葉 狀，王樂樂，汪飛燕，劉 悅，彭月梅，宿世杰，候照峰，許金俊，陶建平，劉丹丹*

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州 225009；2.揚州大學(xué) 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009)

雞球蟲病(coccidiosis)是由艾美耳球蟲(spp.)引起的一種寄生于雞腸道黏膜內(nèi)的寄生性原蟲病，嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)。其中，毒害艾美耳球蟲()是引起雞小腸球蟲病的主要病原之一。近80年來，雞球蟲病的防治主要依賴化學(xué)藥物，導(dǎo)致了耐藥蟲株的出現(xiàn)，降低了抗球蟲藥物的使用效果，再加上全球消費者對獸藥殘留肉蛋等公共衛(wèi)生問題的關(guān)注，迫切需要尋找新的方法來防控雞球蟲病。卵囊是球蟲類寄生蟲在宿主間的傳播階段，而囊壁是抵抗外界不良環(huán)境、保有卵囊活力的重要屏障。卵囊壁主要由蛋白質(zhì)組成，是由位于配子體內(nèi)的成壁體蛋白經(jīng)酶解加工而成，其中酪氨酸交聯(lián)、二硫鍵的形成等氧化還原反應(yīng)在此過程中發(fā)揮重要作用。OXIO(oxioreductase)為具備催化電子轉(zhuǎn)移功能的一系列氧化還原酶的總稱。已有報道，在剛地弓形蟲()和柔嫩艾美耳球蟲()中鑒定到OXIO，預(yù)測其亞型OXIO1參與了CH-OH基團釋放氫離子的氧化還原反應(yīng)，從而參與了卵囊壁的形成，可以通過免疫阻斷作用阻斷卵囊發(fā)育。毒害艾美耳球蟲主要危害8～18周齡的雞，由于雞群飼養(yǎng)方式以及飼養(yǎng)周期的改變，導(dǎo)致臨床上毒害艾美耳球蟲病多發(fā)，并引起嚴重的小腸球蟲病，死亡率可達30%。本研究在課題組前期研究成果的基礎(chǔ)上，通過對毒害艾美耳球蟲配子體蛋白和卵囊壁蛋白的差異蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)分析，獲得差異表達的氧化還原酶EnOXIO1編碼基因，并對表達產(chǎn)物的抗原性進行分析與定位，同時對其功能進行初步鑒定，旨在為研制新型球蟲亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株與實驗動物

毒害艾美耳球蟲揚州株，由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室經(jīng)單卵囊分離建株，定期經(jīng)無球蟲污染的雞傳代保種。BALB/c小鼠購自揚州大學(xué)實驗動物中心，自由采食和飲水。黃羽雞購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所育種中心。雛雞出殼后即運回經(jīng)嚴格消毒、無球蟲的實驗室中飼養(yǎng)，自由采食和飲水。

試驗過程中參照揚州大學(xué)實驗動物福利倫理審查表[編號：202103210(雞)和202103058(小鼠)]對雞和小鼠實施安樂死，動物尸體高壓滅菌消毒后密封交揚州大學(xué)動物尸體處理中心集中處理。

1.2 主要儀器和試劑

pGEM-T easy克隆載體購自Promega公司；克隆菌DH5α和表達菌BL21(DE3)、表達載體pET-28a(+)均由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室保存。TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，TaKaRa RNA LA PCRKit(AMV)Ver.1.1，Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR，T4 DNA Ligase，d Ⅲ、R Ⅰ、Ⅰ等限制性內(nèi)切酶等均購自TaKaRa公司；Ni-NTA親和層析介質(zhì)購自金斯瑞生物科技公司；QuickAntibody-Mouse3 W小鼠快速免疫佐劑購自Biodragon公司；NanoDrop2000/2000c型超微量核酸蛋白測定儀購自Thermo公司；LEICA RM2235石蠟切片機、DM2500型正置熒光顯微鏡、超高分辨率激光共聚焦顯微鏡(TCS SP8 STED)均購自Leica公司。

1.3 毒害艾美耳球蟲配子體分離純化及總RNA提取

20日齡無球蟲感染黃羽肉雞，每只經(jīng)嗉囊接種0.7×10個毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊，153 h后從雞盲腸黏膜組織中分離純化配子體，參照賈傳禮等的方法，采用Percoll密度梯度離心法分離純化配子體，保存于液氮備用。

