杜 紅,孫弟芬,易 鑫,唐子婷,徐 丹,舒 剛
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,成都 611130)
抗菌肽(antibacterial peptides,ABPs)是動物先天免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分,是由機(jī)體產(chǎn)生的一種相對分子量小、具有生物活性的多肽,具有廣譜抗菌、抗病毒、抗原蟲和提高免疫力等多種生物學(xué)功能[1]。由于堿性殘基的存在,大多數(shù)昆蟲抗菌肽都是陽離子分子,具有良好的抑菌活性[2]。與天然類似物相比,人工合成的抗菌肽具有合成效率高、成本低且能更顯著提高機(jī)體抗菌和免疫調(diào)節(jié)效果等特點(diǎn)[3]。有研究表明,作為飼料添加劑的人工抗菌肽,能顯著下調(diào)家禽腸道中致病性大腸桿菌的數(shù)量,防止病原菌的定植,提高免疫,同時具有改善動物健康和促進(jìn)生長的潛力[4]??咕哪軌蛲ㄟ^調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系的組成來調(diào)節(jié)固有層T細(xì)胞的反應(yīng),從而維持促炎和抗炎免疫反應(yīng)之間的平衡[5]。近年來,抗菌肽在動物養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛,在日糧中添加抗菌肽能提高肉雞、斷奶仔豬和兔子的生長和免疫功能,同時對抗應(yīng)激和腹瀉治療效果顯著[6-8]。綜上所述,抗菌肽具有提高免疫力、抑制耐藥菌株、改善腸道健康和促進(jìn)生長等多種作用,是理想的飼料添加劑之一。然而,國內(nèi)外對抗菌肽作為飼料添加劑在鵪鶉生產(chǎn)中應(yīng)用的研究報道較少。因此,本試驗(yàn)通過在朝鮮鵪鶉飼糧中添加不同比例的抗菌肽,觀察其對朝鮮鵪鶉生長性能、免疫功能、血清抗氧化及腸道發(fā)育影響,以期為抗菌肽在鵪鶉綠色養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。
試驗(yàn)動物朝鮮鵪鶉由眉山佳業(yè)鵪鶉合作社提供;試驗(yàn)用品抗菌肽采購自四川華德生物工程有限公司,由豬防御素(DHYICAKGGTCNFSPCPLFN RIEGTCYSGKAKCCIR)和蒼蠅防御素(ATCDLL SGTGVKHSACAAHCLLRGNRGGYCNGRAICVCRN)按50%比例混合而成,生產(chǎn)批號:20160501。試劑盒均采購自南京建成生物工程研究所,包括總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA),細(xì) 胞 因 子 IL2 和 IFN-γ,生 產(chǎn) 批 號 :20160522。
試驗(yàn)采取單因子完全隨機(jī)設(shè)計原則,選取1 200只1 d體重相當(dāng)(7±1)g的健康雌性朝鮮鵪鶉,隨機(jī)分為4組,每組4個重復(fù),每個重復(fù)75只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,抗菌肽Ⅰ組、抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.1%、0.2%和0.4%抗菌肽,試驗(yàn)期為35 d,預(yù)試期7 d,正試期28 d。
采用三層網(wǎng)床平養(yǎng),小間分區(qū),自由采食與飲水。嚴(yán)格按照常規(guī)飼養(yǎng)管理控制溫度、濕度和光照,每天記錄喂料量;按常規(guī)正常免疫程序進(jìn)行免疫接種。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分參照表1。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %
1.4.1 生長性能測定
試驗(yàn)期內(nèi)每日觀察朝鮮鵪鶉的行為和精神狀況,記錄和解剖死亡鵪鶉;以重復(fù)為單位,準(zhǔn)確記錄正式期內(nèi)每周每個重復(fù)的給料量和剩余量,分別于試驗(yàn)第7、14、21和35天早晨稱朝鮮鵪鶉空腹體重,根據(jù)耗料量和體重,統(tǒng)計每周平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。公式如下:
平均日采食量(ADFI)=試驗(yàn)期采食量/試驗(yàn)天數(shù)
平均日增重(ADG)=(試驗(yàn)?zāi)w重-試驗(yàn)初體重)/試驗(yàn)天數(shù)
料重比(F/G)=日采食量/日增重
1.4.2 血清和組織器官采集
