趙學(xué)亮，王 斌，苗永強(qiáng)，趙浩宇，謝青芳，王 娟，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

陜西省是我國(guó)山羊養(yǎng)殖大省，近年來(lái)，致病性大腸桿菌(，)已成為養(yǎng)羊業(yè)主要的致病性細(xì)菌之一。致病性攜帶多種毒素導(dǎo)致人和動(dòng)物腹瀉、腦膜炎、流產(chǎn)等一系列臨床癥狀，給養(yǎng)殖業(yè)和公眾健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅。在獸醫(yī)臨床上，隨著抗生素幾十年以來(lái)的反復(fù)使用、甚至濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥問題日益嚴(yán)峻。與此同時(shí)，與動(dòng)物密切接觸的獸醫(yī)、養(yǎng)殖戶等也常常檢測(cè)到相關(guān)耐藥細(xì)菌。目前，細(xì)菌耐藥已不僅是畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)，同樣是醫(yī)學(xué)、生態(tài)等領(lǐng)域共同面臨的挑戰(zhàn)。在“one-health”背景下，人、環(huán)境及動(dòng)物形成緊密關(guān)聯(lián)的整體，耐藥基因得以在此整體環(huán)境中不斷轉(zhuǎn)移、進(jìn)化和傳播，形成錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，成為細(xì)菌耐藥性快速發(fā)展的遺傳基礎(chǔ)。

相對(duì)于其他動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性而言，羊源致病性耐藥性報(bào)道較少，而關(guān)于陜西地區(qū)的羊源耐藥性及毒力基因情況未見報(bào)道。因此，為加強(qiáng)陜西省羊源致病性耐藥性監(jiān)測(cè)，促進(jìn)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)合理用藥，保障動(dòng)物源性食品和公共衛(wèi)生安全。本研究對(duì)陜西省部分規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行致病性分離鑒定，并測(cè)定其對(duì)12種抗生素的耐藥譜、檢測(cè)11種耐藥基因以及16種毒力基因，以明確陜西省羊源致病性耐藥譜及毒力基因攜帶情況，為陜西地區(qū)今后臨床合理用藥、有效防控羊源致病性感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

肛門拭子樣品來(lái)源于陜西省西安市(15份)、寶雞市(15份)、咸陽(yáng)市(15份)和渭南市(9份)等地區(qū)10個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，54份樣品于采集后24 h內(nèi)在4 ℃條件下送至西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱和伊紅美藍(lán)等培養(yǎng)基等購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司和英國(guó)OXOID公司；12種抗生素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DL2000 Marker和2×Mix購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

本研究中所檢測(cè)的主要毒力基因：、1、、、、、、、、、、、、、1和2，引物序列參考文獻(xiàn)[5]，主要耐藥基因：1、2、3、、、、-、、、和-1，引物序列參考相關(guān)文獻(xiàn)。引物由西安擎科生物科技有限公司合成。

1.4 細(xì)菌的分離與純化

將采集的樣品分別放到10 mL的LB營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床中180 r·min過(guò)夜后，在伊紅美藍(lán)和麥康凱培養(yǎng)基相互傳代，將純化后的菌落利用16S特異性引物進(jìn)行鑒定。將鑒定、純化后的細(xì)菌保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室。

1.5 藥敏試驗(yàn)

采用96孔板瓊脂稀釋法對(duì)獸醫(yī)和人醫(yī)臨床常用抗感染的大觀霉素、慶大霉素、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻呋、氟苯尼考、磺胺異噁唑、乙酰甲喹、四環(huán)素、恩諾沙星、多黏菌素和美羅培南12種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。以ATCC 25922作為質(zhì)控菌株，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)和國(guó)家耐抗菌素監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(National antimicrobial resistance monitoring system, NARMS)推薦標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷。

1.6 耐藥基因和毒力基因檢測(cè)

挑單克隆菌落于無(wú)菌LB肉湯中200 r·min，37 ℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，取1 mL細(xì)菌培養(yǎng)液于無(wú)菌EP管內(nèi)，12 000 r·min離心3 min，棄上清液，利用細(xì)菌基因組提取試劑盒制備菌株DNA模板。其反應(yīng)體系為25 μL，其中，2×Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL，ddHO補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，根據(jù)不同的引物選擇相應(yīng)的退火溫度，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳成像，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 大腸桿菌分離鑒定及耐藥情況

