李金金，王 丹，唐玉琴，谷文超，周 濃，石汝杰

（重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，三峽庫(kù)區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶404120）

浙貝母（Fritillana thunbergiiMiq.）為百合科貝母屬多年生草本植物［1］。原產(chǎn)于浙江寧波，現(xiàn)在江蘇、重慶、江西等地均有種植栽培［2］，其入藥部位為地下鱗莖，具有清熱、化痰、解毒、消癰等功效［3］。現(xiàn)代研究表明，浙貝母也具有鎮(zhèn)痛抗炎、降壓活血、溶石止瀉、抗菌抗腫瘤等藥理學(xué)活性［4］，與白術(shù)、白芍、延胡索、杭白菊、溫郁、玄參、筧麥冬等合稱為“浙八味”［5］。隨著中醫(yī)藥健康體系的快速發(fā)展，浙貝母的市場(chǎng)需求與日俱增，全國(guó)年需求量約100萬(wàn)公斤，重慶有利的自然條件為浙貝母引種栽培提供了條件，目前已成為促進(jìn)重慶中藥材產(chǎn)業(yè)振興的主推中藥材品種之一。

溫度、光照、水分和土壤理化性質(zhì)對(duì)中藥材的生長(zhǎng)及品質(zhì)有直接影響，其中土壤是直接影響中藥材生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵性因子［6-7］。土壤中礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量與藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝物質(zhì)形成密切相關(guān)，是中藥材中有效成分不可或缺的構(gòu)成因子［8-10］。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)浙貝母的研究多見于其化學(xué)成分和藥理作用方面［11-14］，對(duì)不同產(chǎn)地浙貝母礦物元素構(gòu)成及分布特征研究較少。鑒于此，本研究以江蘇南通、浙江磐安、重慶奉節(jié)、浙江寧波產(chǎn)浙貝母為種源，采用大田試驗(yàn)并結(jié)合原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法和高效液相色譜法分析浙貝母礦物元素和生物堿含量的差異，為浙貝母品質(zhì)評(píng)價(jià)和引種栽培工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

浙貝母種源購(gòu)自江蘇南通、浙江磐安、重慶奉節(jié)、浙江寧波，經(jīng)重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定為浙貝母（Fritillaria thunbergiiMiq.）。按其規(guī)格大小分為小貝（≤80個(gè)/千克）、中貝（81~120 個(gè)/千克）、大貝（121~160 個(gè)/千克），樣品信息如表1所示。

表1 種源信息Tab. 1 Source information

田間試驗(yàn)于2018年10月~2019年5月在重慶市萬(wàn)州區(qū)龍駒鎮(zhèn)梧桐村浙貝母優(yōu)質(zhì)種源基地露地進(jìn)行。按照株行距20 cm × 20 cm，試驗(yàn)設(shè)3 種不同規(guī)格大小進(jìn)行分級(jí)處理：小貝、中貝、大貝。各處理均施加商品有機(jī)肥（有機(jī)質(zhì)含量為45%以上，不含氮磷鉀肥）各3.0 g·kg-1基肥。整個(gè)生長(zhǎng)期間進(jìn)行水肥管理，隨時(shí)清除田間雜草并防治病蟲害。栽培前采集土樣做對(duì)照組（CK 組），2019年5月收獲各樣品組浙貝母（S1~S12），置于恒溫干燥箱45 ℃烘干至恒重，粉碎，過(guò)80 目篩備用。收獲藥材同時(shí)采集各樣品組根際土壤（S1~S12），風(fēng)干、粉碎，過(guò)80 目篩備用。

1.2 主要儀器

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（EXPEC 7000，聚光科技（杭州）股份有限公司）；原子熒光光度計(jì)（AFS-8510，北京海光儀器有限公司）；高壓微波消解儀（MARS6 ，美國(guó)CEM 公司）；超純水機(jī)（Milli-Q Ad?vantage A10，美國(guó)Millipore 公司）；萬(wàn)分之一電子天平（SQP Sartorius，德國(guó)Sartorius公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 浙貝母藥材消解

取浙貝母樣品粉末0.2 g 于聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加入濃硝酸8 mL，密封，浸泡過(guò)夜，置于微波消解儀中按設(shè)定的消解程序消解處理，消解完全后，取出冷卻，用去離子超純水定容至25 mL容量瓶中，同時(shí)取8 mL濃硝酸制備空白溶液［15］。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

以鍺（Ge）、銠（Rh）、鉍（Bi）為內(nèi)標(biāo)元素，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定鉀（K）、磷（P）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鐵（Fe）、銅（Cu）、鋅（Zn）、錳（Mn）、硼（B）、鎳（Ni）、鋇（Ba）、鎘（Cd）、鉛（Pb）、鉬（Mo）、鈰（Ce）、釹（Nd）、鑭（La）、鈷（Co）、銻（Sb）、硒（Se）、鐠（Pr）、釤（Sm）。采用氫化物發(fā)生原子熒光光譜法測(cè)定As［16］。浙貝母總生物堿含量測(cè)定參照《中國(guó)藥典（2020）》浙貝母項(xiàng)。