試驗(yàn)第21天和35天,以重復(fù)為單位,每個重復(fù)隨機(jī)抽取8只朝鮮鵪鶉,每組共計32只,記錄活體體重,采取頸靜脈采血方式收集血液。室溫靜置2 h后,3 500 r/min離心10 min,分離和分裝血清,用于抗體、細(xì)胞因子和抗氧化指標(biāo)的測定;之后按照常規(guī)方式進(jìn)行解剖,采集鵪鶉免疫器官(胸腺、脾臟和法氏囊)用于免疫器官指數(shù)測定;分離各段小腸,測定各段腸道的長度和重量;試驗(yàn)第35天,采集每組8只朝鮮鵪鶉的2 cm左右的空腸腸段用于制作石蠟切片[9]。
1.4.3 免疫功能測定
1.4.3.1 免疫器官指數(shù)計算
免疫器官指數(shù)(g/kg)=器官重量(g)/體重(kg)。
1.4.3.2 血清新城疫抗體效價
通過血凝-血凝抑制(HA-HI)試驗(yàn)測定朝鮮鵪鶉血清新城疫抗體效價。
1.4.3.3 血清細(xì)胞因子含量測定
采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELASA)測定各重復(fù)朝鮮鵪鶉血清中白細(xì)胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)含量,試驗(yàn)步驟嚴(yán)格南京建成試劑盒按照說明書執(zhí)行。
1.4.4 血清抗氧化指標(biāo)測定
按照試劑盒步驟說明,采用黃嘌呤氧化酶法測定朝鮮鵪鶉血清中總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、采用FRAP法測定總抗氧化能力(T-AOC)、采用TBA法測定丙二醛(MDA)含量[10]。
1.4.5 腸道發(fā)育
1.4.5.1 腸道長度和重量測定
常規(guī)方式解剖后,分離各段小腸,測量各段小腸長度和重量。
1.4.5.2 空腸形態(tài)學(xué)觀察
用4%甲醛溶液中固定空腸組織,固定完成之后進(jìn)行不同濃度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色和中性樹脂封片等操作,在熒光顯微鏡下觀察空腸組織形態(tài),拍照記錄,測量空腸隱窩深度和絨毛高度,計算腸絨毛高度與隱窩深度的比值(V/C)[11]。
1.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
原始數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010軟件統(tǒng)計整理,然后采用SPSS 19.0軟件的ANOVA單因素方差統(tǒng)計分析,用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行多重比較,P<0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。
基礎(chǔ)飼糧添加抗菌肽對鵪鶉生長性能的影響見表2。由表2可知,7~14 d,所有抗菌肽試驗(yàn)組ADFI相較于對照組無顯著變化趨勢(P>0.05);抗菌肽Ⅰ組、抗菌肽Ⅲ組ADG顯著高于對照組和抗菌肽Ⅱ組(P<0.05);抗菌肽Ⅰ組、抗菌肽Ⅲ組F/G顯著低于對照組和抗菌肽Ⅱ組(P<0.05)。14~21 d,抗菌肽Ⅰ組、抗菌肽Ⅱ組ADFI顯著高于對照組和抗菌肽Ⅲ組(P<0.05);抗菌肽Ⅱ組ADG顯著高于抗菌肽Ⅰ組(P<0.05);抗菌肽Ⅱ組、抗菌肽Ⅲ組和對照組F/G顯著低于抗菌肽Ⅰ組(P<0.05)。21~28 d,與對照組和抗菌肽Ⅰ組相比,抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組ADFI和ADG都顯著升高(P<0.05),而各組料重比無顯著變化(P>0.05)。28~35 d,抗菌肽Ⅰ組ADFI顯著高于對照組、抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組(P<0.05);抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組ADG顯著高于對照組(P<0.05);與對照組和抗菌肽Ⅰ組相比,抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組F/G顯著降低(P<0.05)。7~35 d整個試驗(yàn)階段,在ADFI方面,與對照組相比,所有試驗(yàn)組均有上升趨勢,但差異不顯著(P>0.05);在ADG方面,抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組顯著高于對照組和抗菌肽Ⅰ組(P<0.05);在F/G方面,抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組顯著低于對照組和抗菌肽Ⅰ組(P<0.05)。結(jié)果表明,隨著抗菌肽添加量的增加,鵪鶉生長性能也逐步提高,但0.2%、0.4%抗菌肽添加量無顯著差異(P>0.05)。
