王 影，文 亮，母 童，馮小芳，劉佳敏，張 娟，溫 萬，顧亞玲*

(1.寧夏大學農(nóng)學院，銀川 750021；2.寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，銀川 750000；3.寧夏畜牧工作站，銀川 750001)

乳腺是哺乳動物特有的器官，其內(nèi)部具有大量能夠泌乳的腺泡。腺泡外圍排列著單層乳腺上皮細胞(mammary epithelial cells, MECs)，腺泡腔位于腺泡中央，主要負責將營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳汁。乳汁中的成分包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、維生素、礦物質(zhì)和生物活性因子等，在生產(chǎn)上主要提供犢牛生長所需營養(yǎng)物質(zhì)和抗體。其中，乳脂肪是牛乳中能量的攜帶者，主要有兩個來源：分別為脂肪酸的從頭合成和血液中長鏈脂肪酸的攝取。研究表明，牛乳中的各項成分受遺傳、地理位置、生活環(huán)境、哺乳期和營養(yǎng)水平等諸多因素影響，其中乳脂的變化受營養(yǎng)水平調(diào)控影響最為顯著。且牛乳對人類及動物都是非常重要的營養(yǎng)來源，人類對于牛乳的脂肪及蛋白具有特殊需求，因此，對乳脂合成的研究在奶牛育種改良過程中仍然是重中之重。

繼1999年Nicholson等提出“metabonomics”的概念后，代謝組學逐漸應用于人類、動物、植物的生理學、遺傳學、藥物研究以及疾病機理等多個相關(guān)領(lǐng)域的小分子代謝物測定。代謝組學可以通過對代謝產(chǎn)物的分析來確定外源刺激因素對機體的影響，代謝物作為基因與物體表觀之間的橋梁，可以更加直觀地揭示所研究基因的功能。Sundekilde 等通過對牛乳的代謝物和體細胞數(shù)(somatic cell count，SCC)進行研究，發(fā)現(xiàn)牛乳SCC升高時，代謝物乳酸、丁酸、異亮氨酸、乙酸和β-羥丁酸增加，馬尿酸和富馬酸減少，這些代謝物可作為牛乳質(zhì)量鑒定的潛在標志物，也可進一步用于乳房炎的診斷。侯昆在牛乳中添加青蒿素，研究牛乳代謝及調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)青蒿素可能通過抑制磷脂酰膽堿和溶血磷脂含量的增加，顯著下調(diào)α-亞麻酸代謝、亞油酸代謝和甘油磷脂的代謝通路，進而影響奶牛乳腺中脂質(zhì)代謝。付力立對圍產(chǎn)前期奶牛補飼酵母硒，發(fā)現(xiàn)有97種顯著差異代謝物存在于初乳與常乳中，且從初乳過渡到牛乳時，代謝物的變化可以改變犢牛對氨基酸、促氮代謝物及能量的獲取。

目前，我國荷斯坦牛乳中乳脂指標仍未達到人類機體需求的含量，且代謝組學對牛乳不同乳脂水平研究報道較少。因此本研究篩選出乳脂率具有極端差異的荷斯坦奶牛各13頭，收集乳樣進行代謝組學分析，篩選顯著差異代謝物及高乳脂潛在標志性差異代謝物，為研究奶牛泌乳過程提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物和樣品采集 新鮮牛乳樣品采自寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)茂盛牧場，試驗牛飼喂相同的平衡全混合日糧(表1)。選擇體重與月齡相近，處于泌乳中后期(180～210 d)的第一胎次荷斯坦牛245頭。采集每頭奶牛早、中、晚(4∶3∶3混合)3個班次的乳樣于50 mL專用集奶杯中(另外將所有奶樣再分裝一份至1.8 mL凍存管中，液氮速冷30 s，儲存于-80 ℃冰箱用于代謝組測序)，隨即送往吳忠農(nóng)牧局進行奶牛生產(chǎn)性能測定(dairy herd improvement，DHI)，篩選體細胞數(shù)在20萬個·mL以內(nèi)，乳脂率在4.4%以上和3.0%以下的奶牛各13頭。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.1.2 主要儀器和試劑 儀器采用德國Thermo Fisher公司的Vanquish UHPLC系統(tǒng)與德國Thermo Fisher公司的Orbitrap Q ExactiveHF質(zhì)譜聯(lián)用儀。甲醇、甲酸、醋酸銨均為LC-MS Grade純度(美國Thermo Fisher公司)，水(德國Merck公司)。

