李 會，熊 靜，梅 翠，王士源，周 洋,3，李曉芬，付貴花，張 陽, 程 鵬，何玉張，陳紅偉,3*

(1.西南大學動物醫(yī)學院，重慶 402460; 2.西南大學醫(yī)學研究院免疫學研究中心，重慶 402460; 3.國家生豬技術創(chuàng)新中心，重慶 402460)

自2008年Overhage等首次報道人源抗菌肽LL-37能抑制細菌生物被膜形成以來，陸續(xù)發(fā)現一些抗菌肽具有殺滅生物被膜細菌、干擾胞外基質(extracellular polymeric substance，EPS)產生和穩(wěn)定性、抑制群體感應(quorum sensing，QS)依賴性生物被膜形成等活性，將這些具有抗生物被膜活性的抗菌肽稱之為抗生物被膜肽(anti-biofilm peptides)?？股锉荒る囊蚱洫毺氐淖饔脵C制、良好的EPS滲透性和低誘導耐藥等特性有望成為控制生物被膜感染的有力武器，但是潛在的細胞毒性、溶血性、穩(wěn)定性等問題亟待解決。

CRAMP是在小鼠髓系細胞中被發(fā)現的第一個抗菌肽，其結構和功能與LL-37極為相似，其 Gly到Leu的兩親性α螺旋區(qū)域在跨脂質雙分子層及其抗菌活性中起著重要作用，基于這種結構可以開發(fā)出具有強抗菌活性、無溶血作用的新型抗菌肽。前期作者對13種具有潛在抗生物被膜活性的抗菌肽進行系統研究，發(fā)現僅有CRAMP對銅綠假單胞菌(，)標準株，27853成熟生物被膜有顯著清除作用，清除率達50%。后又發(fā)現CRAMP聯用部分抗生素抑制生物被膜的形成有明顯的協同作用，且對QS系統相關基因表達有明顯的影響，抗菌肽CRAMP亦稱為抗生物被膜肽。近期，作者對其進行了結構修飾，利用轉錄組學方法初步探究了 CRAMP干預成熟生物被膜的作用機制。本文主要對該修飾肽的安全性、穩(wěn)定性及其對銅綠假單胞菌野生株PAO1成熟生物被膜的清除作用進一步考察。

1 材料與方法

1.1 菌株和藥品

銅綠假單胞菌PAO1野生株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。CRAMP和LL-37由蘇州強耀生物科技有限公司合成，CRAMP的合成和修飾詳見國家發(fā)明專利(201810701474.7)。恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)含量為98.9%；乳酸環(huán)丙沙星(ciprofloxacin lactate，CIP)含量為93.4%，硫酸慶大霉素(gentamicinsulfate，GM)含量為620 IU·mg，購自上虞京新藥業(yè)有限公司；LDH Cytotoxicity Assay Kit試劑盒購自英國Cayman Chemical公司。

1.2 主要試劑

小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶均購自索萊寶生物科技有限公司。MHB、TSA培養(yǎng)基等購自青島海博生物技術有限公司。1%結晶紫、Triton X-100購自北京索萊寶科技有限公司。96孔細胞培養(yǎng)板(3599)、6孔細胞培養(yǎng)板(3516)購自美國康寧公司。Lab-TekII腔室蓋玻片、FilmTracerLIVE/DEAD Biofilm Viability Kit購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 溶血率檢測

參考Mohanram和Bhattachariya的試驗方法并改進，采集新鮮兔血制備4%的紅細胞懸液，取100 μL紅細胞懸液和100 μL CRAMP等體積混合，CRAMP終濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812和3.906 mg·L，設置陰性對照組(PBS緩沖液)，陽性對照組(1%Triton X-100)；37 ℃恒溫培養(yǎng)1 h，4 ℃離心(1 000 r·min5 min)，取100 μL的上清液，測OD值。溶血率的計算公式：

