楊惠婷，劉 棟，趙一竹，楊瑞雪，葛世玫

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035)

群體感應(yīng)（Quorum Sensing，QS）現(xiàn)象普遍存在于微生物群落中，指微生物在生長過程中根據(jù)群體密度變化而調(diào)控基因表達(dá)的一種生理行為[1-3].研究發(fā)現(xiàn)[4]，微生物QS 是通過自誘導(dǎo)因子（Autoinducer，AI）的濃度調(diào)控基因表達(dá).目前發(fā)現(xiàn)的自誘導(dǎo)因子包含N-?；呓z氨酸內(nèi)脂（Acyl Homoserine Lactone，AHL）[5]、自誘導(dǎo)因子2（Autoinducer-2，AI-2）[6]、擴(kuò)散信號(hào)因子（Diffusible Signaling Factor，DSF）[7]等.其中，AHL 信號(hào)分子主要由高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和?；鶄?cè)鏈組成，側(cè)鏈依據(jù)不同長度可分為C4-C18 等多種類型.細(xì)菌通過群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控多種生理行為，如生物膜的形成與成熟[8]、生物發(fā)光現(xiàn)象[9]、毒力因子產(chǎn)生[10]等.群體感應(yīng)給環(huán)境、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)領(lǐng)域發(fā)展帶來機(jī)遇的同時(shí)也帶來困難和挑戰(zhàn)，因此干擾細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)是目前研究的熱點(diǎn)之一.群體淬滅（Quorum Quenching，QQ）是指在不影響細(xì)菌生長的情況下，阻斷或干擾群體感應(yīng)，抑制或者破壞細(xì)菌QS 系統(tǒng)，從而阻斷細(xì)菌信息交流的一種有力手段[11]，常被應(yīng)用于疾病控制和減緩生物膜污染等[12-13]方面.盡管已在Rhodococcussp.[13]、Bacillussp.[14-15]、Serratiasp.[16]等多種屬細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)QQ 現(xiàn)象，但對(duì)其作用機(jī)理仍知之甚少.

我們課題組前期已篩選出一株具有高效群體淬滅能力的沙雷氏Z4 菌（Serratiasp.Z4），本研究采用Tn5 轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)，構(gòu)建沙雷氏Z4 菌突變體庫.通過研究不同供受體混合比例、不同培養(yǎng)時(shí)間、不同抗生素選擇壓力以及不同菌株生長狀態(tài)對(duì)突變的影響，進(jìn)一步優(yōu)化Tn5 轉(zhuǎn)座突變條件.在此基礎(chǔ)上，研究優(yōu)化條件后獲得的突變株對(duì)兩種AHL 信號(hào)分子——N-己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（C6-HSL）和N-辛?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（C8-HSL）的降解能力，篩選具有QQ 能力差異的沙雷氏Z4 突變株，為未來Z4 菌更好地應(yīng)用提供分子技術(shù)及基礎(chǔ)理論.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株與質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)使用的菌株及質(zhì)粒見表1.其中，沙雷氏Z4 菌株是本實(shí)驗(yàn)室從溫州市經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)濱海工業(yè)區(qū)第一污水處理廠采集的污泥中分離獲得；大腸桿菌S17-1 作為雙親本接合實(shí)驗(yàn)的供體菌；質(zhì)粒pRL1063a 是經(jīng)過改造的具有Tn5 轉(zhuǎn)座子的自殺載體；紫色色桿菌CV026 和根癌農(nóng)桿菌KYC55 購自于北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司，作為群體感應(yīng)生物傳感器.

表1 菌株及質(zhì)粒

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（g/L）.胰蛋白胨10、酵母浸出粉5、氯化鈉10.調(diào)pH 7.4-7.5 之間，121℃高壓滅菌30 min.固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂粉.

AT 培養(yǎng)基（g/L）[17].配置20X AT salt（g/L）：硫酸銨40、硫酸鎂1.56、七水硫酸鐵0.1、一水硫酸錳0.044；配置20X AT buffe（g/L）：磷酸二氫鉀214，調(diào)pH 7.3；配置50%葡萄糖；各組分單獨(dú)滅菌或過濾除菌.AT 培養(yǎng)基：20X AT salt 50 mL、20 X AT buffe 50 mL、50%葡萄糖10 mL、無菌水896 mL、1.5%瓊脂粉.用于檢測群體淬滅能力時(shí)，需加入相應(yīng)的抗生素以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）.

