聞雙全，王 莉，張文華，徐明暢，鄒 輝，顧建紅，劉學(xué)忠，卞建春，劉宗平，袁 燕*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

鎘是一種有毒重金屬，由于工業(yè)活動(dòng)的增加和日常生活中含鎘產(chǎn)品的廣泛使用，鎘對(duì)公共健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。長(zhǎng)期鎘暴露會(huì)造成機(jī)體多系統(tǒng)和多器官損傷，其中腦是鎘毒性作用的重要靶器官之一[1-2]。大量研究表明，鎘可通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)神經(jīng)毒性，包括氧化應(yīng)激、凋亡和自噬等[3-4]。其中，細(xì)胞自噬在鎘致神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷過(guò)程中扮演重要角色。自噬是細(xì)胞通過(guò)自噬溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)容物的過(guò)程。體內(nèi)外研究表明，鎘可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬發(fā)生[4-5]。

Fas是腫瘤壞死因子受體家族的重要一員，通過(guò)與其配體結(jié)合在鎘致神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用[6]。但是，F(xiàn)as在鎘致神經(jīng)細(xì)胞自噬中的作用和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)利用RNA干擾技術(shù)建立Fas基因沉默大鼠模型，并用鎘進(jìn)行處理，通過(guò)透射電鏡、Western blot等方法從體內(nèi)探究Fas在鎘暴露致大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞自噬中的作用及潛在分子機(jī)制，為揭示鎘的神經(jīng)毒性機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

21日齡清潔級(jí)健康雄性封閉群SD大鼠24只，體重(70±5)g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑

醋酸鎘、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)兔單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司；跨血腦屏障的Fas基因沉默腺相關(guān)病毒(FasshRNA，靶序列：5′-GATC-CGGTGCGTGTCAAGCTTTAATCTTCAAGAG-AGATTAAAGCTTGACACGCACCTTTTTTA-3′)和插入非特異性序列的對(duì)照病毒(NC shRNA)購(gòu)自漢恒生物科技有限公司；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Erk1/2)、p-Erk1/2、自噬相關(guān)蛋白7(ATG7)、自噬相關(guān)基因(Beclin-1)、β-actin兔單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自CST公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

脫水機(jī)購(gòu)自DIAPATH公司；包埋機(jī)購(gòu)自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)、激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自Leica公司；透射電鏡購(gòu)自Philips公司；5810R型低溫高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司；高速組織研磨器購(gòu)自天根生化科技有限公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自BIORAD公司。

1.4 動(dòng)物分組與處理

將24只21日齡的健康雄性SD大鼠于清潔、干燥、室溫(23±2)℃的環(huán)境下預(yù)飼1周后隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為對(duì)照組(Control組)、鎘組(Cd組)、鎘與對(duì)照病毒共處理組(Cd+NC shRNA組)、鎘與Fas基因沉默病毒共處理組(Cd+Fas shRNA組)。試驗(yàn)期間，對(duì)照組大鼠自由飲用純凈水，病毒處理組大鼠于第1天以每只1.4×1011vg的劑量通過(guò)尾靜脈注射相應(yīng)病毒，4周后鎘染毒組大鼠自由飲用鎘水(50 mg·L-1)，持續(xù)90 d。試驗(yàn)結(jié)束后，用2%戊巴比妥鈉按3 mL·kg-1劑量肌肉注射麻醉大鼠，剝離腦組織，一部分固定于4%多聚甲醛或2.5%戊二醛中，一部分分離大腦皮質(zhì)于凍存管內(nèi)，于-80 ℃保存待用。

1.5 透射電鏡觀察自噬體

取1 mm3大腦皮質(zhì)組織塊于2.5%戊二醛中4 ℃固定過(guò)夜，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次15 min；1%鋨酸避光室溫固定2 h，PBS漂洗3次，每次15 min；經(jīng)30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水，再用100%丙酮于室溫下浸透12 min；用樹(shù)脂包埋組織塊，于60 ℃烘箱內(nèi)放置48 h；切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察大腦皮質(zhì)自噬體數(shù)量。

1.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

取各組大鼠大腦皮質(zhì)50 mg于預(yù)冷的PBS中剪碎，在4 ℃條件下2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液，勻漿后置于冰上裂解30 min，每隔5 min震蕩1次，細(xì)胞超聲破碎儀超聲20 s，在4 ℃條件下12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，即為組織總蛋白。采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度并將各組濃度調(diào)成一致，按照1∶4加入5 × SDS Loading Buffer，混勻后沸水煮10 min，蛋白保存于-80 ℃。

取等量樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂乳室溫封閉2 h，4 ℃孵育相應(yīng)一抗(Erk1/2、p-Erk1/2、ATG7、Beclin-1、LC3、β-actin 抗體按1∶1 000稀釋)過(guò)夜，室溫孵育二抗(1∶3 000)1 h，ECL顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。使用Image J軟件分析條帶灰度值，目的蛋白與β-actin灰度值的比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 免疫熒光染色檢測(cè)LC3表達(dá)

大腦皮質(zhì)石蠟切片脫蠟至水后進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗滌3次；將切片放入3%牛血清白蛋白中，室溫封閉30 min，棄去封閉液；4 ℃孵育LC3抗體(1∶100)過(guò)夜，PBS洗滌3次；避光室溫孵育Cy3標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗(1∶200)1 h，PBS洗滌3次；滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min，PBS洗滌3次；滴加抗熒光淬滅劑，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，再經(jīng)LSD法進(jìn)行多重比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 Fas基因沉默對(duì)鎘致大鼠大腦皮質(zhì)自噬體形成的影響

