周琴， 謝鈺容

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

自然界中的維管植物形態(tài)各異，每株植株均具有獨(dú)特的視覺外觀和形態(tài)特征，其中分枝是植物形態(tài)建成的重要組成部分，有助于物種對環(huán)境的適應(yīng)和生存，分枝可增加植物的多樣性。分枝的模式影響植株形態(tài)的建成、光吸收的效率及對可利用資源的適應(yīng)等，在農(nóng)作物中，花、果實(shí)、種子的分枝直接影響產(chǎn)量［1］；同時，分枝還影響作物對雜草的競爭能力和害蟲的抵抗力，間接影響作物產(chǎn)量［2］。在觀賞性植物中，分枝調(diào)控植物的形態(tài)和密度，從而影響植物的觀賞性［3］。

植株形態(tài)建成分為胚胎發(fā)育時期和胚胎發(fā)育后期兩個階段，其中，胚胎發(fā)育時期由增殖細(xì)胞構(gòu)成的莖端分生組織和根端分生組織形成主要的頂端-基部生長軸，隨后發(fā)育為主莖和主根；胚胎發(fā)育后期是指植物通過形成其他分生組織來建立多個次級生長軸，衍生自周細(xì)胞的根分生組織產(chǎn)生側(cè)生根，而衍生自葉腋中的細(xì)胞的腋生分生組織產(chǎn)生分枝。

腋生分生組織的形成和活性取決于植物的基因型、內(nèi)在生長發(fā)育階段和外在的環(huán)境因子，其中外界環(huán)境包括溫度、光照時間、光照質(zhì)量、養(yǎng)分等因素［4］，此外，多種植物激素也參與了分枝調(diào)控。研究表明，植物激素生長素和細(xì)胞分裂素之間的拮抗作用可共同調(diào)節(jié)腋芽的生長［5］。近年來，一組衍生自類胡蘿卜素的倍半萜內(nèi)酯或其衍生物獨(dú)角金內(nèi)酯也在抑制分枝中具有關(guān)鍵作用［6］。研究表 明LATERAL SUPPRESSOR（LAS）編 碼1 種GRAS 蛋白［7］，REGΜLATOR OF AXILLARY MERISTEMS（RAX）編碼1 組R2R3 MYB 蛋白［8-9］，對于維持葉片基部細(xì)胞的分生能力以及起始腋生分生組織的形成必不可少。REVOLUTA/INTER-FASCICΜLAR FIBERLESS1（REV/IFL1）編碼1 種同源框亮氨酸拉鏈蛋白，也參與調(diào)控了腋生分生組織早期階段的發(fā)育［10］。當(dāng)腋生分生組織發(fā)育為腋芽后，腋芽的活性受到各種信號的調(diào)控。研究表明TCPs 轉(zhuǎn)錄因子家族中的TEOSINTE BRANCHED1（TB1）調(diào)控腋芽活性，進(jìn)而影響分枝［11］。TB1最早是在對玉米的馴化過程中根據(jù)其作用命名的，相比于野生型祖先大芻草，玉米由于組成型過表達(dá)TB1，抑制了分枝，因此，只有1根莖稈［12］。在其他物種中，也發(fā)現(xiàn)了TB1的同源基因，包括水稻中的FINECΜLM1（FC1）和擬南芥、豌豆、番茄等中的BRANCHED1（BRC1）［13-15］。

光作為植物生長發(fā)育最重要的環(huán)境因素之一，影響植物從種子萌發(fā)到衰老死亡的整個發(fā)育過程。植物利用各種光受體接收光信號，并傳遞轉(zhuǎn)化為化學(xué)能量以滿足其生長發(fā)育。研究表明，在擬南芥中有5 個光敏色素，即Phytochrome A～E（PHYA～E），其中，PHYB 參與了光照影響腋芽生長的調(diào)控過程［16］，且與野生型相比，phyB突變體的分枝顯著減少；在擬南芥中，低紅光∶遠(yuǎn)紅光（red light∶far-red light，R/FR）比率光照條件下會造成野生型分枝的減少，與phyB突變體相似。在高粱中，白光下生長的野生型植株增加FR 處理后，分枝表型也顯著減少，與phyB-1突變體相似［17］。說明PHYB 能夠感應(yīng)R/FR，并在高R/FR條件下促進(jìn)分枝的發(fā)生［18］。