(AE-A陰性)/(A陽性-A陰性)×100%

AE：CRAMP組的OD值；A陰性：陰性對照PBS緩沖液組OD值；A陽性：陽性對照1%Triton X-100組OD值。試驗獨立重復3次，下同。

1.4 細胞毒性檢測

參考Kumar等的試驗方法以及LDH Cytotoxicity Assay Kit 試劑盒說明書進行試驗，先將小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，37 ℃ 5% CO細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h，加DMEM為背景對照；再在每孔加20 μL CRAMP溶液，使終濃度為500、250、125、62.5 mg·L，設置陰性對照組(DMEM培養(yǎng)基)、陽性對照組(1%Triton X-100)，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，取100 μL上清液，加入至新的96孔板中，加100 μL LDH反應液，37 ℃振蕩培養(yǎng)30 min，用酶標儀測OD。LDH釋放率的計算公式：

LDH釋放率(%)=(OD-OD)/(OD-OD)×100

OD：CRAMP組的OD值；OD：Triton X-100陽性對照組(最大釋放量)；OD：DMEM培養(yǎng)基陰性對照組(自然釋放量)。

1.5 熱處理對CRAMP抗菌活性的影響

參考Thery等的方法，將濃度為2 000 mg·L的CRAMP在25、50、75、100 ℃的恒溫水浴鍋中保溫30 min，未經處理的CRAMP為對照組，分別測定不同溫度處理后CRAMP的MIC。

1.6 鹽離子對CRAMP抗菌活性的影響

參考Sun等報道的方法，配制濃度為50～250 mmol·L的NaCl和KCl溶液，分別與2 000 mg·L的CRAMP等體積混合，未經鹽離子處理的CRAMP為對照組，測定不同鹽離子處理后CRAMP的MIC，分析鹽離子處理對CRAMP抑菌活性的影響。

1.7 蛋白酶對CRAMP抗菌活性的影響

參考Kim等報道的方法，按照3種酶(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶)說明書配制儲備液。取2 000 mg·L的CRAMP溶液分別加入3種不同的酶，使酶的反應終濃度為1 000 mg·L，在37 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，未經酶處理的CRAMP為對照組，測定不同酶處理后CRAMP的MIC，分析酶處理對CRAMP抑菌活性的影響。

1.8 不同pH對CRAMP穩(wěn)定性的影響

參考Wu等報道的方法，將CRAMP溶液調pH為3、4、5、6、7、8、9和10，高壓滅菌(121 ℃ 30 min)后備用，分別配制8個pH條件下的初濃度為2 000 mg·L的CRAMP，未經pH調整處理的CRAMP為對照組，測定不同pH調整處理后CRAMP的MIC，分析不同pH值對CRAMP抑菌活性的影響。

1.9 CRAMP對PAO1成熟生物被膜的影響

參考課題組之前報道的方法，將PAO1菌株隔夜培養(yǎng)，調整OD=0.1，并稀釋100倍，作為工作菌液。將1.2 mL工作菌液加入6孔細胞板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，形成成熟生物被膜。棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗凈浮游菌，加入前期試驗中篩選出的最佳作用濃度，即4倍MIC的CRAMP干預1 h后進行后續(xù)試驗，同法設置LL-37和3種抗菌藥(乳酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、硫酸慶大霉素)為對照。

參考課題組之前報道的方法考察生物被膜量和生物被膜活菌數。用PBS緩沖液洗滌生物被膜3次。加入甲醇固定10 min。吸凈甲醇，待甲醇揮發(fā)后加入結晶紫溶液染色20 min。洗滌生物被膜后加入醋酸溶液溶解生物被膜，在630 nm處測定OD值，檢測生物被膜量(Biomass)。同法洗滌生物被膜，加入Triton，吹打混勻，充分破壞生物被膜，進行10倍梯度稀釋。最后取100 μL涂布于TSA板上進行生物被膜活菌計數(lg CFU·mL)。