透射電鏡觀察大鼠大腦皮質(zhì)中自噬體數(shù)量，結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組相比，Cd組和Cd+NC shRNA 組大腦皮質(zhì)中自噬體明顯增多；與Cd組相比，Cd+Fas shRNA組自噬體減少。

2.2 Fas基因沉默對(duì)鎘致大鼠大腦皮質(zhì)Erk1/2磷酸化的影響

Western blot檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)中Erk1/2和p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，Cd組和Cd+NC shRNA組大腦皮質(zhì)Erk1/2磷酸化水平極顯著升高(P<0.01)；與Cd組相比，Cd+Fas shRNA組Erk1/2磷酸化水平極顯著降低(P<0.01)。

2.3 Fas基因沉默對(duì)鎘致大鼠大腦皮質(zhì)Beclin-1和ATG7蛋白表達(dá)變化的影響

Western blot檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)中Beclin-1和ATG7蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，Cd組和Cd+NC shRNA組大腦皮質(zhì)Beclin-1和ATG7表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)；與Cd組相比，Cd+Fas shRNA組Beclin-1和ATG7表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)。

圖3 Fas基因沉默對(duì)鎘致大鼠大腦皮質(zhì)ATG7和Beclin-1蛋白表達(dá)變化的影響

2.4 Fas基因沉默對(duì)鎘致大鼠大腦皮質(zhì)LC3蛋白表達(dá)變化的影響

免疫熒光染色法檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)中LC3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，Cd組和Cd+NC shRNA組大腦皮質(zhì)LC3表達(dá)水平增加；與Cd組相比，Cd+Fas shRNA組LC3表達(dá)減少。Western blot檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)中LC3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，Cd組和Cd+NC shRNA組大腦皮質(zhì)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值極顯著升高(P<0.01)；與Cd組相比，Cd+Fas shRNA組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值極顯著降低(P<0.01)。

圖4 大鼠大腦皮質(zhì)中LC3表達(dá)量變化

圖5 Fas基因沉默對(duì)鎘致大鼠大腦皮質(zhì)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值變化的影響

3 討 論

死亡受體是一類細(xì)胞表面受體，屬于腫瘤壞死因子受體超家族，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Fas是腫瘤壞死因子受體超家族的重要一員，通過(guò)與其配體相互作用調(diào)控多種細(xì)胞凋亡過(guò)程[7-8]。本實(shí)驗(yàn)室前期體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，鎘可通過(guò)激活死亡受體Fas誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[6,9]。隨著研究的不斷深入，科研人員發(fā)現(xiàn)，除細(xì)胞凋亡外，F(xiàn)as還參與了細(xì)胞自噬過(guò)程。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as通過(guò)上調(diào)自噬相關(guān)蛋白ATG5-ATG12蛋白復(fù)合物、ATG7、ATG10、Beclin-1和LC3的表達(dá)水平誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞自噬發(fā)生。De Giorgio等[11]研究發(fā)現(xiàn)，抗神經(jīng)元抗體通過(guò)Fas依賴途徑激活人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬。本研究結(jié)果顯示，鎘引起大鼠大腦皮質(zhì)自噬體數(shù)量增多，F(xiàn)as基因沉默抑制鎘引起的自噬體增加。說(shuō)明Fas參與鎘致大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞自噬。

自噬是細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解受損的細(xì)胞器、蛋白聚集物及入侵的微生物的過(guò)程，主要包括自噬體的形成和成熟、自噬體對(duì)底物的識(shí)別、自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體等過(guò)程[12]。細(xì)胞自噬的發(fā)生與多種自噬基因密切相關(guān)，包括Beclin-1、ATG7和LC3等。Beclin-1是首個(gè)被確認(rèn)的參與自噬過(guò)程的哺乳動(dòng)物基因，當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí)，Beclin-1及其復(fù)合物啟動(dòng)自噬體形成[13]。LC3是自噬體標(biāo)志蛋白，在自噬體形成過(guò)程中，LC3被半胱氨酸蛋白酶ATG4剪切形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ在ATG7和ATG3的催化下與磷脂酰乙醇胺發(fā)生作用形成膜結(jié)合形式的LC3-Ⅱ，并定位于自噬體膜上[14-15]。因此，Beclin-1、ATG7和LC3-Ⅱ的表達(dá)水平與自噬呈正相關(guān)。自噬體的形成受多條信號(hào)通路調(diào)控，其中絲裂原活化蛋白激酶家族成員Erk1/2是其上游的重要信號(hào)分子[16-18]。付程凱等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Erk1/2通過(guò)上調(diào)Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)水平促進(jìn)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，利用Erk1/2抑制劑可顯著抑制鎘引起的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞LC3-Ⅱ的表達(dá)水平升高[20]。另外，大量研究表明，Erk1/2的激活受死亡受體Fas調(diào)控[21-22]。本研究結(jié)果顯示，鎘暴露導(dǎo)致大鼠大腦皮質(zhì)Erk1/2磷酸化水平、Beclin-1和ATG7表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值極顯著升高，F(xiàn)as基因沉默極顯著抑制鎘激活的Erk1/2及鎘引起的Beclin-1、ATG7表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高。說(shuō)明Fas通過(guò)激活Erk1/2參與鎘致大鼠大腦皮質(zhì)自噬體形成。

4 結(jié) 論

鎘通過(guò)激活Erk1/2誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)自噬體形成，F(xiàn)as基因沉默能夠抑制鎘激活的Erk1/2及鎘誘導(dǎo)的自噬體形成，說(shuō)明鎘激活的Fas通過(guò)調(diào)控Erk1/2參與大鼠大腦皮質(zhì)自噬體形成；這為揭示鎘的神經(jīng)毒性機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)。