邱政輝，趙 萌，孔珊珊，范蘭蘭，吳鑫慧，葉曉霞,?

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州 325035；2.連云港市婦幼保健院，江蘇連云港 222000)

4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）是一類內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）抑制劑，具有分子伴侶活性的小分子化合物，能夠抑制蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，穩(wěn)定蛋白構(gòu)象[1-2].研究表明，4-PBA 可以通過抑制葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路對腦缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusion，I/R）小鼠模型的神經(jīng)元起到保護(hù)作用，且可以顯著改善I/R 小鼠的記憶能力[3-5].為了尋找對I/R 有更好治療作用的藥物，本文對4-PBA 進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造和初步的活性篩選.

研究發(fā)現(xiàn)，在ATP 缺失細(xì)胞模型中，4-PBA 類似物4-(4-氨基苯基)丁酸（4-(4-aminophenyl)butyric acid）表現(xiàn)出比4-PBA 更優(yōu)的細(xì)胞保護(hù)作用，且保護(hù)作用也更優(yōu)于腦卒中臨床用藥依達(dá)拉奉[6-9].為進(jìn)一步在動(dòng)物模型中探討4-(4-氨基苯基)丁酸能否有效穿透血腦屏障起到治療腦卒中的作用，本文構(gòu)建了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法以測定腹腔給藥后大鼠腦脊液中4-(4-氨基苯基)丁酸的藥物濃度，以期為該藥物后期研究和開發(fā)提供參考.

1 儀器與材料

1.1 儀 器

高效液相色譜儀（ACQUITY 系統(tǒng)，美國Waters 公司）串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters 公司），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Forma 公司），超低溫冰箱（美國Thermo Forma 公司），MVS-1型渦旋混合器（北京北德遠(yuǎn)大科技有限公司），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦立體定位儀、眼科剪、止血鉗（均產(chǎn)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司）.

1.2 材 料

1.2.1 試 劑

4-(4-氨基苯基)丁酸對照品（純度99.9%，批號(hào)BD12148，百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司），乙腈（色譜純，批號(hào)137738，賽默飛世爾）.

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50 只雄性清潔級(jí)SD 大鼠（200-250 g）購自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(浙)2020-0001，使用許可證編號(hào)為SYXK(浙)2020-0014），飼養(yǎng)于室溫、晝夜交替的環(huán)境中，自由進(jìn)食和飲水兩周.本實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理相關(guān)規(guī)定，符合動(dòng)物生產(chǎn)和使用規(guī)范.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方案經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn).

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters AtlantisTM-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）.以含0.1%甲酸的水（A）和乙腈（B）進(jìn)行梯度洗脫（0-1.5 min，5% B→95%B；1.5-2.5 min，90%B；2.5-3.0 min，90% B→5%B；3.0-4.0 min，5%B），流速0.4 mL/ min，柱溫25℃，進(jìn)樣量1μL.

2.2 質(zhì)譜條件

采用離子阱離子源，正電荷檢測模式，檢測方式為多反應(yīng)檢測（MRM）；毛細(xì)管電壓3 kV，錐孔電壓38 V，碰撞能量12 V，去溶劑化溫度350℃，脫溶劑氣流量650 L/ h，錐孔氣流量50 L/ h，定性和定量離子對均為m/z180 ＞ 106.

2.3 腦脊液采集

采用直接穿刺小腦延髓池法[10].以10%水合氯醛，按照3.5 mL/ kg 劑量腹腔注射麻醉大鼠，再以腦立體定位儀固定大鼠頭部，調(diào)節(jié)大鼠鼻尖，使其頭部伸直.接著以眼科剪在大鼠兩耳之間橫向剪開一個(gè)1.5-2 cm 的切口，再在頸部縱向剪一個(gè)1.5-2 cm 的切口，形成一個(gè)“T”字型切口.以鑷子鈍性剝離肌肉夾層使枕骨大孔暴露在視野中，完成后，以止血鉗將兩側(cè)肌肉夾緊并拉向兩側(cè)，使操作視野完全暴露.以1 mL 注射器在正中線枕骨棘下約3 mm 處緩慢進(jìn)針，至感受到落空感為止，緩慢抽取腦脊液約100 μL，置于1.5 mL 離心管中，并迅速轉(zhuǎn)移至-80℃條件下儲(chǔ)存.