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

試劑母液的配置見表2.

表2 試劑貯液的配置

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株活化

將所需的菌株分別在相應(yīng)的培養(yǎng)基以及溫度下活化，見表3.

表3 菌株培養(yǎng)條件

2.2 雙親本接合

借鑒張茜等[18]所采用的雙親本接合法，挑取供體菌大腸桿菌S17-1（pRL1063a）和受體菌沙雷氏Z4 菌單菌落，分別接于含有100 μg/mL Km 和25 μg/mL Tc 的LB 液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)16 h；至對(duì)數(shù)生長期（OD600為1.500 左右）分別收集供體菌及受體菌以1∶1 比例混合，12 000 rpm離心2 min，棄上清；加入1 mL LB 液體培養(yǎng)基重懸浮后，30℃振蕩培養(yǎng)3 h，使兩者充分接合；取50 μL 菌液涂布于含有50 μg/mL Km 和25 μg/mL Tc 的LB 固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h.

2.3 Tn5 轉(zhuǎn)座突變株的PCR 驗(yàn)證

挑取雙抗篩選固體培養(yǎng)基上的單菌落于新的LB 液體培養(yǎng)基上（含相應(yīng)抗生素），根據(jù)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[19]，提取突變株基因組DNA；根據(jù)pRL1063a 中的luxAB 序列設(shè)計(jì)合成特異性擴(kuò)增引物（luxAB P1:5’-TTTGTTCGGCTTGGTATCGC-3’和luxAB P2:5’-ATTGCTTAGGTCCTTCT CA-3’），以突變株基因組DNA 為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）驗(yàn)證.PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序見表4.

表4 PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

2.4 轉(zhuǎn)座突變條件優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn)，在其他條件不變的情況下，分別改變Tn5 轉(zhuǎn)座子插入突變中的供體菌和受體菌的混合比例（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）、供受體菌混合培養(yǎng)時(shí)間（1 h、3 h、5 h）、抗生素選擇壓力（Km 含量分別為100 μg/mL、75 μg/mL、50 μg/mL 和25 μg/mL、Tc=25 μg/mL）以及沙雷氏Z4 菌的生長狀態(tài)（OD600分別為0.200、1.500 和4.000），統(tǒng)計(jì)長出的突變株數(shù)量，獲得最佳的轉(zhuǎn)座突變條件.

2.5 群體淬滅差異突變株篩選

在優(yōu)化的突變條件下進(jìn)行沙雷氏Z4 菌株Tn5 轉(zhuǎn)座突變，建立沙雷氏Z4 菌株突變體庫.具體步驟如下：將2.3 中PCR 驗(yàn)證為陽性的突變株接于同時(shí)含有50 μg/mL Km 和25 μg/mL Tc 的LB液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)12-16 h；用無菌LB 液體培養(yǎng)基稀釋Z4 突變株OD600至2.600-2.700 之間；取10 mL 菌液，加入信號(hào)分子C6-HSL 或C8-HSL 至終濃度為10 μmol/L，30℃振蕩培養(yǎng)4 h；取培養(yǎng)液過濾除菌，作為待測液，-20℃保存?zhèn)溆?

紫色色桿菌CV026 報(bào)告菌為紫色色桿菌ATCC31532 的mini-Tn5 的突變體[20]，自身不能合成AHLs 信號(hào)分子，當(dāng)出現(xiàn)外源AHLs 信號(hào)分子時(shí)，會(huì)產(chǎn)生紫色色素[20].本實(shí)驗(yàn)借鑒李晴等[21]群體淬滅活性檢測方法，將CV026 接種于含50 μg/mL Km 的LB 液體中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600為1.000 左右；加熱融化100 mL 的LB 固體培養(yǎng)基，靜置冷卻至40℃-50℃，加入終濃度為50 μg/mL Km 和10 mL OD600為1.000 左右的CV026 菌液，倒固體培養(yǎng)基冷卻凝固，打孔，加入待測液，30℃正置培養(yǎng)24 h，觀察紫色圈大小，以C6-HSL 顯色圈作為陽性對(duì)照.若具有QQ 能力，則待測液中的C6-HSL 會(huì)被降解而使得顯色圈小于陽性對(duì)照；若無QQ 能力，則顯色圈會(huì)同陽性對(duì)照的直徑大小一致.