1.10 胞外基質(EPS)的檢測

參考陳園園和彭黨聰報道的方法進行EPS提取與定量，將生物被膜樣品中加入PBS溶液重懸至8 mL，80 ℃ 800 r·min下，反應1 h，高速冷凍離心機(4 ℃)離心10 min，10 000 r·min，上清液用0.22 μm濾膜過濾后得EPS樣品溶液。EPS組分中的多糖采用苯酚-硫酸比色法測定，以葡萄糖配制標準溶液(20、25、30、35、40 mg·L)并繪制標準曲線；蛋白質采用Folin-酚試劑法測定，以牛蛋白血清配制標準溶液(50、100、150、200、250 mg·L)并繪制標準曲線；兩者之和為EPS總量。

1.11 激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)表征生物被膜形態(tài)

參考課題組之前報道的方法，用MHB培養(yǎng)基培養(yǎng)銅綠假單胞菌過夜，調整其OD=0.1。將500 μL的菌懸液加入Lab-TekII腔室蓋玻片中。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5 d，每隔24 h更換MHB培養(yǎng)基，加入等量的新鮮MHB肉湯。培養(yǎng)5 d后，吸凈培養(yǎng)基并用0.9% NaCl溶液洗去未附著的細菌。加入500 μL的藥液干預1 h，洗滌生物被膜2次，在暗室中用FilmtracerLIVE/DEADBiofilm Viability Kit[終濃度為5 μmol·LSYTO和30 μmol·Lpropidium iodide(PI)]染色20 min。用滅菌水洗去多余的染料，在Zeiss-800共聚焦激光顯微鏡10倍物鏡和63倍物鏡下觀察生物被膜。激發(fā)波長分別為488 nm(SYTO)和561 nm(PI)，發(fā)射波長分別為450～560 nm(SYTO)和400～700 nm(PI)。獨立重復3次試驗，空白組、藥物組每次均平行操作3個以上技術性重復。在10倍物鏡下隨機選取視野，并進行Z-stack，每個組合計不少于18個視野，最后進行熒光強度統計分析。

1.12 統計學處理

2 結 果

2.1 對PAO1的最小抑菌濃度(MIC)

CRAMP及對照藥物對PAO1的MIC結果見表1。結果顯示，CRAMP和LL-37對PAO1的MIC值均為15.625 mg·L，對PAO1浮游菌的抗菌效果明顯低于恩諾沙星、環(huán)丙沙星和慶大霉素。

表1 CRAMP及對照藥物對PAO1的MIC

2.2 CRAMP的溶血性

CRAMP對兔紅細胞的溶血性如圖1所示。所有受試濃度CRAMP的溶血性檢測的OD值與陰性對照組(PBS緩沖液)無差異顯著性(>0.05)，均極顯著低于陽性對照組(1%Triton X-100)(<0.001)。經計算所有受試濃度的CRAMP的溶血率均小于1.5%，即未呈現溶血性。

試驗組與陰性或陽性對照比較，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001；數據均為“平均值±標準差”，下圖同

2.3 CRAMP的細胞毒性

CRAMP作用于小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7后的LDH釋放率如圖2所示。隨著CRAMP濃度的增加，RAW264.7細胞LDH釋放率呈上升趨勢。CRAMP組的LDH釋放率與陰性對照組相比，在62.5、125 mg·L濃度時無顯著性差異，但250和500 mg·L均有差異顯著性。所有測試濃度均顯著低于陽性對照組的LDH釋放率。表明當CRAMP濃度高于250 mg·L時，隨著濃度增加，對小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7的毒性逐步增大，但在62.5、125 mg·L時無細胞毒性。

圖2 CRAMP對RAW264.7細胞LDH釋放率的影響

2.4 熱處理對CRAMP抗菌活性的影響

CRAMP在25、50、75、100 ℃水浴加熱30 min后，對PAO1的MIC值如表2所示。與對照組相比較，CRAMP經過高溫加熱后，25～75 ℃的MIC值仍為15.625 mg·L，100 ℃時MIC增大至下一個濃度梯度。說明CRAMP具有較高的熱穩(wěn)定性。

表2 溫度對CRAMP抗菌活性的影響

2.5 鹽離子處理對CRAMP抗菌活性的影響

CRAMP經過Na、K離子的5種濃度(50～250 mmol·L)處理后對PAO1的MIC值如表3所示。兩種離子的所有測試濃度處理CRAMP后對PAO1的MIC值均未發(fā)生變化。

