劉燕琴，曹 敏，唐祥友，劉正宇，張 軍*，楊美森

（1.重慶市藥物種植研究所，重慶408435；2.特色生物資源研究與利用川渝共建重點實驗室，重慶408435；3.秀山土家族苗族自治縣農(nóng)委，重慶409900）

骨碎補始栽于《開寶本草》，后收入《本草綱目》；《中國藥典》2020 版槲蕨［Drynaria fortune（Kunze）J.sm］，也是《中國植物志》記載槲蕨［Drynaria roosii］，干燥根狀莖入藥，柚皮苷（C27H32O14）≥0.50%為質(zhì)量控制；性苦、溫；歸肝、腎經(jīng)。功效：療傷止痛，補腎強(qiáng)骨；外用消風(fēng)祛斑；用于跌撲閃挫，筋骨折傷，腎虛腰痛，筋骨痿軟，耳鳴耳聾，牙齒松動；外治斑禿，白癜風(fēng)［1-2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明中藥骨碎補在抗炎癥、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨折愈合方面療效顯著［3-4］。因野生資源采集、破壞嚴(yán)重，其資源日益下降，已于2002 年建議列入珍稀植物三級保護(hù)［5］，發(fā)展人工種植成為必然趨勢，而當(dāng)前育苗技術(shù)不成熟，急需開展相關(guān)技術(shù)研究［6］。

骨碎補資源稀少，塊莖繁殖數(shù)量受限；孢子數(shù)量大，自然條件下成苗率低［7-8］（因為槲蕨孢子萌發(fā)到形成孢子苗，經(jīng)過萌發(fā)-原葉體生長-原葉體成熟受精-孢子苗長出-塊莖長出等復(fù)雜過程，且條件不可控）。而當(dāng)前孢子人工育苗缺乏相關(guān)技術(shù)，孢子萌發(fā)基質(zhì)、原葉體受精條件等成為孢子育苗的關(guān)鍵，故開展此研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2021 年3 月（孢子成熟期）采集重慶市藥物種植研究所及酉陽木葉鄉(xiāng)槲蕨孢子葉（經(jīng)重慶市藥物種植研究所劉正宇老師鑒定）。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子保存方法

于孢子成熟期，采集孢子葉（孢子黃色），置于通風(fēng)、透氣的室內(nèi)，防止霉變。方法Ⅰ：在通風(fēng)陰涼處晾15～20 d，用牛皮紙包好，置于4℃冰箱保存；方法Ⅱ，在通風(fēng)陰涼地放置30 d 左右，葉片表面風(fēng)干、孢子有自然散落時，軟毛刷刷下孢子，裝入信封，置于4℃冰箱保存。

1.2.2 孢子萌發(fā)

1.2.2.1 培養(yǎng)條件

光照1 000～2 000 Lx，8～10 h/d；溫度25±2℃，空氣濕度80%左右。

1.2.2.2 基質(zhì)配方及處理

基質(zhì)種類：“A1 細(xì)河沙”（過3 號篩），“A2 中河沙”（過1 號篩），“A3 粗河沙”（粒徑0.5～1 mm）；“B1細(xì)蛭石”（過3 號篩），“B2 中蛭石”（過1 號篩），“B3粗蛭石”（粒徑0.5～1 mm）；“C1 紫色細(xì)壤土”（過3號篩），“C2 紫色中壤土”（過1 號篩），“C3 紫色粗壤土”（粒徑0.5～1 mm）；“D1 黃色細(xì)壤土”（過3 號篩），“D2黃色中壤土”（過1號篩），“D3黃色粗壤土”（粒徑0.5～1 mm）；“E1 細(xì)腐殖土”（過3 號篩），“E2中腐殖土”（過1 號篩），“E3 粗腐殖土”（粒徑0.5～1 mm）。每個處理設(shè)置重復(fù)3個。