表2 抗菌肽對鵪鶉生長性能的影響Table 2 Effects of antimicrobial peptide on growth performance of quails
基礎(chǔ)飼糧添加抗菌肽對鵪鶉免疫機(jī)能的影響見表3。由表3可知,21 d,所有抗菌肽試驗(yàn)組的法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)與對照組相比無顯著差異(P>0.05);而抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組血清新城疫抗體效價水平顯著高于對照組(P<0.05);抗菌肽Ⅲ組胸腺指數(shù)顯著高于對照組和抗菌肽Ⅰ組(P<0.05)。35 d,抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組血清新城疫抗體效價水平和胸腺指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05);抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組脾臟指數(shù)顯著高于對照組和抗菌肽Ⅰ組(P<0.05)。
表3 抗菌肽對鵪鶉免疫機(jī)能的影響Table 3 Effects of antimicrobial peptide on immune function of quails g·kg-1
基礎(chǔ)飼糧添加抗菌肽對鵪鶉血清細(xì)胞因子的影響見表4。由表4可知,與對照組相比,不同濃度抗菌肽的添加對21 d鵪鶉血清IL-2和IFN-γ含量無顯著影響(P>0.05)。35 d,抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組鵪鶉血清IL-2和IFN-γ含量均顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明,隨著抗菌肽添加量的增加,鵪鶉的免疫機(jī)能也逐步提高,但0.2%、0.4%抗菌肽添加量無顯著差異。
表4 抗菌肽對鵪鶉血清細(xì)胞因子的影響Table 4 Effects of antimicrobial peptide on cytokine contents in serum of quails ng/L
基礎(chǔ)飼糧添加抗菌肽對鵪鶉血清抗氧化指標(biāo)的影響見表5。21 d,與對照組相比,添加抗菌肽的所有試驗(yàn)組血清T-SOD和T-AOC均顯著升高(P<0.05),其中抗菌肽Ⅲ組T-AOC顯著高于抗菌肽Ⅰ組、抗菌肽Ⅱ組;抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組血清MDA含量顯著低于對照組和抗菌肽Ⅰ組(P<0.05)。35 d,所有抗菌肽試驗(yàn)組血清T-SOD和T-AOC均顯著高于對照組(P<0.05),其中抗菌肽Ⅲ組T-SOD和T-AOC均顯著高于抗菌肽Ⅰ組和抗菌肽Ⅱ組;所有抗菌肽試驗(yàn)組MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明,隨著抗菌肽添加量的增加,鵪鶉的抗氧化能力也逐步提高。
表5 抗菌肽對鵪鶉血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of antimicrobial peptide on serum antioxidant indexes of quails
基礎(chǔ)飼糧添加抗菌肽對鵪鶉腸道發(fā)育的影響見表6。21 d,在空腸長度和重量方面,抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組顯著高于對照組和抗菌肽Ⅰ組(P<0.05);在回腸長度和重量方面,抗菌肽Ⅲ組回腸長度顯著高于對照組、抗菌肽Ⅰ組和抗菌肽Ⅱ組(P<0.05),抗菌肽Ⅰ組和抗菌肽Ⅲ組回腸重量顯著高于對照組和抗菌肽Ⅱ組(P<0.05)。35 d,抗菌肽Ⅲ組十二指腸重量顯著高于抗菌肽Ⅰ組(P<0.05);抗菌肽Ⅱ組和抗菌肽Ⅲ組空腸重量顯著高于對照組(P<0.05)。
表6 抗菌肽對鵪鶉腸道發(fā)育的影響Table 6 Effects of antimicrobial peptide on intestinal development of quails
基礎(chǔ)飼糧添加抗菌肽對鵪鶉空腸形態(tài)的影響見表7。在空腸絨毛高度方面,添加抗菌肽的所有試驗(yàn)組都顯著高于對照組(P<0.05);抗菌肽Ⅰ組、抗菌肽Ⅱ組空腸隱窩深度顯著高于對照組和抗菌肽Ⅲ組(P<0.05);與對照組相比,基礎(chǔ)飼糧添加抗菌肽對35 d鵪鶉空腸絨毛高度/隱窩深度無顯著影響(P>0.05)。結(jié)果表明,隨著抗菌肽添加量的增加,鵪鶉的腸道發(fā)育逐步提高,但0.2%、0.4%抗菌肽添加量無顯著差異。