2.4 儲(chǔ)備溶液和工作溶液配制

精密稱取4-(4-氨基苯基)丁酸對照品10.0 mg，置于10.00 mL 容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至瓶頸刻度處定容，作為儲(chǔ)備溶液，置于4℃冰箱中儲(chǔ)存.精密量取4-(4-氨基苯基)丁酸儲(chǔ)備液，以乙腈稀釋為濃度分別為60 ng/ mL、200 ng/ mL、400 ng/ mL、1 000 ng/ mL、2 000 ng/ mL、4 000 ng/ mL、8 000 ng/ mL、12 000 ng/ mL、16 000 ng/ mL、20 000 ng/ mL 的工作溶液，置于4℃冰箱中備用.

2.5 樣品處理

取空白腦脊液200 μL，置于1.5 mL 離心管中，加入200 μL 工作溶液，渦旋混勻1 min，離心10 min（12 000 r/ min，4℃），取上清液，進(jìn)樣分析.空白腦脊液樣品制備，以乙腈替換工作溶液.

2.6 專屬性

取空白腦脊液樣品與添加工作溶液的樣品，在本文分析條件下進(jìn)樣分析，通過譜圖比對發(fā)現(xiàn)，4-(4-氨基苯基)丁酸的保留時(shí)間為1.98 min，且空白腦脊液中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾其測定，即采用該檢測方法，化合物的保留時(shí)間是一定的，即使存在腦脊液的干擾，此化合物的保留時(shí)間仍然是保持一致的，說明此檢測方法對于此化合物具有專屬性.色譜圖見圖1，結(jié)構(gòu)式及質(zhì)譜圖見圖2.

圖1 4-(4-氨基苯基)丁酸的色譜圖

圖2 4-(4-氨基苯基)丁酸的結(jié)構(gòu)式和質(zhì)譜圖

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限

取200 L空白腦脊液，加入200 L不同濃度的工作溶液，渦旋混勻，獲得濃度分別為30 ng/ mL、100 ng/ mL、200 ng/ mL、500 ng/ mL、1 000 ng/ mL、2 000 ng/ mL、4 000 ng/ mL、6 000 ng/ mL、8 000 ng/ mL 和10 000 ng/ mL 的溶液，按前面2.5 節(jié)的樣品處理方法操作，進(jìn)樣分析.以4-(4-氨基苯基)丁酸的峰面積為y軸，以4-(4-氨基苯基)丁酸的濃度為x軸，經(jīng)線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=218 080x+27 920（R2=0.999 0，n=10），結(jié)果表明，4-(4-氨基苯基)丁酸濃度在30-10 000 ng/ mL 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，定量下限為30 ng/ mL.

2.8 準(zhǔn)確度和精密度

取不同濃度的工作溶液，按前面2.5 節(jié)的樣品處理方法操作，配制成低、中、高濃度分別為100 ng/ mL、2 000 ng/ mL、8 000 ng/ mL 的質(zhì)控樣品，進(jìn)樣分析.每個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)平行樣品，連續(xù)測定3 天，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)控樣品的濃度，計(jì)算相對偏差、日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果見表1.

表1 大鼠腦脊液中4-(4-氨基苯基)丁酸濃度測定的準(zhǔn)確度和精密度

2.9 提取回收率

取不同濃度的工作溶液，按2.5 節(jié)的樣品處理方法配制成低、中、高濃度分別為100 ng/ mL、2 000 ng/ mL、8 000 ng/ mL 的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)平行樣品A；另取五個(gè)獨(dú)立空白樣品，以乙腈直接稀釋工作溶液，至樣品終濃度分別為100 ng/ mL、2 000 ng/ mL、8 000 ng/ mL，再經(jīng)渦旋混勻1 min，離心10 min（12 000 r/ min，4℃），取上清液獲得樣品B.以相應(yīng)濃度的樣品A 與樣品B 進(jìn)樣，分析所得的色譜峰面積之比計(jì)算提取回收率，2 個(gè)濃度的提取回收率分別為70.26%、85.34%和81.49%.