基質(zhì)處理方法：方法1，用無紡布包好，間歇高溫滅菌法（121℃），消毒1 h-冷卻-消毒1 h-冷卻-再消毒1 h；方法2，采用0.1%～0.2%的高錳酸鉀溶液進(jìn)行土壤消毒，拌勻后塑料袋密封放置1～2 d。

1.2.2.3 播種方法

在培養(yǎng)盤中鋪上3～5 cm 厚的基質(zhì)；把孢子用細(xì)紗布包好置于“50%多菌靈可濕性粉劑500 倍溶液+ 惡霉靈30%水劑2 000～3 000 倍液”浸泡震蕩30 min后撈出，清水沖洗干凈風(fēng)干；然后將4.0 mg孢子配成500 mL 孢子懸浮液噴灑播種（8 dm2），控制密度；蓋上透明塑料蓋子保濕。

日常管理，每隔5～7 d，噴濕表面。

1.2.2.4 萌發(fā)率統(tǒng)計方法

在顯微鏡下觀察：1 mg 槲蕨孢子粉（含孢子囊殼及無法分離的雜物），孢子數(shù)量統(tǒng)計約1 600個。

萌發(fā)率（%）=萌發(fā)孢子數(shù)/孢子數(shù)×100

1.2.3 原葉體受精期管理

孢子萌發(fā)后生長40 d 左右，原葉體逐步進(jìn)入成熟期，促進(jìn)原葉體受精形成孢子苗尤為重要，開展原葉體營養(yǎng)、濕度管理，以1/2MS、1/4MS、1/8MS 營養(yǎng)液、清水定期噴施（每個處理設(shè)置重復(fù)3個），管理60 d 時，統(tǒng)計孢子苗數(shù)量，篩選出提高原葉體受精的方法。

其他條件及光照、溫度條件同1.2.2.1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各組數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以x±s 表示，多組間比較采用One?way ANOVA，以P＜0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)孢子的萌發(fā)情況

從表1試驗結(jié)果看出，不同基質(zhì)孢子直播，其萌發(fā)率有顯著差異，其中以“E1 細(xì)腐殖土”、“E2 中腐殖土”萌發(fā)率高；其次為A1、A2 河沙組，隨后以C1、C2和D1的萌發(fā)率較高。

表1 不同基質(zhì)對槲蕨（骨碎補）孢子萌發(fā)的影響Tab. 1 The effects of different substrates on the spore germination of Drynaria fortune

原葉體長勢比較：E1、E2 長勢好，然后是A1、A2，其次C1、C2、E3。其他組萌發(fā)后生長勢較差。

綜上研究可以發(fā)現(xiàn)，骨碎補（槲蕨）孢子萌發(fā)以“細(xì)腐殖土”（過3 號篩）、“中腐殖土”（過1 號篩）、“細(xì)河沙”（過3 號篩）、中河沙（過1 號篩）、紫色細(xì)壤土（過3 號篩）、紫色中壤土（過1 號篩）為基質(zhì)，孢子萌發(fā)率高，原葉體長勢好。

2.2 不同管理下原葉體生長情況及受精形成孢子苗情況

圖1 孢子萌發(fā)過程Fig.1 Spore germination process

孢子萌發(fā)形成原葉體，每1 dm2約400 個原葉體。均在4 dm2的原葉體分布面積上，進(jìn)行濕度和營養(yǎng)管理，統(tǒng)計不同處理下每1 dm2孢子苗（原葉體受精長出）數(shù)量、原葉體受精率。

從表2可以看出，濕度對槲蕨原葉體生長、受精、孢子苗成苗率有明顯的影響。環(huán)境濕度小，不利于原葉體生長和受精；環(huán)境濕度保持在90%左右，原葉體受精率升高（≥17.5%），孢子苗的數(shù)量增加。

表2 不同處理的原葉體受精率及孢子苗數(shù)量Tab. 2 The fertilization rate and the number of spore seedlings in different treatments