根癌農(nóng)桿菌KYC55 報(bào)告菌在含有外源AHLs 信號(hào)分子和X-gal 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的β-半乳糖苷酶與X-gal 反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色.本實(shí)驗(yàn)借鑒盛吉洋[22]的檢測方法，將KYC55 接種于含相應(yīng)抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)24 h；加熱融化AT 固體培養(yǎng)基，靜置冷卻至40℃-50℃，加入相應(yīng)抗生素、終濃度為100 μg/mL 的X-gal 和10 mL KYC55 菌液，打孔，加入待測液，30℃正置培養(yǎng)24 h，觀察藍(lán)色圈大小，以C8-HSL 顯色圈作為陽性對(duì)照.若具有QQ 能力，則待測液中的C8-HSL 會(huì)被降解而使得顯色圈小于陽性對(duì)照；若無QQ 能力，則顯色圈會(huì)同陽性對(duì)照的直徑大小一致.

用信號(hào)分子C6-HSL 和C8-HSL 作為陽性對(duì)照，Z4 野生型菌株降解信號(hào)分子作為陽性對(duì)照，水作為陰性對(duì)照.若觀察到突變株降解信號(hào)分子的顯色圈比Z4 野生型顯色圈的直徑大，則Tn5插入了編碼群體淬滅酶基因中，從而獲得群體淬滅缺失突變菌株.

3 結(jié)果與分析

3.1 沙雷氏Z4 菌株Tn5 轉(zhuǎn)座突變株的PCR 鑒定

對(duì)沙雷氏Z4 菌株進(jìn)行Tn5 轉(zhuǎn)座突變，通過Km 和Tc 雙抗篩選，構(gòu)建了庫容量較多的沙雷氏Z4 菌株突變體庫.以隨機(jī)挑選5 株Z4 突變株基因組DNA、Z4 野生型基因組DNA 以及pRL1063a 質(zhì)粒DNA 為模板進(jìn)行PCR 驗(yàn)證（圖1），結(jié)果都得到了大小約為1.6 kb 的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符.說明Tn5 轉(zhuǎn)座子已成功插入了沙雷氏Z4 菌株中，且獲得了同時(shí)具有Km 以及Tc 抗性的沙雷氏Z4 菌株Tn5 轉(zhuǎn)座突變體.

圖1 沙雷氏Z4 突變株中Tn5 插入驗(yàn)證的PCR 圖譜

3.2 供受體菌混合比例對(duì)Tn 轉(zhuǎn)座突變效率的影響

研究表明[23]供體菌和受體菌之間的混合比例對(duì)篩選突變株非常關(guān)鍵，只有當(dāng)受體菌數(shù)量適量高于供體菌時(shí)才能獲得較高的突變株數(shù)量.收集菌濃一致的供體菌——大腸桿菌S17-1（pRL1063a）以及受體菌——沙雷氏Z4 菌菌液，將兩者分別按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 的比例接種于含有50 μg/mL Km 和25 μg/mL Tc 的LB 固體培養(yǎng)基上，對(duì)長出的突變株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖2、圖3）.

圖2 不同比例混合的沙雷氏Z4 菌與大腸桿菌S17-1（pRL1063a）對(duì)Tn5 轉(zhuǎn)座突變效率的影響

圖3 不同比例混合的沙雷氏Z4 菌（受體菌）與大腸桿菌S17-1（pRL1063a）（供體菌）對(duì)Tn5 轉(zhuǎn)座突變效率的影響

結(jié)果表明，供受體比例在1∶1 至1∶3 之間，Tn5 轉(zhuǎn)座突變能獲得較多的突變株，而隨著沙雷氏Z4 菌數(shù)量逐漸增多，獲得的突變株數(shù)量逐漸減少.可能是因?yàn)樵?0℃下沙雷氏菌生長速度快于大腸桿菌，當(dāng)受體沙雷氏Z4 菌數(shù)量大大增加時(shí)，會(huì)抑制大腸桿菌S17-1（pRL1063a）的生長，導(dǎo)致Tn5 轉(zhuǎn)座子只能插入少部分的沙雷氏Z4 菌中，使得突變株數(shù)量減少.因此，選擇供受體菌混合比例為1∶1.