將純化的毒害艾美耳球蟲配子體，參照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說明書提取總RNA。

1.4 引物設(shè)計及EnOXIO1基因的PCR擴增

根據(jù)蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)分析獲得的毒害艾美耳球蟲(Houghton株)氧化還原酶(EnOXIO1)基因序列(XM_013578370)，使用Primer 5.0和Oligo 7軟件設(shè)計特異性引物擴增基因的全長序列，上游引物：5′-ATGCCAGTGCTTCCTCCATTC-3′；下游引物：5′-TTATTGCTCCCCTAGCATCATCTC-3′，預(yù)計擴增目的片段大小為2 535 bp。引物由華大基因科技股份有限公司合成。

以配子體RNA為模板，按照TaKaRa RNA LA PCRKit(AMV)試劑盒說明書，RT-PCR法擴增En1，第一步反轉(zhuǎn)錄，10 μL體系：MgCl2 μL，10×RNA PCR Buffer 1 μL，RNase Free ddHO 4.25 μL，dNTP Mixture 1 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，Reverse Transcriptase 0.5 μL，Oligo dt-Adaptor Primer 0.5 μL，RNA 0.5 μL；反應(yīng)條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。第二步PCR，按照TaKaRa PrimeSTARMax DNA Polymerase說明書，50 μL PCR反應(yīng)體系：PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL，上下游引物(10 mmol·L)各2 μL，ddHO 19 μL，配子體DNA 2 μL；PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，51 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 EnOXIO1基因的克隆與序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit試劑盒純化回收，參照Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR說明書對純化的PCR產(chǎn)物3′端添加“A”堿基，克隆到pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化至DH5α，過夜培養(yǎng)，經(jīng)藍白斑篩選，隨機挑選白斑，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，選取經(jīng)R Ⅰ雙酶切鑒定為陽性的克隆，送華大基因科技股份有限公司測序。

將獲得的En1基因序列用在線分析軟件SignalP-5.0預(yù)測信號肽，EditSeq7.1.0和MegAlign7.1.0進行序列分析，并與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的毒害艾美耳球蟲(Houghton株)(En1)、柔嫩艾美耳球蟲(Et1)、巨型艾美耳球蟲(Em1)和堆型艾美耳球蟲(Ea1)基因進行核苷酸序列比對。

1.6 EnOXIO1基因的表達

1.6.1 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計特異性引物，上游引物添加保護性堿基和RⅠ酶切位點：5′-TCGATGCCAGTGCTTCCTCCATTC-3′，下游引物添加保護性堿基和Ⅰ酶切位點：5′-TATTTATTGCTCCCCTAGCATCA-TCTC-3′。以測序正確的陽性克隆質(zhì)粒為模板，PCR擴增(方法同“1.4”第二步PCR)添加了酶切位點的En1基因。RⅠ和Ⅰ雙酶切PCR產(chǎn)物和原核表達載體pET-28a(+)，取5 μL雙酶切PCR產(chǎn)物(約500 ng)，3 μL載體雙酶切產(chǎn)物(約150 ng)，1 μL 10×Buffer，1 μL T4 DNA Ligase，16 ℃連接過夜，構(gòu)建原核表達載體pET-28a(+)-En1，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，將經(jīng)過RⅠ和Ⅰ雙酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送由華大基因科技股份有限公司測序。

1.6.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達與可溶性分析 將鑒定正確的重組菌BL21(DE3)pET-28a(+)-En1按1%的比例接種于含有卡那霉素(50 μg·mL)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r·min振蕩培養(yǎng)至菌液濃度OD值為0.6～0.8，加入0.2 mmol·LIPTG，16 ℃ 160 r·min過夜誘導(dǎo)表達；取誘導(dǎo)后重組菌3 mL，PBS洗滌，12 000 r·min離心10 min，沉淀懸浮于500 μL PBS中，冰浴超聲(功率為30%，超聲2 s，間隙3 s)裂解3 min，12 000 r·min離心20 min，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。同時，設(shè)置pET-28a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達菌和未轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)表達菌作為對照。