同時研究發(fā)現(xiàn)，噴施營養(yǎng)液對原葉體生長有好處，原葉體葉色濃綠，而清水組的原葉體生長瘦弱；在原葉體受精率方面，噴施不同濃度MS 營養(yǎng)液組比清水組的高，其中以1/4MS 營養(yǎng)液、間隔3 d 噴1次的綜合效果最好。這可能與1/4MS營養(yǎng)液的施用能促進(jìn)原葉體的發(fā)育和生長需求有關(guān)。

圖2 原葉體受精及孢子苗生長Fig.2 Prothallus fertilization and sporulation growth

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，槲蕨孢子直播育苗與常規(guī)種子育苗有差異，其萌發(fā)基質(zhì)、原葉體生長及受精微環(huán)境等直接影響孢子苗數(shù)量。

槲蕨孢子在多種基質(zhì)上均可萌發(fā)，其中以細(xì)腐殖土、中號腐殖土效果最好；而在原葉體生長成熟期，加強(qiáng)濕度和營養(yǎng)管理，可促進(jìn)受精，提高原葉體受精率，從而增加孢子苗數(shù)量。

3.1 直播基質(zhì)對萌發(fā)的影響

槲蕨（骨碎補）孢子囊群細(xì)小，直徑約0.5～1.0 mm，孢子囊大小約為0.01 mm，正常孢子囊含有十幾個孢子；而孢子萌發(fā)需要一定條件，除溫度、濕度、光照條件外，基質(zhì)對萌發(fā)微環(huán)境起到一定調(diào)控作用。

現(xiàn)有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)對槲蕨的孢子萌發(fā)有較大影響，如劉保東［9］研究發(fā)現(xiàn)采用水培法和土培法槲蕨孢子能萌發(fā)；張銀麗［10］研究發(fā)現(xiàn)，槲蕨無菌萌發(fā)以低無機(jī)鹽的培養(yǎng)基萌發(fā)時間短，但高無機(jī)鹽培養(yǎng)基有利于配子體發(fā)育；在槲蕨小苗移栽技術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)，草炭土：素沙=1：1 基質(zhì)中的小苗植株生長發(fā)育最快，有利于槲蕨小苗生長［11］。不同基質(zhì)對孢子萌發(fā)的微條件供給有差異，如濕度、營養(yǎng)、透氣性、pH 等均有一定差異，這可能導(dǎo)致孢子萌發(fā)、后期原葉體生長有差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，骨碎補孢子萌發(fā)以“細(xì)腐殖土”（過3 號篩）、“中腐殖土”（過1 號篩）、“細(xì)河沙”（過3號篩）、“中河沙”（過1 號篩）、“紫色細(xì)壤土”（過3 號篩）為基質(zhì)，孢子萌發(fā)率高，原葉體長勢好。

3.2 槲蕨（骨碎補）原葉體受精的影響因素

劉保東［9］研究發(fā)現(xiàn)，增加環(huán)境濕度和人工干預(yù)原葉體受精，可以提高受精率即增加孢子苗數(shù)量。有關(guān)槲蕨原葉體受精相關(guān)報道較少，而在其他蕨類植物有少量研究，如邊珂研究發(fā)現(xiàn)不同N含量的MS培養(yǎng)基，對蕨菜孢子萌發(fā)后的原葉體受精有一定的影響，合適濃度的N含量能促進(jìn)原葉體生長和受精［12］。該研究還發(fā)現(xiàn)，采用1/4MS營養(yǎng)液定期噴施，槲蕨原葉體生長良好，同時也能促進(jìn)受精，增加孢子苗數(shù)量。

因此，采用合適萌發(fā)基質(zhì)并在原葉體生長期加強(qiáng)營養(yǎng)管理可提高原葉體受精率，從而提高孢子萌發(fā)的成苗率，將為槲蕨（骨碎補）的人工質(zhì) 苗及種植發(fā)展提供支持。