表7 抗菌肽對鵪鶉空腸形態(tài)的影響Table 7 Effects of antimicrobial peptide on jejunal morphology of quails
動物生長狀況和腸道健康息息相關(guān),目前一些飼料添加物的使用促進(jìn)動物機(jī)體腸道微生物平衡,如抗菌肽在動物生長性能方面的影響已有了一定的研究,Xie Z.等[12]發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加抗菌肽能提高肉雞飼料轉(zhuǎn)化率、存活率和降低料重比。添加的重組抗菌肽可富集于雞的小腸中,促進(jìn)雞腸道發(fā)育和促進(jìn)養(yǎng)分的吸收,降低料重比[13]。本試驗(yàn)表明,與對照組相比,不同濃度抗菌肽的添加在所有時間段均能增加鵪鶉平均日增重,降低料重比,提高生長性能,其中添加0.2%抗菌肽組效果最好。田志梅等[14]研究發(fā)現(xiàn),抗菌肽是具有廣譜抑菌活性的肽類物質(zhì),一方面主要通過與細(xì)菌細(xì)胞膜上受體特異性結(jié)合,膜內(nèi)外滲透壓發(fā)生紊亂,使其細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的物理屏障遭到破壞;另一方面通過正負(fù)電荷相互吸引作用,改變細(xì)菌鞭毛的動力學(xué)特性,從而抑制細(xì)菌生長代謝,在畜禽養(yǎng)殖上有一定的應(yīng)用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)飼糧中添加抗菌肽提高了鵪鶉生長性能,可能是由于抗菌肽的攝入,誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞膜通透性改變來防止與上皮表面潛在病原微生物的相互作用和入侵,從而促進(jìn)腸道黏膜良好發(fā)育,增強(qiáng)腸道物理和化學(xué)屏障功能,從而提高消化吸收養(yǎng)分的能力。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),飼料中添加0.2%抗菌肽和0.4%抗菌肽均能顯著提高朝鮮鵪鶉生長性能,且兩組在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異,考慮到成本,故0.2%抗菌肽最適宜。
免疫器官指數(shù)是評價動物機(jī)體免疫器官發(fā)育狀態(tài)及機(jī)體免疫功能強(qiáng)弱的指標(biāo)之一,在一定范圍內(nèi)免疫器官發(fā)育良好,免疫功能強(qiáng),抵御外來微生物能力越強(qiáng),機(jī)體自身能更好地維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),能高效進(jìn)行機(jī)體各項(xiàng)生理活動,提高機(jī)體免疫力,就是提高機(jī)體抗病力[15]。本試驗(yàn)中,與對照組相比,基礎(chǔ)飼糧中添加抗菌肽有提高免疫器官指數(shù)的趨勢,其中在正常范圍內(nèi),0.4%抗菌肽組能顯著提高35 d鵪鶉的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù),表明抗菌肽在一定范圍內(nèi)能夠刺激免疫細(xì)胞,促進(jìn)免疫細(xì)胞、組織的生長發(fā)育,進(jìn)而促進(jìn)鵪鶉免疫器官的良好發(fā)育,具體的機(jī)制還有待研究。呂尊周等[16]發(fā)現(xiàn)抗菌肽能通過促進(jìn)與細(xì)胞因子相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯,從而促進(jìn)細(xì)胞因子的合成,促進(jìn)脾臟發(fā)育,增強(qiáng)機(jī)體自身免疫力。李金蓮[17]發(fā)現(xiàn)抗菌肽可以提高肉仔雞的免疫功能,主要是通過促進(jìn)肉仔雞免疫器官發(fā)育,提高新城疫疫苗免疫后的抗體效價實(shí)現(xiàn)的。本試驗(yàn)中,0.2%抗菌肽組朝鮮鵪鶉血清中新城疫抗體效價水平顯著高于對照組,表明抗菌肽能夠促進(jìn)免疫球蛋白的合成和增加其活性,提高鵪鶉的抗病力,與上述報道一致。