1.1.3 牛乳樣品處理 將牛乳樣品從-80 ℃冰箱取出，置于室溫條件下進行解凍，解凍后的樣品取其100 μL置于極壓管中，加入400 μL的80%甲醇水溶液0.1%甲酸預冷重懸；渦旋震蕩后，冰浴靜置5 min，15 000×、4 ℃離心20 min；去除上層乳脂，取一定量的上清加質(zhì)譜級水稀釋至甲醇含量為53%；移至新的Eppendorf管中，15 000×、4 ℃離心20 min，最后取上清液進行后續(xù)分析。

1.2 方法

1.2.1 UHPLC-MS條件確定、UPLC色譜條件與質(zhì)譜條件 采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UHPLC-MS)對樣品進行代謝組學分析，該方法具有更高效和超高的分離度、速度和靈敏度。同時也具有一定的高分辨率和高選擇優(yōu)勢，能夠得到精準的質(zhì)譜圖和相對分子量。本研究使用Vanquish UHPLC系統(tǒng)與Orbitrap Q ExactiveTM HF質(zhì)譜聯(lián)用儀對兩組奶樣進行代謝組學分析。UHPLC-MS分析：1 μL樣品在Hypesil Goldcolumn(C18)色譜柱上(100×2.1 mm, 1.9 μm)。正極性模式的洗脫液為洗脫液A(0.1% FA在水中)和洗脫液B(甲醇)。負極性模式洗脫液為洗脫液A(5 mol·L乙酸銨，pH 9.0)和洗脫液B(甲醇)。Q ExactiveHF質(zhì)譜儀采用正/負極性模式，噴霧電壓3.2 kV，毛細管溫度320 ℃，鞘氣流量40 arb, aux氣流量10 arb。質(zhì)譜條件：Orbitrap Q ExactiveTM HF質(zhì)譜儀采用 ESI掃描模式，質(zhì)荷比掃描范圍為：100～1 500 m·z；Spray Voltage: 3.2 kV; Sheath gas flow rate: 40 arb; Aux Gasflow rate: 10 arb; Capillary Temp:320 ℃；Polarity: positive; negative; MS/MS 二級掃描為data-dependent scans。乳樣的色譜梯度洗脫程序見表2。

表2 乳樣的色譜梯度洗脫程序

1.2.2 代謝組數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析處理 UHPLC-MS生成的原始數(shù)據(jù)(.raw)文件導入Discoverer 3.1(CD3.1, Thermo Fisher)搜庫軟件進行處理，對每個代謝物進行峰校準、峰采集和定量。然后，將峰值強度歸一化為總光譜強度。利用歸一化后的數(shù)據(jù)，根據(jù)加性離子、分子離子峰和碎片離子對分子式進行預測。將峰值與mzCloud(https://www.mzcloud.org/)、mzVault和MassList數(shù)據(jù)庫進行匹配比對，得到準確的定性和相對定量結(jié)果。使用統(tǒng)計軟件R 3.4.3、Python 2.7.6和CentOS 6.6進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 HF與LF組差異代謝物的篩選分析 使用代謝組學數(shù)據(jù)處理軟件metaX進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。采用單因素分析(-test)計算統(tǒng)計顯著性(-value)。根據(jù)(O)PLS-DA模型變量的變量權(quán)重值(variable importance for the projection，VIP)輔助篩選標志代謝物。選擇VIP>1，<0.05，F(xiàn)C≥2或FC≤0.5的代謝物作為差異代謝物。受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線能夠進一步考察差異代謝物對高、低乳脂組樣品的辨別能力，依據(jù)ROC曲線下的面積(area under curve，AUC)判斷差異代謝物的識別能力。根據(jù)所獲得的代謝物通過KEGG(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、HMDB((https://hmdb.ca/metabolites)以及LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫(http://www.lipidmaps.org/)進行注釋和代謝產(chǎn)物途徑分析。

2 結(jié) 果

2.1 乳樣UHPLC-MS的代謝組學質(zhì)譜圖分析

采用UHPLC-MS代謝組學技術(shù)檢測HF和LF組荷斯坦奶牛的差異代謝物，將正、負離子檢測模式下的QC樣本質(zhì)譜總離子流圖(total ion chromatography，TIC)進行疊加，獲得TIC重疊圖(圖1)，圖譜可以觀察到各譜峰的響應強度和保留時間基本重疊且基線穩(wěn)定，說明試驗過程中的數(shù)據(jù)可靠。

A、B.分別為HF組正、負離子模式下TIC重疊圖譜；C、D.分別為LF組正、負離子模式下TIC重疊圖譜

2.2 HF與LF組奶樣代謝輪廓模式識別

使用監(jiān)督的偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)，對數(shù)據(jù)進行分析來評估組間樣本差異，在正離子模式下，PLS-DA得分圖RY=0.88、QY=0.46(圖2A)；在負離子模式下PLS-DA得分圖RY=0.89、QY=0.43(圖2B)，此模型RY均高于0.5，QY值介于0.4～0.5，表明此模型的解釋率高，預測能力可接受。進一步對正、負離子模式數(shù)據(jù)PLS-DA模型進行置換檢驗，可知，在正離子模式下Q截距=-0.52(QIntercept<0)(圖2C)，負離子模式下Q截距=-0.53(QIntercept<0)(圖2D)，表明PLS-DA模型未過度擬合，說明LF組與HF組奶樣代謝物存在差異。