3.3 混合培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Tn 轉(zhuǎn)座突變效率的影響

以1∶1 比例混合的沙雷氏Z4 菌與大腸桿菌S17-1（pRL1063a），分別于30℃混合震蕩培養(yǎng)1 h、3 h 和5 h，觀察突變株生長情況（圖4）.結(jié)果表明，不同混合培養(yǎng)時(shí)間后，都可以長出很多的沙雷氏Z4 突變菌株，且隨著混合培養(yǎng)時(shí)間延長，突變株的數(shù)量增多.說明，在雙親接合法中，供受體菌接合培養(yǎng)時(shí)間越長，接觸越充分，Tn5 轉(zhuǎn)座子插入突變的效率就越高.但隨著混合培養(yǎng)時(shí)間延長，混合菌不斷生長，突變株單菌落越來越密集，不利于后續(xù)單菌落挑取進(jìn)行傳代培養(yǎng).因此，選擇混合培養(yǎng)時(shí)間3 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖4 混合培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Tn5 轉(zhuǎn)座突變效率的影響

3.4 抗生素選擇壓力對(duì)Tn 轉(zhuǎn)座突變效率的影響

考慮到抗生素選擇壓力對(duì)沙雷氏Z4 菌轉(zhuǎn)座突變的影響，本實(shí)驗(yàn)分別檢測了大腸桿菌S17-1（pRL1063a）以及沙雷氏Z4 菌株對(duì)Km 和Tc 的敏感性（圖5）.結(jié)果表明，在分別含有100 μg/mL、75 μg/mL、50 μg/mL 和25 μg/mL Km LB 固體培養(yǎng)基上，沙雷氏Z4 菌的生長都受到抑制，而大腸桿菌S17-1（pRL1063a）在含有不同濃度的Km 固體培養(yǎng)基上都正常生長；在分別含有100 μg/mL、75 μg/mL、50 μg/mL 和25 μg/mL Tc 的LB 固體培養(yǎng)基上，大腸桿菌S17-1（pRL1063a）的生長都受到抑制，而沙雷氏Z4 菌在含有濃度分別為25 μg/mL、50 μg/mL 和75 μg/mL 的Tc 固體培養(yǎng)基上生長正常，但在含有100 μg/mL Tc 的固體培養(yǎng)基上則生長相對(duì)緩慢.

圖5 沙雷氏Z4 菌株和大腸桿菌S17-1（pRL1063a）對(duì)Km、Tc 的敏感性分析

設(shè)定抗生素選擇壓力，其中Km 濃度分別為100 μg/mL、75 μg/mL、50 μg/mL 和25 μg/mL，Tc 固定不變?yōu)?5 μg/mL.將50 μL 混合培養(yǎng)后的菌液涂布于對(duì)應(yīng)不同抗生素選擇壓力的LB 固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，對(duì)長出來的突變株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖6）.結(jié)果表明，Km 濃度越高，長出的沙雷氏Z4 突變菌株就越少；在含25 μg/mL Km 和25 μg/mL Tc 的篩選固體培養(yǎng)基上，突變株數(shù)量眾多，菌落密集難以分開，并且隨機(jī)挑選突變株再次轉(zhuǎn)接于含Km 和Tc 的LB 固體培養(yǎng)基上，所能長出的突變株很少，說明假陽性突變株多；而在含100 μg/mL Km 和25 μg/mL Tc 的固體培養(yǎng)基上，突變株數(shù)量少.因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇在50 μg/mL Km 和25 μg/mL Tc 的抗性LB 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選.