表3 鹽離子對CRAMP抗菌活性的影響

2.6 不同蛋白酶處理后對CRAMP抗菌活性的影響

CRAMP經過3種不同的蛋白酶(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶)處理后對PAO1的MIC值如表4所示。胃蛋白酶處理后，CRAMP的MIC上升為125 mg·L(即8MIC)，但仍具有一定的抗菌活性；木瓜蛋白酶和胰蛋白酶對CRAMP的抑菌活性影響最大，MIC已經分別上升至500 mg·L和大于500 mg·L，此時的CRAMP幾乎沒有抑菌活性。

表4 蛋白酶對CRAMP抗菌活性的影響

2.7 不同pH條件下 CRAMP的抗菌活性

CRAMP經過不同的pH的酸堿處理后對PAO1的MIC值如表5所示，在pH≥5的條件下，CRAMP的抗菌活性不受影響，在pH為3和4時，CRAMP的MIC分別為31.25 和62.5 mg·L，降低了CRAMP的抗菌活性。

表5 不同pH對CRAMP抗菌活性的影響

2.8 6孔細胞培養(yǎng)板中生物被膜量和生物被膜活菌測定結果

CRAMP(4MIC)組與空白對照孔比較，能有效減少生物被膜量(<0.001，生物被膜量減少率為76.74%)；LL-37(4MIC)組與空白對照孔比較，也能有效的減少生物被膜量(<0.01，生物被膜量減少率為51.16%)。3種抗菌藥物均未呈現顯著性變化，初步表明該濃度下的3種抗菌藥物(4MIC)對PAO1成熟生物被膜沒有抑制作用，因此后續(xù)活菌計數僅在CRAMP和LL-37中開展。CRAMP組與空白對照孔比較，能極顯著的減少PAO1生物被膜的活菌數量(<0.001，減少了1.2個lg CFU·mL)，而LL-37組與空白對照孔比較，生物被膜活菌數未見顯著性變化(>0.05)。結果詳見圖3、4。

CRAMP.抗菌肽CRAMP；LL-37.抗菌肽LL-37；EN.恩諾沙星；CIP.乳酸環(huán)丙沙星；GM.硫酸慶大霉素；與本試驗組的空白對照孔比較，*.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001。下同

圖4 6孔細胞培養(yǎng)板中各試驗的生物被膜活菌計數

2.9 CRAMP對PAO1成熟生物被膜EPS含量的影響

將EPS樣品中的多糖和蛋白質含量合并，并將空白對照歸一到1后進行統計學分析，CRAMP組與空白對照孔比較，EPS含量顯著下降(<0.05)；LL-37與空白對照孔比較差異不顯著(>0.05)；兩試驗組間比較，CRAMP組的EPS含量顯著小于LL-37組(<0.05)，表明CRAMP(4MIC)能明顯減少PAO1成熟生物被膜胞外基質的產生，效果優(yōu)于LL-37。結果見表6。

表6 PAO1生物被膜的胞外基質的含量

2.10 激光共聚焦掃描顯微鏡形態(tài)學觀察結果

通過對所有Z-stack的圖像文件進行熒光強度統計學分析，CRAMP(4MIC)組與空白對照孔比較，能顯著地減少細菌總熒光強度(SYTO和PI熒光強度合計，反映死菌活菌總量)(<0.05，減少了42.41%)，LL-37(4MIC)組與空白對照孔比較，差異不顯著(>0.05)；且CRAMP(4MIC)組的細菌總熒光強度顯著低于LL-37(4MIC)組(<0.05)。結果表明，CRAMP對PAO1成熟生物被膜的死菌和活菌總量有顯著清除作用，且效果優(yōu)于LL-37。CRAMP(4MIC)組與空白對照孔比較，PI/SYTO(死菌熒光強度/活菌熒光強度)比值極顯著增大(<0.01)，LL-37(4MIC)組與空白對照孔比較也存在差異顯著性(<0.01)，但死菌的熒光強度較CRAMP組略低。進一步表明，CRAMP對PAO1成熟生物被膜具有明顯的清除作用，對生物被膜活菌也有顯著的抑殺作用，且效果優(yōu)于LL-37，結果詳見表7。代表性的CLSM圖見圖5。