HY5 在擬南芥光敏色素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，HY5 參與調(diào)控葉綠素和花青素合成、主根和側(cè)根發(fā)育、開花時間、遮蔭、高溫響應(yīng)等過程［19-20］，但其是否參與分枝調(diào)控尚鮮見報道。本研究以模式植物擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，通過觀察HY5-GFP 過表達(dá)植株和hy5突變體的分枝數(shù)目表型，從而探究光信號因子HY5 對分枝的調(diào)控及其分子機(jī)理，以期為培育分枝適當(dāng)?shù)睦硐胫晷妥魑锾峁├碚摶A(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 擬南芥野生型種子Col-0和hy5突變體hy5-215由本實(shí)驗(yàn)保存，擬南芥hy5-10（SALK_096651）為從諾丁漢擬南芥儲存中心（Nottingham Arabidopsis Stock Centre，NASC）購買的T-DNA 插入突變體。所有野生型和突變體材料均培養(yǎng)于23 ℃，有效光照強(qiáng)度（photosynthetically active radiation，PAR）100 μmol·m?2·s?1，16 h 光照/8 h 黑暗的人工氣候培養(yǎng)室中，用于后續(xù)DNA和RNA的提取、表型觀察和數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 快速質(zhì)粒小提試劑盒（DP105-03）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（KR106-02）、通用型DNA純化回收試劑盒（DP214-03）、熒光定量試劑盒（FP205-02）均購于天根生化科技（北京）有限公司；Trizol試劑盒購于賽默飛世爾試劑公司；限制性內(nèi)切酶購 于TaKaRa 與NEB 公 司；In-fusion HD Cloning Kit 購于Clontech 公司；KOD Fx PCR 擴(kuò)增酶購于東洋紡公司（TOYOBO）；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)和農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)由本實(shí)驗(yàn)室保存；pEGAD載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材 s1-802型真空泵購于林貝爾儀器制造有限公司；EOS 6OD 型單反相機(jī)購于佳能公司；TC-XP 型PCR 儀購于廣州博日科技公司；Quant Studio3實(shí)時定量PCR 儀購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）；Tanon-100 一體化凝膠成像系統(tǒng)購于上海天能公司；NANO DROP 2000C 購于Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1HY5-GFP過表達(dá)株系的構(gòu)建 采用Trizol法提取野生型擬南芥的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，使用HY5基因特異性引物（表1）擴(kuò)增HY5基因的編碼區(qū)序列，并連接至pEGAD 載體上（圖1）。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0，并通過載體上的潮霉素（Hyg）進(jìn)行抗性篩選，得到單拷貝的HY5-GFP過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table1 Primers used in the experiment

圖1HY5-GFP過表達(dá)載體Fig.1 Vector ofHY5-GFP

1.2.2HY5-GFP過表達(dá)株系GFP 熒光檢測 為檢測轉(zhuǎn)基因純合株系的真實(shí)性，利用載體上的GFP標(biāo)簽進(jìn)行鑒定。將種子在1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d，剪取幼苗的根部在熒光顯微鏡下觀察，利用GFP激發(fā)光檢測GFP蛋白是否表達(dá)。

1.2.3HY5-GFP過表達(dá)株系中HY5mRNA水平檢測 采用Trizol 法提取HY5-GFP過表達(dá)株系的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，PP2A為內(nèi)參基因，使用HY5基因特異性引物，通過RTPCR 對過表達(dá)株系的HY5基因進(jìn)行表達(dá)量檢測（表1）。

1.2.4hy5-215突變體鑒定 實(shí)驗(yàn)室保存hy5-215種子，hy5-215突變體為HY5基因組第1 個內(nèi)含子最后1 個堿基突變，從而干擾RNA 的剪切拼裝，下調(diào)mRNA 的轉(zhuǎn)錄。剪取hy5-215突變體幼嫩葉片提取DNA，用特異引物（表1）PCR 擴(kuò)增相應(yīng)區(qū)段后進(jìn)行測序，將測序結(jié)果用DNAMAN 進(jìn)行比對。

1.2.5hy5-10突變體的鑒定 從NASC 購買T DNA 插入突變體Salk_096651 并命名為hy5-10。根據(jù)T-DNA 插入突變鑒定原理，提取hy5-10的DNA，并設(shè)計特異性引物L(fēng)P/RP 和LB（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

1.2.6 各株系分枝表型觀察 在人工氣候室培養(yǎng)Col-0（野生型）、HY5-GFP和hy5株系，30 d 后觀察分枝數(shù)目，采用EOS 6OD 型佳能單反相機(jī)收集表型，并統(tǒng)計蓮座葉分枝數(shù)目，每個株系至少15株，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.7BRC1的mRNA水平檢測 采用Trizol法提取野生型、HY5-GFP和hy5株系的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA 為模板，PP2A為內(nèi)參基因，使用BRC1基因特異性引物（表1），通過RTPCR 方法對3 個株系的BRC1基因的mRNA 水平進(jìn)行檢測。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 利用Excel 軟件對測定的相關(guān)基因表達(dá)水平和蓮座葉分枝數(shù)目數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，顯著性分析采用Student'st-test，以P＜0.01為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1HY5?GFP過表達(dá)株系構(gòu)建

