前獲得批準(zhǔn)的結(jié)核病疫苗只有牛結(jié)核減毒活疫苗(BCG)，但其免疫效力較低，不能有效減少結(jié)核分枝桿菌形成的結(jié)核灶。以PIV5為載體表達(dá)結(jié)核分枝桿菌抗原85A(PIV5-85A)和85B(PIV5-85B)的疫苗在小鼠感染模型內(nèi)都能有效地減少肺內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌載量，其中PIV5-85A能最大程度地減少感染小鼠肺部的菌落形成單位(CFU)[35]。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，初次免疫BCG的小鼠在加強(qiáng)免疫PIV5-85A或PIV5-85B后能夠顯著提升BCG的免疫效力，細(xì)菌載量可減少103單位的CFU。這是首次有研究指出PIV5載體疫苗具有提升初次免疫的其他疫苗免疫效力的能力，拓寬了PIV5作為疫苗載體研究的領(lǐng)域。

6 展望

經(jīng)濟(jì)社會(huì)的快速發(fā)展改變了人與人、人與動(dòng)物之間的交流模式和頻率，使得一些疫病尤其是人獸共患傳染病的暴發(fā)呈現(xiàn)新的態(tài)勢(shì)，傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗已不能滿足許多疾病的防控需求，疫苗研制也由傳統(tǒng)疫苗的經(jīng)驗(yàn)性研制逐步過(guò)渡到依賴(lài)先進(jìn)免疫學(xué)理論和技術(shù)的新型疫苗研制。重組載體疫苗相比較于滅活疫苗更能高效地誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，過(guò)敏反應(yīng)也較輕；又比弱毒疫苗更具安全性，可以用于制備生物安全級(jí)別較高的病原體疫苗。選擇合適的載體病毒是研發(fā)重組載體疫苗的關(guān)鍵，PIV5在眾多病毒載體中優(yōu)勢(shì)顯著，雖然由于早期反向遺傳技術(shù)不夠成熟，投入市場(chǎng)使用的活載體疫苗還多以DNA病毒為基礎(chǔ)，但近年來(lái)負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳技術(shù)不斷完善，PIV5極大的潛能勢(shì)必在未來(lái)有極高的應(yīng)用前景。在獸醫(yī)領(lǐng)域，PIV5由于其感染犬的效率高、對(duì)大多數(shù)動(dòng)物安全性良好、基因組穩(wěn)定性高、易于培養(yǎng)、免疫途徑多樣和能夠全面激發(fā)免疫應(yīng)答等特點(diǎn)，作為動(dòng)物疫苗載體特別是作為犬貓狂犬病疫苗載體的優(yōu)勢(shì)突出，比同類(lèi)病毒中不具備感染犬能力的新城疫病毒(NDV)和對(duì)犬危害較大的犬瘟熱病毒(CDV)都更具優(yōu)勢(shì)；在人類(lèi)醫(yī)療領(lǐng)域，PIV5不致病又能經(jīng)呼吸道接種，高效誘導(dǎo)呼吸道黏膜免疫的能力使它作為呼吸道疾病疫苗的研究引人注目，特別是在2019年末以呼吸道感染和肺炎為代表性癥狀的COVID-2019出現(xiàn)并產(chǎn)生全球性的暴發(fā)后，PIV5作為呼吸道疾病疫苗載體的價(jià)值有望進(jìn)一步體現(xiàn)。