圖6 不同抗生素選擇壓力對(duì)突變效率的影響

3.5 沙雷氏菌Z4 生長狀態(tài)對(duì)Tn 轉(zhuǎn)座突變效率的影響

對(duì)沙雷氏Z4 菌株的生長情況進(jìn)行監(jiān)測，每2 h 測一次OD600值，繪制沙雷氏Z4 菌株的生長曲線（圖7）.結(jié)果表明，0-2 h 內(nèi)Z4 菌株位于遲緩期內(nèi)（OD600范圍在0-0.278），3-12 h 內(nèi)位于對(duì)數(shù)生長期（OD600范圍在0.400-3.500），13-14 h 位于平穩(wěn)期（OD600范圍在3.924-4.072）.分別選擇OD600為0.200、1.500、4.000 時(shí)期的沙雷氏Z4 菌株與大腸桿菌S17-1（pRL1063a）同比例混合，30℃培養(yǎng)3 h，涂布于雙抗篩選培養(yǎng)基上，對(duì)長出的突變株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖8）.結(jié)果表明，對(duì)處于遲緩期內(nèi)的沙雷氏Z4 菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)座突變，其突變效率低于對(duì)數(shù)生長期以及平穩(wěn)期的沙雷氏Z4 菌株；而對(duì)處于對(duì)數(shù)生長期和平穩(wěn)期的沙雷氏Z4 菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)座突變，均能獲得較多的突變株.平穩(wěn)期的沙雷氏Z4 菌株的生長活力不如對(duì)數(shù)生長期[24]，故選擇對(duì)數(shù)生長期的沙雷氏Z4 菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)座突變.

圖7 沙雷氏Z4 菌株生長曲線

圖8 不同沙雷氏Z4 菌株生長狀態(tài)對(duì)突變效率的影響

3.6 群體淬滅差異突變株的篩選

在上述優(yōu)化培養(yǎng)條件下，對(duì)沙雷氏Z4 菌株進(jìn)行Tn5 轉(zhuǎn)座子插入突變，構(gòu)建突變體庫.利用生物傳感器紫色桿菌CV026以及根癌農(nóng)桿菌KYC55對(duì)信號(hào)分子C6-HSL和C8-HSL的顯色原理，對(duì)突變體庫進(jìn)行篩選，篩選出與沙雷氏Z4 野生型QQ 能力有所差異的3 株突變株.其中2 株突變株3 號(hào)和5 號(hào)降解C6-HSL 和C8-HSL 后它們的顯色圈明顯比Z4 野生型的大（圖9），說明，突變株3 號(hào)和5 號(hào)對(duì)這兩種信號(hào)分子的降解能力比Z4 野生型的要低.可能在這2 株突變株中，Tn5 轉(zhuǎn)座子插入了與QQ 能力相關(guān)的基因中，阻斷了基因的表達(dá)，使突變株的QQ 能力降低.2號(hào)突變株降解C6-HSL 的顯色圈比Z4 野生型的明顯要小，故它的QQ 能力比Z4 野生型高，可能是轉(zhuǎn)座子插入到淬滅基因的負(fù)調(diào)控基因上，使得負(fù)向調(diào)控基因失活，因此QQ 能力上升.

圖9 沙雷氏Z4 突變菌株降解C6-HSL 及C8-HSL

4 結(jié) 論

結(jié)合國內(nèi)外QQ 研究發(fā)展趨勢(shì)，運(yùn)用Tn5 轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)，構(gòu)建沙雷氏Z4 菌株突變體庫，采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了沙雷氏Z4 菌Tn5 轉(zhuǎn)座子插入突變株的最適培養(yǎng)條件，在此基礎(chǔ)上篩選群體淬滅突變體，得出以下結(jié)論：

1）通過研究供受體菌混合比例、混合培養(yǎng)時(shí)間、抗生素選擇壓力以及沙雷氏Z4 菌株生長狀態(tài)對(duì)Tn5 轉(zhuǎn)座突變效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在沙雷氏Z4 菌株為對(duì)數(shù)生長期、供受體菌混合比例為1∶1、混合培養(yǎng)時(shí)間為3 h、Km 濃度為50 μg/mL、Tc 濃度為25 μg/mL 的培養(yǎng)條件下，獲得的沙雷氏Z4 突變體數(shù)量最優(yōu).

2）在最優(yōu)培養(yǎng)條件對(duì)沙雷氏Z4 菌株進(jìn)行Tn5 轉(zhuǎn)座突變，構(gòu)建突變體庫，利用生物傳感器篩選出了3 株沙雷氏Z4 突變菌株，其QQ 能力都與Z4 野生型有差異.