將構(gòu)建好的35S∷HY5-GFP過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥野生型Col-0 得到T0代種子，在含Hyg 抗性的1/2 MS 平板上篩選抗性幼苗（圖2），待存活幼苗生長至種子成熟時收取T1代種子，再在抗性板上篩選得到T2代種子。將T2代種子再進(jìn)行抗性篩選，選擇全部存活的株系即為純合株系，收取T3代種子，得到純合株系種子。

圖2 轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選Fig.2 Screening of transgenic positive plants

2.2 轉(zhuǎn)基因純合株系GFP蛋白熒光檢測

為檢測轉(zhuǎn)基因純合株系的真實(shí)性，利用載體上的GFP標(biāo)簽進(jìn)行鑒定。利用熒光顯微鏡下GFP激發(fā)光檢測GFP 蛋白是否表達(dá)。如圖3 所示，篩選得到的3 個株系在GFP 激發(fā)光下均有綠色熒光，說明轉(zhuǎn)基因株系均有GFP 蛋白的表達(dá)，得到的株系為轉(zhuǎn)基因純合株系。

圖3HY5-GFP過表達(dá)植株激發(fā)光檢測Fig.3 Fluorescence detection ofHY5-GFPoverexpression plants

2.3 過表達(dá)株系HY5表達(dá)水平檢測

為檢測外源HY5基因在擬南芥中的表達(dá)量，挑取單拷貝轉(zhuǎn)基因株系，即在抗性板上存活植株∶死亡植株分離比為3∶1 的株系，在1/2 MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d，提取幼苗的RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用qPCR檢測HY5基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示各株系的HY5表達(dá)量均高于野生型（P＜0.01），表明選擇表達(dá)量相近的3 個過表達(dá)株系均可用于后續(xù)研究（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)基因株系HY5相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression ofHY5in transgenic lines

2.4hy5突變體鑒定

提取實(shí)驗(yàn)室保存的hy5-215種子DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并測序，根據(jù)測序結(jié)果與野生型進(jìn)行比對，結(jié)果顯示基因組內(nèi)含子最后1 個堿基由G 變?yōu)锳，驗(yàn)證了所用hy5-215材料的真實(shí)性（圖5A）。采用HY5基因的另一T-DNA 插入突變體SALK_096651（hy5-10）對hy5-215的功能進(jìn)行佐證。特異引物hy5-salk-LP/hy5-salk-RP 擴(kuò)增野生型DNA得到1條1.1 kb的條帶，突變體hy5-10無條帶；LB/hy5-salk-RP 引物擴(kuò)增野生型DNA 無條帶，突變體hy5-10有500 bp 左右條帶，根據(jù)T-DNA 鑒定原理可知，得到的為純合突變體（圖5B）。

圖5 hy5突變體鑒定Fig.5 Identification ofhy5mutant

2.5 各基因型分枝表型分析

為研究HY5基因在擬南芥分枝發(fā)育方面的生物學(xué)功能，本研究比較了擬南芥突變體hy5-215、HY5過表達(dá)株系HY5-GFP與野生型在分枝數(shù)目的差異。如圖6所示，突變體hy5-215的蓮座葉分枝少于野生型，而過表達(dá)株系HY5-GFP的蓮座葉分枝多于野生型。進(jìn)一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體hy5-215植株蓮座葉數(shù)目顯著下降，HY5-GFP過表達(dá)株系蓮座葉數(shù)目顯著增多（P＜0.01）。將HY5基因的另一T-DNA插入突變體hy5-10，進(jìn)一步確認(rèn)了突變體分枝減少的表型。

圖6 擬南芥各基因型表型分析Fig.6 Analysing of branching phenotype ofArabidopsis thaliana

2.6 各基因型BRC1表達(dá)水平檢測

BRC1是抑制分枝發(fā)生的關(guān)鍵基因，因此，檢測 了HY5-GFP和hy5突 變 體 中BRC1的mRNA 水平。如圖7所示，與野生型相比，過表達(dá)株系HY5-GFP-20/22/24腋芽中BRC1的表達(dá)量降低（P＜0.01），而突變體hy5-215植株腋芽的表達(dá)量增高（P＜0.01），說明在擬南芥中，HY5 抑制BRC1的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而促進(jìn)分枝的發(fā)生。