1.6.3 重組蛋白的HIS標簽單抗鑒定 將誘導(dǎo)表達的陽性重組菌蛋白、pET-28a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌蛋白進行12% SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到NC膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后參照劉丹丹等方法進行Western blot檢測。其中，一抗為6×HIS標簽單抗(用封閉液按1∶20 000倍稀釋)，二抗為HRP標記的兔抗小鼠IgG(用封閉液按1∶10 000倍稀釋)。ECL化學(xué)發(fā)光顯色，天能5200成像系統(tǒng)觀察顯色結(jié)果并拍照保存。

1.6.4 重組蛋白的純化與復(fù)性 取誘導(dǎo)后的重組菌100 mL，離心收集沉淀，經(jīng)PBS三次洗滌后重懸于15 mL PBS中，冰浴超聲(功率為30%，超聲2 s，間隙3 s)15 min釋放包涵體；4 ℃ 12 000 r·min離心20 min，棄上清，將沉淀重懸于8 mL LE Buffer(50 mmol·LNaHPO，0.3 mol·LNaCl，8 mol·LUrea，pH9.0)，冰浴超聲(功率為30%，超聲2 s，間隙3 s)2 min加速包涵體溶解；4 ℃ 12 000 r·min離心20 min，將上清移入Ni-NTA親和純化層析柱中，4 ℃結(jié)合1 h；期間不斷搖晃，使目的蛋白與層析柱充分結(jié)合。先用Washing Buffer(50 mmol·LNaHPO，10 mmol·LTris·Cl，10 mmol·LImidazole，8 mol·LUrea，pH9.0)洗滌緩沖液洗滌層析柱，再用Elution Buffer(50 mmol·LNaHPO，10 mmol·LTris·Cl，250 mmol·LImidazole，8 mol·LUrea，pH9.0)洗滌緩沖液洗滌層析柱，收集Elution Buffer的洗脫液，分別在含有6、4、2、1 mol·L尿素透析液和0.1 mol·LPBS中，4 ℃復(fù)性6～8 h，收集目的蛋白，并進行SDS-PAGE，檢測蛋白純化效果。

1.7 抗rEnOXIO1鼠多克隆抗體的制備

6周齡BALB/c小鼠，取新鮮制備的純化復(fù)性后的50 μg重組蛋白與QuickAntibody-Mouse3 W小鼠快速免疫佐劑按照體積比1∶1，迅速混和均勻，腿部肌肉注射(100 μL·只)。兩周后，加強免疫一次，第9周，小鼠眼球摘除采血，分離血清，即為抗rEnOXIO1鼠血清。采用間接ELISA法檢測抗體效價，分裝保存于-20 ℃?zhèn)溆?。同時，參照劉丹丹方法，將提取的毒害艾美耳球蟲配子體總蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，以制備的鼠多抗為一抗，Western blot鑒定此多抗的特異性。

1.8 重組蛋白的反應(yīng)原性和交叉反應(yīng)原性鑒定

參照“1.6.3”的方法，分別以毒害艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清(由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室制備保存)為一抗，以HRP標記的綿羊抗雞IgG為二抗，對重組蛋白的反應(yīng)原性和交叉反應(yīng)原性進行Western blot檢測。同時，設(shè)置pET-28a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌體蛋白作為對照。

1.9 EnOXIO1基因表達產(chǎn)物的免疫熒光定位

分別采集感染毒害艾美耳球蟲后不同時間段的腸道組織，其中包括感染后136 h的小腸中段、156 h盲腸前段、168和180 h的盲腸中段，制成石蠟切片，經(jīng)蘇木素-伊紅染色后，觀察不同階段蟲體的生長發(fā)育情況。根據(jù)觀察結(jié)果，選取不同時間段的小腸或盲腸組織進行激光共聚焦免疫熒光定位，具體步驟參照曹李琴方法，其中，一抗為制備的鼠抗rEnOXIO1多抗，二抗為FITC標記的羊抗鼠二抗，最后滴加一滴抗熒光淬滅液(含DAPI)封片，超高分辨率激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴增

PCR擴增得到的片段大小為2 535 bp左右(圖1)，與預(yù)期目的片段大小相一致。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.EnOXIO1基因擴增產(chǎn)物