細(xì)胞因子存在于體液中,是機(jī)體免疫細(xì)胞或組織合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白,在機(jī)體抵御異物入侵,啟動免疫應(yīng)答,維持穩(wěn)態(tài)過程中十分重要[18]。復(fù)合抗菌肽能提高斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量,減緩斷奶應(yīng)激,抵御病原微生物入侵[19]??咕哪芡ㄟ^P38通路刺激Th17細(xì)胞表達(dá)CD73核苷酸外切酶,同時誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,為癌癥免疫治療提供新思路[20]。本試驗(yàn)中,與對照組相比,試驗(yàn)組抗菌肽Ⅱ組、抗菌肽Ⅲ組血清中細(xì)胞因子含量顯著升高,表明抗菌肽能夠在一定范圍內(nèi)增加鵪鶉機(jī)體細(xì)胞因子的含量,增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫,抵御病原微生物,此研究發(fā)現(xiàn)和前人類似。但受到抗菌肽來源差異、動物品種不同以及飼養(yǎng)管理差異,所以文獻(xiàn)中抗菌肽的添加劑量存在差異,本試驗(yàn)中,0.2%抗菌肽添加量最適宜。
機(jī)體抗氧化能力與健康密切相關(guān),機(jī)體氧化與抗氧化水平一般維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài),當(dāng)這種狀態(tài)被破壞時,過量自由基的釋放會干擾核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯,導(dǎo)致抗氧化酶活性降低,造成氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷,影響生物體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定性[18]。T-AOC、SOD和MDA是衡量機(jī)體抗氧化和清除自由基的能力[21]。本次試驗(yàn)中,與對照組相比,所有抗菌肽組血清T-SOD活性和T-AOC含量均顯著升高,血清MDA含量顯著降低,與前人研究結(jié)果類似,說明抗菌肽能夠平衡鵪鶉體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)動態(tài)變化,緩解氧化應(yīng)激,保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整,提高鵪鶉的抗應(yīng)激能力。楊海濤[22]發(fā)現(xiàn)與抗生素相比,抗菌肽能顯著提高肉雞血清內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的活性。孫全友等[23]發(fā)現(xiàn)在肉仔雞飼糧中單獨(dú)或聯(lián)合添加抗菌肽或姜黃素時能及時清除活性氧,緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激,促進(jìn)自身穩(wěn)態(tài)恢復(fù)。
完整的小腸結(jié)構(gòu)和功能是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收過程的基礎(chǔ),各腸段長度和重量反映了腸段的生長發(fā)育程度,而發(fā)育程度又能反映消化吸收的功能[24]。本試驗(yàn)中,與對照組相比,0.2%抗菌肽組和0.4%抗菌肽組空腸長度和重量顯著增加;其中0.4%抗菌肽組回腸長度和回腸重量也顯著高于對照組,抗菌肽能夠富集于空腸和回腸中,促進(jìn)鵪鶉腸道上皮黏膜健康發(fā)育和腸道物理屏障的完整性。
腸道絨毛高度、隱窩深度是衡量腸道健康和消化吸收能力的重要指標(biāo)之一,絨毛高度越高,表明上皮成熟細(xì)胞越多吸收越強(qiáng);隱窩深度越淺表示成熟細(xì)胞生成增加;二者的比值反映小腸消化吸收功能,比值升高,表明黏膜發(fā)育良好,消化吸收能力強(qiáng)[25]。Hu F.等[26]發(fā)現(xiàn)豬腸道抗菌肽(SGAMP)能在熱應(yīng)激下減輕肉雞腸道損傷、維持正常腸道物理、化學(xué)屏障,從而緩解熱應(yīng)激對肉雞的生長抑制。在肉仔雞飲用水或基礎(chǔ)飼糧中添加豬源抗菌肽PABP可影響腸道堿性磷酸酶AKP活性和表觀能量效率,從而增加絨毛高度和黏膜厚度,促進(jìn)腸道發(fā)育,提高對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率[27]。Liu T.等[28]發(fā)現(xiàn)兔圓小囊抗菌肽可通過顯著提高雛雞十二指腸和空腸的腸絨毛高度,促進(jìn)雛雞腸道物理屏障的完整性。本實(shí)驗(yàn)中,與對照組相比,添加抗菌肽使鵪鶉空腸絨毛高度顯著升高,促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的生成和成熟,進(jìn)而促進(jìn)腸道發(fā)育,與前人研究結(jié)果相似。
在飼料中添加抗菌肽可顯著提高鵪鶉生長性能、免疫功能、血清抗氧化功能和腸道發(fā)育,其中以0.2%抗菌肽效果最佳。