圖7 BRC1表達(dá)水平檢測Fig.7 Detection of expression ofBRC1

3 討論

植物的分枝是株型的重要組成部分，其模式是由受復(fù)雜時空調(diào)控的腋芽決定的。多數(shù)葉片的葉腋處會形成腋生分生組織，并膨大形成腋芽。這些腋芽可以立即生長形成側(cè)枝或進(jìn)入休眠。休眠的腋芽也可能受誘導(dǎo)打破休眠生長成側(cè)枝［21-23］。分枝的數(shù)目和位置受到各種內(nèi)源因子和發(fā)育信號的共同調(diào)控，且強(qiáng)烈依賴于環(huán)境因子［24-25］，植物則可根據(jù)其生存環(huán)境調(diào)整分枝以適應(yīng)環(huán)境并高效利用資源，其中，光照是最重要的環(huán)境因子之一［26］。最為典型的光調(diào)控是在密植條件下，周邊植物的遮蔭使得植株感知光照的R/FR比率急劇下降，誘發(fā)避蔭反應(yīng)，導(dǎo)致植株分枝減少［27］。近年來，研究表明，BRC1基因能夠響應(yīng)密植遮蔭條件，短時間的遮蔭處理即可引起B(yǎng)RC1的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，從而抑制擬南芥分枝的發(fā)生，其中，光敏色素PHYB 調(diào)控BRC1的轉(zhuǎn)錄水平［28］。PHYB 接受光信號后，負(fù)調(diào)控光敏色素作用因子（phytochrome action factor，PIFs），PIFs直接結(jié)合并抑制小分子RNA MIR156 的表達(dá)，SPL9/15能夠結(jié)合BRC1的啟動子，激活BRC1的表達(dá)從而抑制分枝。因此，PHYB調(diào)控分枝的其中1條通路是通過PIFs 調(diào)控MIR156/SPLs模塊影響B(tài)RC1的表達(dá)量［29］。有研究發(fā)現(xiàn)，光信號因子FHY3和FAR1突變體植株也存在分枝減少的表型［30］。最近研究發(fā)現(xiàn)FHY3 和FAR1 參與避蔭反應(yīng)調(diào)控分枝，通過與SPL9/15 互作，抑制SPL9/15 激活BRC1的表達(dá)，從而促進(jìn)分枝［31］。與PIFs 和FHY3/FAR1相似，HY5也是重要的光信號因子，HY5是第1個被發(fā)現(xiàn)參與植物光形態(tài)建成的正調(diào)控因子，在擬南芥光形態(tài)建成過程中起重要的正調(diào)控作用，影響植株從萌發(fā)到衰老的整個發(fā)育過程。然而，HY5基因是否參與以及如何調(diào)控擬南芥的分枝目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，與野生型相比，HY5過表達(dá)植株分枝數(shù)目顯著增多，突變體hy5分枝數(shù)目顯著減少，說明HY5 促進(jìn)了擬南芥植株蓮座葉分枝的產(chǎn)生；進(jìn)一步通過RT-qPCR 檢測各株系BRC1的mRNA 水平發(fā)現(xiàn)，HY5 抑制BRC1的轉(zhuǎn)錄。因此，推測轉(zhuǎn)錄因子HY5 是通過抑制BRC1的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)BRC1的表達(dá)水平從而促進(jìn)分枝的發(fā)生。研究表明，擬南芥HY5 在長時間FR處理后轉(zhuǎn)錄本水平上調(diào)［32-33］，且蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)［34］，表明HY5 蛋白參與了植物避蔭反應(yīng)，然而，HY5 是否參與以及如何參與密植遮蔭條件下植株分枝的調(diào)控目前尚不清楚。

植物激素對植物分枝也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，細(xì)胞分裂素促進(jìn)植株分枝的發(fā)生［5］，而生長素和獨(dú)角金內(nèi)酯在抑制分枝中具有關(guān)鍵作用［6］。有研究者認(rèn)為，腋芽中脫落酸（abscisic acid，ABA）升高與被分枝抑制相關(guān)［35］，且赤霉素（gibberellin，GA）也能夠調(diào)控腋芽的生長［36］。在水稻和豌豆中油菜素內(nèi)酯（brassinolide，BR）缺失突變體分枝受到抑制，此外，HY5 也參與了多條植物激素信號通路對植物生長和發(fā)育的調(diào)控［37］。HY5 是否以及如何與激素耦合協(xié)同調(diào)控分枝需進(jìn)行更深入地研究，以更好地理解光信號因子和植物激素在擬南芥分枝調(diào)控上的作用機(jī)制和機(jī)理，最終為培育適當(dāng)分枝的理想株型植株，提高作物產(chǎn)量奠定理論基礎(chǔ)。