A、B.分別為正、負離子模式下PLS-DA得分圖；C、D.分別為正、負離子模式下PLS-DA置換檢驗圖

2.3 差異代謝物的篩選

本研究共注釋到343種代謝產(chǎn)物，其中正離子模式下228種，負離子模式下對115種。將PLS-DA的VIP值(VIP>1)和單變量統(tǒng)計分析(<0.05)作為顯著性差異代謝物的標準，共篩選出60種顯著差異代謝物，其中正離子模式下有41種(表3)，負離子模式下有19種(表4)。

表3 LC-MS鑒定牛乳高、低水平乳脂顯著差異代謝物(正離子模式)

表4 LC-MS/MS鑒定牛乳高、低水平乳脂潛在標志代謝物(負離子模式)

運用Python-3.5.0與R-3.4.3軟件對正、負離子模式下60種顯著差異代謝物進行聚類和富集分析，由聚類熱圖可知(圖3A、B)，HF和LF組數(shù)據(jù)分別能夠很好的聚集在一起，說明試驗樣本組內(nèi)無明顯差異，且相似代謝物聚集效果良好。KEGG富集分析圖(圖3C、D)顯示，代謝物主要富集在?；撬岷蛠喤；撬岽x、類固醇激素生物合成、卵巢類固醇生成、氨基酰-tRNA生物合成、代謝途徑和膽汁分泌途徑。

A、B.分別為正、負離子模式下聚類熱圖；C、D.分別為正、負離子模式下KEGG富集氣泡圖

根據(jù)<0.5且FC>2.0及<0.5且FC<0.5可知，HF組奶樣中有15種代謝物含量高于LF組，有6種代謝物含量低于LF組。為進一步篩選標志性差異代謝物，通過ROC曲線評判潛在的生物標記物，對60個顯著差異代謝物進行分類識別能力考察。AUC為ROC曲線下方的面積，AUC值越接近于1，預測準確性越高。AUC值為0.5～0.8時，模型具有預測價值，但預測準確性較低；AUC值為0.8～0.9時，有一定預測準確性，此時代謝物是識別兩組樣品的主要指標；AUC值為0.9及以上時，有較高預測準確性，識別效果非常好。本試驗篩選出AUC>0.8的差異代謝物共18種，其正離子模式下12種(圖4A)：DL-2-(乙酰氨基)-3-苯基丙酸(DL-2-(acetylamino)-3-phenylpropanoic acid)、PC(14:0e/9:0)、1-甲基鳥嘌呤(1-methylguanine)、月桂酸甘油酯(Monolaurin)、乙基-1-(3-硝基-2-噻吩基)哌啶-4-羧酸乙酯(ethyl 1-(3-nitro-2-thienyl)piperidine-4-carboxylate)、N-苯乙酰谷氨酰胺(N-phenylacetylglutamine)、麥芽糖醇(Maltol)、5,6-二羥基吲哚-2-羧酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid)、5-甲基-DL-色氨酸(5-methyl-dl-tryptophan)、Lysopa 16:0、表睪酮(Epitestosterone)、5-羥基吲哚-3-乙酸(5-hydroxyindole-3-acetic acid)。負離子模式下6種(圖4B)：PA(16:0/18:3)、δ-生育酚(delta-tocopherol)、膽酸(Cholic acid)、L-組氨酸(L-histidine)、皮質(zhì)醇(Hydrocortisone)、N-油酰甘氨酸(N-oleoyl glycine)。其中 AUC>0.85的差異代謝物有4種：N-油酰甘氨酸、皮質(zhì)醇、δ-生育酚、PC(14:0e/9:0)。

A、B.分別為正、負離子模式下ROC曲線圖

3 討 論

荷斯坦牛乳是目前市場覆蓋面積最廣、種類最多的乳制品，乳脂作為其主要成分，是人類食物營養(yǎng)的重要來源。目前國內(nèi)荷斯坦牛乳脂含量約為3.6%(低于娟姍牛5.2%)，因此對荷斯坦牛乳脂進行研究是非常有必要的。代謝組學作為近年來分子生物學領(lǐng)域代謝物分析的強有力工具，具有高度準確的預測和判斷能力，目前應用于多個相關(guān)領(lǐng)域的小分子代謝物測定。對于不同品種的乳汁而言，丹麥Sundekilde 等運用NMR技術(shù)對荷斯坦牛和娟姍牛的牛乳進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)肉堿、膽堿和檸檬酸鹽可作為區(qū)分荷斯坦牛與娟姍牛的標志代謝物。Yang等進一步對中國荷斯坦奶牛、娟姍牛、牦牛、水牛、山羊、駱駝和馬的乳代謝研究發(fā)現(xiàn)，差異代謝物膽堿和琥珀酸可區(qū)分荷斯坦牛和其它產(chǎn)乳動物的乳制品。