2.2 序列分析

將所得序列與GenBank中收錄的毒害艾美耳球蟲(Houghton株)oxidoreductase基因(XM_013578370.1)、柔嫩艾美耳球蟲oxidoreductase(XM_013377853.1)、巨型艾美耳球蟲oxidoreductase(XM_013481852.1)、堆型艾美耳球蟲oxidoreductase(XM_013396120.1)進行核苷酸序列比對，相似性分別為99.61%、96.65%、74.78%、74.98%。氨基酸序列分析顯示，En1基因共編碼844個氨基酸，預(yù)測分子質(zhì)量約為93.51 ku，等電點(PI)為5.917?？乖瓫Q定簇在線分析和SignalP-5.0顯示，此蛋白共含有34個抗原決定簇，無信號肽。通過對其進行功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，在氨基端和羧基端各有1個GMC(Glucose-Methanol-Choline)結(jié)構(gòu)域，其中，氨基端大小為47個(第158～204位)氨基酸，羧基端大小為70個(第765～834位)氨基酸；在氨基酸內(nèi)部有1個FAD/NAD結(jié)合域，預(yù)測此類結(jié)構(gòu)域與氧化還原反應(yīng)中氨基酸間二硫鍵的形成密切相關(guān)。

2.3 原核表達載體的構(gòu)建

將目的基因連接至原核表達載體pET-28a(+)，經(jīng)RⅠ和Ⅰ雙酶切(圖2)和測序分析，目的基因序列2 535 bp成功連接至原核表達載體，并命名為pET-28a(+)-En1。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.EcoR Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切產(chǎn)物

2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達、可溶性分析與HIS標簽單抗鑒定

將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-En1轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌，誘導(dǎo)表達后進行SDS-PAGE分析與純化。結(jié)果顯示，重組蛋白大小約為100 ku，主要以包涵體的形式存在(圖3A)，最佳表達條件為IPTG 0.20 mmol·L，16 ℃誘導(dǎo)12 h。蛋白的表達量約為0.5 mg·mL。Western blot分析顯示，重組蛋白能被抗6×HIS標簽單克隆抗體特異性識別(圖3B)，在100 ku左右出現(xiàn)目的條帶，而pET-28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌蛋白對照組未見條帶，證實En1基因成功體外表達。

A.SDS-PAGE；B.Western blot；M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.BL21 IPTG誘導(dǎo)；2.pET-28a(+)/BL21 IPTG誘導(dǎo)；3.pET-28a(+)-EnOXIO1/BL21 未誘導(dǎo)；4.pET-28a(+)-EnOXIO1/BL21 IPTG誘導(dǎo)；5.重組菌誘導(dǎo)后的超聲裂解液沉淀；6.重組菌誘導(dǎo)后的超聲裂解液上清；7.Ni-NTA親和純化后的目的蛋白

2.5 抗rEnOXIO1鼠多克隆抗體間接ELISA檢測

采用間接ELISA方法，將免疫小鼠制備的多克隆抗體倍比稀釋，OD檢測抗體效價為1∶102 400(圖4)。

圖4 間接ELISA法檢測多克隆抗體效價

2.6 抗rEnOXIO1鼠多克隆抗體特異性鑒定

Western blot分析顯示，鼠抗rEnOXIO1多克隆抗體能夠識別天然配子體蛋白(圖5)，且識別條帶大小與預(yù)期相符，約100 ku。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.天然配子體蛋白

2.7 重組蛋白反應(yīng)原性和交叉反應(yīng)原性鑒定

Western blot分析顯示，重組蛋白均與毒害艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲病康雞復(fù)血清發(fā)生反應(yīng)，同時能被小鼠抗重組蛋白多克隆抗體識別，而pET-28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌蛋白未與抗體發(fā)生反應(yīng)(圖6)。

a.毒害艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清；b.堆型艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清;c.柔嫩艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清；d.小鼠抗重組蛋白多克隆抗體；M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.pET-28a(+)-EnOXIO1/BL21 IPTG誘導(dǎo)；2.pET-28a(+)/BL21 IPTG誘導(dǎo)

2.8 EnOXIO1基因編碼蛋白的免疫熒光定位

根據(jù)石蠟切片的蘇木素-伊紅染色結(jié)果，選取感染后168和180 h盲腸中段組織切片進行激光共聚焦免疫熒光定位試驗，結(jié)果顯示，EnOXIO1蛋白主要分布在配子體內(nèi)的成壁體上(圖7A～E)，且隨著蟲體的發(fā)育整合到了卵囊壁上(圖7F～J)。