2.10 穩(wěn)定性

取不同濃度的工作溶液，按2.5 節(jié)的樣品處理方法配制成低、中、高濃度分別為100 ng/ mL、2 000 ng/ mL、8 000 ng/ mL 的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度設(shè)置15 份平行樣品，其中10 份樣品置于自動(dòng)進(jìn)樣器中，5 份于0 h，5 份于24 h，進(jìn)樣分析，3 個(gè)濃度下RSD 均小于8%.同時(shí)，另外5 份樣品，放在-20℃下冷藏24 h，反復(fù)凍融3 次后進(jìn)樣分析，3 個(gè)濃度下RSD 均小于9%.結(jié)果表明，在室溫下保存或冷藏和反復(fù)凍融條件下，4-(4-氨基苯基)丁酸均具有較好的穩(wěn)定性.

2.11 實(shí)驗(yàn)樣品測定

將35 只清潔級(jí)SD 大鼠隨機(jī)分配為7 組，每組5 只.通過腹腔注射，給予每只大鼠4-(4-氨基苯基)丁酸（30 mg/ kg），并于給藥后0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h 共計(jì)7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)抽取大鼠腦脊液，按2.5 節(jié)的樣品處理方法處理后，進(jìn)樣分析，計(jì)算大鼠腦脊液中4-(4-氨基苯基)丁酸的濃度.以大鼠腦脊液中藥物濃度為縱軸，時(shí)間為橫軸，繪制藥-時(shí)曲線，見圖3.

結(jié)果（見圖3）顯示，4-(4-氨基苯基)丁酸在腹腔給藥1 h 后，腦脊液中藥物濃度即達(dá)到有效濃度2 μg/ mL，在給藥4 h 后達(dá)到峰值，約7 μg/ mL.一次腹腔給藥30 mg/ kg 后，在大鼠腦脊液中能維持有效濃度約6 h.這表明4-(4-氨基苯基)丁酸能夠很好地通過血腦屏障，并在腦脊液中發(fā)揮藥效.

圖3 大鼠腦脊液中4-(4-氨基苯基)丁酸的藥-時(shí)曲線圖

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的選擇

采用甲醇-水體系、甲醇-甲酸水體系、乙腈-水體系、乙腈-甲酸水體系作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)相較于甲醇，使用乙腈可以獲得更好的峰形.尤其值得關(guān)注的是，當(dāng)流動(dòng)相體系中不加入甲酸時(shí)，目標(biāo)化合物在色譜圖上會(huì)出現(xiàn)雙峰，這可能與目標(biāo)化合物同時(shí)存在氨基和羧基有關(guān)，在中性條件下同時(shí)以兩種形態(tài)存在，故流動(dòng)相選擇乙腈-甲酸水體系.

3.2 樣品前處理方法的選擇

在樣品前處理過程中，用乙腈、甲醇等多種有機(jī)溶劑為蛋白沉淀劑，結(jié)果表明乙腈效果最好，甲醇沉淀效果較差，所以最終選定乙腈為蛋白沉淀劑，以1 倍腦脊液樣品體積的乙腈沉淀蛋白，離心后取上清液進(jìn)樣分析.該前處理方法便利、快捷，有望滿足今后大量樣本分析的需要.

4 結(jié) 語

本文首次建立了采用HPLC-MS/MS 方法測定大鼠腦脊液中4-(4-氨基苯基)丁酸濃度的方法，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線在30-10 000 ng/ mL 范圍內(nèi)線性良好，回歸方程的相關(guān)系數(shù)在0.999 0 以上，方法準(zhǔn)確且穩(wěn)定，樣品前處理過程簡單，只需要一步沉淀和簡單渦旋離心即可.本文構(gòu)建的分析方法，可為其他類似藥物的測定提高參考.