本研究通過代謝組揭示乳脂率具有極端差異的牛乳潛在標志性差異代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異代謝物N-油酰甘氨酸、皮質(zhì)醇、δ-生育酚、PC(14:0e/9:0)在HF中上調(diào)，PA(16:0/16:0)、LPS 21:0、PA(16:0/18:3)、N-甲酰基犬尿氨酸、HexCer-NS(d16:1/23:0)在HF中下調(diào)。Chaturvedi等研究表明，N-油酰甘氨酸具有獨立轉(zhuǎn)化為油酰胺的生物活性，且Arafat等于1989年就發(fā)現(xiàn)油酰胺是正常人血清中存在的5種主要脂肪酸酰胺之一。目前，關(guān)于油酰胺生物合成途徑存在兩種假說，其中主要的一種假說認為肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶(recombinant peptidylglycine alpha amidating monooxygenase, PAM)是油酰胺生物合成介質(zhì)，而Merkler等證明PAM能夠催化初級脂肪酸的形成，脂肪酸和甘油進一步組成三酰甘油酯，本試驗發(fā)現(xiàn)，N-油酰甘氨酸在高乳脂牛乳中含量更高，提示N-油酰甘氨酸能夠促進乳脂的形成。在本試驗中，HF組皮質(zhì)醇顯著高于LF組，皮質(zhì)醇是一種由哺乳動物腎上腺中的腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生的類固醇激素，屬于糖皮質(zhì)激素，又名氫化可的松，其作用主要促進碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪的新陳代謝，同時也起著抗炎作用，促進糖原、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的分解進而降低大多數(shù)身體細胞中的蛋白質(zhì)水平；皮質(zhì)醇通過促進草酰乙酸合成葡萄糖來刺激糖異生，再通過刺激肝內(nèi)糖原合成來抵消血糖增加，調(diào)節(jié)整個血液中葡萄糖含量；在人乳中發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇對母乳的中鏈和中間鏈脂肪酸有影響，這些脂肪酸可能來源于內(nèi)源性從頭合成，這表明母親的飲食中碳水化合物與脂肪的比例很高；Lee 等研究表明，糖皮質(zhì)激素參與調(diào)節(jié)脂肪代謝；Linderborg等研究表明，在富含三?；视偷闹|(zhì)中，牛奶中的皮質(zhì)醇水平比月桂酸含量高，以上研究表明皮質(zhì)醇與脂肪代謝有關(guān)。Kiyose等研究發(fā)現(xiàn)，δ-生育酚在到達肝之前被乳糜微粒結(jié)合到脂肪組織中，后在肝中進行代謝。δ-生育酚是維生素E的組成成分之一，維生素E作為一種脂溶性維生素，在動物生長發(fā)育過程中是不可或缺的，同時也是動物機體內(nèi)主要的親脂抗氧化劑，可清除脂質(zhì)過氧自由基，破壞脂質(zhì)過氧化的鏈增殖反應。有研究表明，維生素E添加在日糧中可以有效減少肉雞腹脂率、提升鵝胸肌粗脂肪率、影響豬肉大理石花紋、改善鼠脂肪含量和甘油三酯代謝、改善魚的血脂代謝及調(diào)節(jié)脂肪代謝酶活性等；Barzegar-Amini等發(fā)現(xiàn)，維生素E可以通過抑制脂肪肝的產(chǎn)生和降低肝細胞的氧化應激來調(diào)節(jié)脂蛋白水平，預防血脂異常，維生素 E 缺乏則會增加脂質(zhì)過氧化，導致磷脂周轉(zhuǎn)增加，本試驗發(fā)現(xiàn)，高乳脂率牛乳中δ-生育酚含量高于低乳脂，推測δ-生育酚對乳脂率具有一定的生理作用，但其具體機制有待進一步探究。

4 結(jié) 論

本試驗運用UHPLC-MS技術(shù)對高、低不同乳脂率牛乳進行代謝組學分析，結(jié)果共檢測到60種顯著性差異代謝物，其中N-油酰甘氨酸、皮質(zhì)醇、δ-生育酚、PC(14:0e/9:0)可作為高乳脂率牛乳潛在標志性差異代謝物。本研究結(jié)果可為奶牛乳脂代謝提供基礎(chǔ)資料。