A～E.感染后168 h盲腸組織中配子體定位結(jié)果；F～J.感染后180 h盲腸組織中早期卵囊的定位結(jié)果；A、F.HE染色；B、G.明場；C、H.DAPI染色；D、I.多克隆抗體熒光定位(FITC標記二抗)；E、J.DAPI和FITC疊加。MAG.大配子體；O.早期卵囊。切片厚度為6 μm；比例尺為10 μm

3 討 論

課題組前期對毒害艾美耳球蟲成壁體和卵囊壁蛋白的差異蛋白組學(xué)分析顯示，EnOXIO1在成壁體和卵囊壁中的表達量存在明顯差異，其中在成壁體內(nèi)高表達，在卵囊壁上低表達。為了進一步明確EnOXIO1的功能，本研究通過克隆與測序，成功獲取毒害艾美耳球蟲揚州株En1序列，SDS-PAGE分析顯示體外重組表達蛋白大小約為100 ku，理論分子質(zhì)量大小約為93.51 ku，可能由于空間構(gòu)象等原因?qū)е码娪緱l帶的大小高于理論值，這與之前其他球蟲的配子體蛋白的研究結(jié)果相似。氨基酸序列分析顯示，En1基因共編碼844個氨基酸，共含有34個抗原決定簇，能被鼠抗6×HIS標簽單抗特異性識別，同時能被鼠抗rEnOXIO1多抗、毒害艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清所識別，表明EnOXIO1能夠成功體外誘導(dǎo)表達，且具有較好的反應(yīng)原性和交叉反應(yīng)原性。激光共聚焦免疫熒光定位結(jié)果證實，EnOXIO1蛋白同時存在于配子體內(nèi)的成壁體和卵囊壁上。

酪氨酸交聯(lián)、二硫鍵的形成等氧化還原反應(yīng)在球蟲卵囊壁形成過程中發(fā)揮重要作用。通過對毒害艾美耳球蟲EnOXIO1蛋白編碼氨基酸進行功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，在其氨基酸兩端各有1個GMC(Glucose-Methanol-Choline)結(jié)構(gòu)域，其中，氨基端大小為47個(第158～204位)氨基酸，羧基端大小為70個(第765～834位)氨基酸，且高度保守；在氨基酸內(nèi)部有1個FAD/NAD結(jié)合域，該區(qū)域涵蓋了氨基和羧基端2個GMC結(jié)構(gòu)域。而本文獲得的En1基因編碼一種氧化還原酶蛋白，預(yù)測GMC結(jié)構(gòu)域作為與FAD結(jié)構(gòu)域結(jié)合的輔助因子，與氧化還原反應(yīng)中HO的產(chǎn)生密切相關(guān)，而FAD/NAD結(jié)合域可以激活FAD/NAD(P)H作為供氫體的氧化還原反應(yīng)，同時也可以激活二硫化物還原酶的活性。此研究結(jié)果提示，EnOXIO1蛋白可能通過某種氧化還原機制參與了二硫鍵的形成，進而參與了卵囊壁的形成。

卵囊壁是由配子體內(nèi)的前體蛋白經(jīng)過一系列蛋白酶的水解加工形成。作者通過免疫熒光定位試驗證實EnOXIO1蛋白同時存在于配子體和卵囊壁上，進一步說明EnOXIO1蛋白確實通過某些機制參與了卵囊壁的形成，但具體機制有待進一步研究。EnOXIO1蛋白在配子體和卵囊壁上的表達量是否有差異，還需通過熒光定量PCR進一步分析。

綜上可知，EnOXIO1蛋白作為一種主要存在于配子體內(nèi)的氧化還原酶，其可能在氨基酸交聯(lián)和二硫鍵形成中發(fā)揮關(guān)鍵性作用后參與了卵囊壁的形成，但體外重組表達的EnOXIO1蛋白對球蟲卵囊壁形成的阻斷作用和對雞群的免疫保護效果有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究克隆和表達了毒害艾美耳球蟲EnOXIO1蛋白，并將其定位于配子體和卵囊壁上，為進一步解析其參與卵囊壁形成的分子機制奠定了基礎(chǔ)，為研制新型免疫阻斷型球蟲亞單位疫苗提供重要靶抗原。