表7 CLSM的熒光強度分析

A.Control組的正交圖；B.Control組3D圖；C.CRAMP組的正交圖；D.CRAMP組3D圖；E.LL-37的正交圖；F.LL-37組3D圖

3 討 論

我國從2020年開始在飼料中全面禁止添加抗生素，開發(fā)替代傳統抗生素的安全、高效的新型抗菌劑已是全球性共識。抗菌肽被廣泛譽為抗生素替代品，但是當前限制抗菌肽臨床應用的主要因素包括溶血性、細胞毒性以及不穩(wěn)定性，在已發(fā)現的眾多抗菌肽中，盡管有些具有較強的抑菌活性，但往往也具有較高的溶血性和較強的細胞毒性，通常情況下5%以下的家兔紅細胞溶血率即可認為是無溶血性，本試驗中所有測試濃度的CRAMP對兔紅細胞的溶血率均未超過1.5%，表明所測試濃度的CRAMP對家兔紅細胞未呈現溶血性，與文獻報道具有一致性，如Gallo等報道CRAMP在濃度為50 μmol·L(約194 mg·L)時對人和羊紅細胞無溶血活性，CRAMP-18的類似物具有抗菌活性但沒有溶血性。CRAMP的低溶血性可能是因為具有最高疏水性水平的脂肪族和芳香族氨基酸異亮氨酸(Ile)和苯丙氨酸(Phe)有關。另外，脯氨酸(Pro)和賴氨酸(Lys)的存在也能降低其溶血性。另外，本試驗中CRAMP濃度低于125 mg·L時對RAW264.7 細胞無毒性，此濃度遠高于最小抑菌濃度，當CRAMP在250 mg·L時出現了一定的細胞毒性。與文獻報道也具有一致性，如李楊報道20 mg·kg劑量的CRAMP經腹腔注射小鼠并不會對小鼠造成明顯的毒性反應和器官損傷。Winderickx等報道了CRAMP的衍生物對HepG2細胞沒有毒性。Nagaram等報道了抗菌肽MF18對RAW 264.7的細胞毒性以及人紅細胞的溶血性，表現出低細胞毒性和溶血性，并分析該肽富含帶正電荷的賴氨酸對細菌細胞膜具有很強的親和力，因此降低了對真核細胞的毒性，CRAMP也富含大量的賴氨酸，因此推測其低細胞毒性與此相關。

高鹽、高熱等外界因素以及復雜的體內環(huán)境通常會影響抗菌肽的穩(wěn)定性。作者發(fā)現，高鹽、高熱和高pH條件對CRAMP的抗菌活性均未產生明顯影響，但是低pH(<4)，尤其是3種蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶)能明顯降低CRAMP的抗菌活性。魏曉曉等報道了75～100 ℃的高溫、80～100 mmol·L的高濃度NaCl和pH4.0及pH10.0的高酸堿性對人工合成抗菌肽JH-3的抑菌活性沒有明顯的影響。Starr和Wimley發(fā)現多種抗菌肽能被人紅細胞蛋白酶降解，通常認為抗菌肽具有蛋白酶的酶切位點就容易被酶解失活。而將抗菌肽進行環(huán)化處理，可以形成限制性構象而增強與靶分子的結合性能和對受體的選擇性，具有低毒、易于穿透細胞膜、抵抗外肽酶和內肽酶的水解等特點，較線性肽具有更多生物學活性和醫(yī)藥價值。