54份樣品中共分離鑒定得到50株致病性，總分離率為92.6%(50/54)。12種抗生素的耐藥性結(jié)果顯示，分離株對(duì)氨芐西林、氟苯尼考和磺胺異噁唑耐藥率達(dá)90%以上，對(duì)大觀霉素、慶大霉素、頭孢噻呋、乙酰甲喹、四環(huán)素和恩諾沙星的耐藥率達(dá)60%以上，對(duì)頭孢他啶和多黏菌素B耐藥率為40%以上，未發(fā)現(xiàn)對(duì)美羅培南耐藥的菌株。

2.2 分離菌株多重耐藥情況

多重耐藥情況顯示(圖1)，在50株羊源致病性中有49株呈現(xiàn)多重耐藥，其中，對(duì)11種抗生素耐藥的菌株有14株(28%)，對(duì)9～10種抗生素耐藥的菌株有13株(26%)，對(duì)7～8種抗生素耐藥的菌株有11株(22%)，對(duì)3～6種抗生素耐藥的菌株有11株(22%)。

圖1 50 株致病性E.coli分離菌株多重耐藥情況檢測(cè)

2.3 分離株耐藥基因分布

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取50株致病性分離株基因組DNA。然后利用Nanodrop檢測(cè)DNA樣品純度和濃度。利用PCR檢測(cè)分離菌的耐藥基因，結(jié)果顯示，50株分離菌分別檢測(cè)出1～6種耐藥基因，其中，磺胺類耐藥基因2(64%)、四環(huán)素類耐藥基因(34%)、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因-(32%)檢出率較高，此外。耐藥基因1、3、、、、和-1檢出率分別為18%(9/50)、14%(7/50)、8%(4/50)、16%(8/50)、22%(11/50)、4%(2/50)和10%(5/50)，未檢出β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(圖2)。

圖2 50株致病性E.coli耐藥基因情況檢測(cè)

2.4 分離株毒力基因分布

根據(jù)攜帶毒力基因的不同可將致病性分為腸外型(extraintestinal pathogenic, EXPEC)、腸黏附型(enteroaggregative, EAEC)、腸侵襲型(enteroinvasive, EIEC)、腸毒素型(enterotoxigenic, ETEC)、腸致病型(enteropathogenic, EPEC)和腸出血型(enterohemorrhagic, EHEC)6種致病型。結(jié)果顯示，6種致病型均被檢出。毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示共檢測(cè)到11種毒力基因，其中,基因攜帶率最高，為80%(40/50)，為36%(18/50)，為32%(16/50)，為34%(14/50)，為26%(13/50)，為18%(9/50)，為18%(9/50)，為6%(3/50)，2為4%(2/50)，為2%(1/50)，為2%(1/50)，未檢測(cè)到、1、、和s1基因。50株致病性中有49株攜帶至少1種及以上的毒力基因，其中，攜帶1種毒力基因有10株，2種毒力基因14株，3種毒力基因12株，4種毒力基因9株，5種毒力基因4株。

3 討 論

致病性作為最重要的人獸共患致病菌之一，可引起人和動(dòng)物的腹瀉、腸炎等。作為條件性致病菌，可廣泛存在羊、豬、家禽腸道，并可以通過(guò)食物鏈傳播，引起人類疾病。本研究從陜西省不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)羊場(chǎng)采集54份腹瀉羊肛門拭子，共分離到50株，總分離率92.6%，高于其他報(bào)道。宋曉莉在江蘇部分地區(qū)75份腹瀉羊肛門拭子樣品分離出56株致病性，分離率為74.7%；劉晨陽(yáng)從寧夏回族自治區(qū)和青海高原牧區(qū)采集145份羊源樣品，分離出131株，寧夏回族自治區(qū)分離率為91.0%、青海高原牧區(qū)分離率為88.9%。本研究中陜西省羊源分離率較高，其原因可能是飼養(yǎng)模式、養(yǎng)殖規(guī)模和樣本數(shù)量等原因?qū)е虏煌》萘餍谐潭炔煌?/p>

世界衛(wèi)生組織曾報(bào)告，如今每年有70萬(wàn)人死于抗生素耐藥，到2050年，抗生素耐藥將會(huì)導(dǎo)致每年1000萬(wàn)人死亡，“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)引人擔(dān)憂。在后抗生素時(shí)代，耐藥性是全球最緊迫的公共衛(wèi)生問題之一。耐藥基因可通過(guò)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、插入序列共同區(qū)和噬菌體等可移動(dòng)原件進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移。當(dāng)毒力基因和耐藥基因存在同一可移動(dòng)原件上時(shí)，在抗生素的選擇壓力下，可引起基因共轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致耐藥性和致病性增強(qiáng)。本研究分離的50株羊源致病性藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，多重耐藥性和交叉耐藥性嚴(yán)重，耐藥譜復(fù)雜，除美羅培南外，對(duì)其他11種抗生素都已產(chǎn)生耐藥性。對(duì)氨芐西林、氟苯尼考和磺胺異噁唑耐藥率達(dá)90%以上，對(duì)大觀霉素、慶大霉素、頭孢噻呋、乙酰甲喹、四環(huán)素和恩諾沙星的耐藥率達(dá)60%以上，對(duì)頭孢他啶和多黏菌素B耐藥率也達(dá)40%以上，這與目前報(bào)道的多重耐藥情況一致。劉潤(rùn)春等對(duì)華東華北地區(qū)羊源多重耐藥性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)氨芐西林、利福平、克林霉素、阿莫西林、苯唑西林耐藥率都達(dá)到90%以上；劉正明等對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)108株羊源進(jìn)行13種抗菌藥物藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)阿莫西林、頭孢噻吩、磺胺甲噁唑、黏菌素的耐藥率均達(dá)100.0%。此外，首次在羊源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌發(fā)現(xiàn)-1基因。本研究與上述報(bào)道的結(jié)果均反映出多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)峻，這可能是由于抗生素的長(zhǎng)期不合理使用、甚至是濫用的結(jié)果。提示在治療和預(yù)防羊源時(shí)，應(yīng)篩選高效敏感的藥物進(jìn)行合理用藥，以提高治愈率，減少耐藥菌株的出現(xiàn)。

本研究對(duì)50株羊源致病性進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，結(jié)果顯示在16種毒力基因中共檢測(cè)到11種，總檢出率高達(dá)98%(49/50)，表明攜帶毒力因子的致病性菌株正在陜西省流行和傳播。其中基因攜帶率最高，為80%，Rehman等對(duì)青海牦牛源毒力基因調(diào)查發(fā)現(xiàn)，基因攜帶率為24.3%。另外檢測(cè)到為36%，為32%，為34%，為26%，為18%，為18%，為6%，2為4%，為2%，為2%。寧夏地區(qū)奶牛乳房炎大腸桿菌、、、、5種毒力基因的檢出率分別是20.30%、14.72%、8.12%、2.03%、1.02%。與已報(bào)道的相比，本研究分離的致病性毒力基因情況較復(fù)雜，不同毒力基因的組合可能是導(dǎo)致羊腹瀉和腸外病變的主要原因。此外，還檢測(cè)到較多的和組合，基因編碼外膜蛋白緊密素，參與黏膜細(xì)胞產(chǎn)生黏附，基因具有溶血活性、細(xì)胞毒性，能夠改變細(xì)胞膜的通透性。目前，這種毒力組合尚未見報(bào)道，還需要進(jìn)一步深入探索對(duì)宿主的致病機(jī)制。由于羊源致病性攜帶毒力基因及對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性，對(duì)病防治帶來(lái)困難，因此對(duì)其防治過(guò)程中應(yīng)注意科學(xué)用藥的同時(shí)，注意預(yù)防“超級(jí)耐藥細(xì)菌”向人的傳播。

4 結(jié) 論

陜西省羊養(yǎng)殖場(chǎng)致病性分離率較高，分離株多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，毒力基因分布廣泛，致病能力較強(qiáng)。因此，在規(guī)?；蝠B(yǎng)殖場(chǎng)，應(yīng)謹(jǐn)慎使用抗生素，尤其是氨芐西林、氟苯尼考和磺胺異噁唑，同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)羊源致病性的耐藥性及毒力基因監(jiān)測(cè)。