總之，天然抗菌肽存在抗菌活性不高、會對宿主細胞產生一定的毒性和溶血性等缺陷，一定程度上阻礙了抗菌肽的臨床應用，可采用改變其多肽鏈電荷量或疏水性的方式對天然抗菌肽進行分子改造，以獲得具有良好抑菌活性、且細胞毒性較小的抗菌肽類似物。本文采用的CRAMP(34個氨基酸)是在天然CRAMP(38個氨基酸)基礎上修飾改造而得，提高了其安全性和穩(wěn)定性，但是蛋白酶穩(wěn)定性還有待改善，本課題組近期也成功設計合成了環(huán)狀多肽Cyclic-CRAMP，另外采用納米修飾等來提高CRAMP的蛋白酶穩(wěn)定性，但其生物學活性還有待深入考察。

也稱綠膿桿菌，是一種常見的人畜共患條件性致病菌。近年來，隨著全國各地養(yǎng)殖規(guī)模、飼養(yǎng)方式、畜禽貿易以及防制措施等方面的變化，銅綠假單胞菌病發(fā)病率顯著上升，往往造成幼小畜禽的銅綠假單胞菌病大群暴發(fā)。2017年，世界衛(wèi)生組織將列為最嚴重威脅的12種細菌之一，并列為急需開發(fā)新型抗菌藥物的病原體?？傊摼鷮Υ蟛糠殖Ｒ娍股啬退?，感染易反復發(fā)作, 難以清除，究其原因主要是極易形成生物被膜，因此也常作為生物被膜研究的模式菌株。當前，已有大量圍繞干預生物被膜的研究報道，為防控生物被膜感染奠定了堅實的基礎，但是這些研究主要集中在抑制生物被膜的形成階段。而隨著生物被膜不斷堆積，發(fā)育成具有典型蘑菇樣結構的成熟生物被膜時，傳統的抗生素很難滲透進入已經高度結構化的成熟生物被膜殺死生物被膜內細菌，即使能進入一部分，但對生物被膜內低生長率和低代謝活性的細菌，尤其是持留菌更是束手無策。但實際上在臨床中，常常面臨的是已經形成的生物被膜，即成熟生物被膜。因此，加速對成熟生物被膜清除的研究已經成為迫切需要解決的問題。前期，作者通過 96 孔細胞板篩選發(fā)現 CRAMP對于PAO1 成熟生物被膜呈濃度依賴性抑制，在4MIC濃度，即62.5 mg·L時達到最高(抑制率 56.56%)，本試驗以1.2 mL的培養(yǎng)體系在6孔細胞板中建立24 h成熟生物被膜，并設置了4倍MIC的LL-37和3種抗菌藥(乳酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、硫酸慶大霉素)為對照，結果顯示，CRAMP能顯著減少生物被膜量，減少率達76.74%，同時極顯著地減少了PAO1生物被膜的活菌數量，減少了1.2個lg CFU·mL，即90%以上的生物被膜細菌被抑殺，表明CRAMP對PAO1成熟生物被膜具有明顯的清除作用，效果優(yōu)于LL-37和3種抗菌藥。另外，CRAMP也能明顯減少PAO1成熟生物被膜胞外基質的產生，效果也優(yōu)于LL-37。

另外，本試驗在前期試驗基礎上對激光共聚焦顯微鏡觀察PAO1生物被膜時的染色條件進行了優(yōu)化，并進行了3D結構重構，更加直觀地反映出了生物被膜的厚度和整體密度。對多次獨立重復的不同視野進行Z-stack掃描，并將掃描文件的熒光強度進行統計學分析后發(fā)現，CRAMP干預生物被膜后除了總熒光強度顯著降低外，死菌的比例也顯著升高了，進一步驗證了CRAMP對PAO1成熟生物被膜具有明顯的清除作用，對生物被膜活菌有顯著的抑殺作用，且效果優(yōu)于LL-37。與前面的生物被膜量和生物被膜活菌數的研究結果相吻合。

綜上表明，CRAMP對臨床控制生物被膜感染具有一定的指導意義，同時也為后續(xù)開展其作用機制研究奠定了堅實基礎。

4 結 論

CRAMP具有低溶血性、低細胞毒性，除蛋白酶作用不穩(wěn)定外，具有較好的穩(wěn)定性，對PAO1成熟生物被膜具有明顯的清除作用，且效果優(yōu)于LL-37和常見的抗菌藥。