1.3.3 儀器參數(shù)

ICP-MS：功率1.4 kW，霧化氣流量1.224 L·min-1，輔助氣流量1.0 L·min-1、冷卻氣流量14.0 L·min-1，霧化室溫度2.0℃，蠕動(dòng)泵速30 r·min-1，采樣深度3.91 mm，掃描次數(shù)10次，分析時(shí)間26 s。

AFS：汞燈，負(fù)高壓290 V，載氣流量0.4 L·min-1，屏蔽器流量1.0 L·min-1，燈電流10 mA，重復(fù)次數(shù)3次，讀數(shù)時(shí)間10 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種源地和種源規(guī)格浙貝母礦質(zhì)元素含量差異分析

由表2 可見，浙貝母中常量礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素（P、K、Ca、Mg）質(zhì) 量 分 數(shù) 為725.664~30 257.236 mg·kg-1；微量礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素（B、Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Ni）質(zhì) 量 分 數(shù)為0.025~425.452 mg·kg-1；重金屬元素（Co、As、Se、Cd、Sb、Ba、Pb）質(zhì) 量 分 數(shù) 為0.016~2.296 mg·kg-1；稀土元素（La、Ce、Pr、Nd、Sm）質(zhì) 量分 數(shù) 為0.017~0.304 mg·kg-1，總體上各礦質(zhì)元素分布趨勢(shì)為：K>P>Mg>Ca>Fe>Cu>Zn>Mn>B>Ni>Ba>Cd>Pb>Mo>As>Ce>Nd>La>Co>Sb>Se>Pr>Sm。

其中，P、K、Ca、Mg、B、Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Ni 是植物生長(zhǎng)所必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)藥用植物的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。不同種源浙貝母中Mg、Mn、Mo和Fe元素平均含量存在差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。寧波種源浙貝母Mg、Mn 和Fe 元素平均含量最高，分別為1 061.082 mg·kg-1、26.923 mg·kg-1和210.216 mg·kg-1；南通種源浙貝母Mo 元素平均含量最高，為0.176 mg·kg-1，其它必需礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素平均含量差異均未達(dá)到顯著水平。

Co、As、Se、Cd、Sb、Ba 和Pb 是重金屬和有害礦質(zhì)元素，雖然有很多研究表明低劑量的重金屬對(duì)藥用植物的生長(zhǎng)及品質(zhì)具有促進(jìn)作用，但更重要的是重金屬污染會(huì)對(duì)中藥材產(chǎn)量、品質(zhì)和商品價(jià)值造成不利影響。由表2可以看到，不同種源浙貝母中Pb、Cd 和Co 元素平均含量存在差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；重慶奉節(jié)種源浙貝母中Pb 和Co 元素平均含量最高，分別為0.807 mg·kg-1和0.105 mg·kg-1；浙江寧波種源浙貝母中Cd 元素平均含量最高，為0.765mg·kg-1；其它重金屬元素平均含量差異均未達(dá)到顯著水平。對(duì)照《中國(guó)藥典（2020 版）》、《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》、《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》、《中醫(yī)藥-中藥材重金屬限量》以及歐盟、美國(guó)、英國(guó)、德國(guó)、日本、新加坡、馬來(lái)西亞和韓國(guó)等對(duì)中草藥樣品中重金屬及有害元素含量的限量標(biāo)準(zhǔn)［17］，重慶奉節(jié)和浙江寧波種源浙貝母中重金屬鎘（Cd）含量超過(guò)上述限量標(biāo)準(zhǔn)，4 個(gè)種源浙貝母銅（Cu）元素含量均超過(guò)《中國(guó)藥典》和馬來(lái)西亞限量標(biāo)準(zhǔn)；As和Pb含量處在安全水平。

La、Ce、Pr、Nd、Sm 是稀土元素，目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用，低濃度的稀土元素對(duì)作物的增產(chǎn)、抗逆和品質(zhì)提高均有一定的促進(jìn)作用。由表2可以看到，La+Ce+Nd 占5 種稀土平均含量的91.4%~92.1%，其中浙江寧波種源浙貝母中5 種稀土元素平均含量最高，分別為0.168mg·kg-1、0.383mg·kg-1、0.037mg·kg-1、0.145mg·kg-1、0.026mg·kg-1，與其它種源浙貝母中稀土元素平均含量差異達(dá)顯著水平。

表2 不同種源浙貝母礦質(zhì)元素含量差異分析（mg·kg-1）Tab. 2 Contents of mineral elements in F. thunbergii from different origins and grades（mg·kg-1）

不同規(guī)格種源浙貝母23 種礦質(zhì)元素測(cè)定結(jié)果如表3 所示。總體上，大貝種源浙貝母礦質(zhì)元素含量>中貝種源浙貝母礦質(zhì)元素含量>小貝種源浙貝母礦質(zhì)元素含量；不同規(guī)格種源浙貝母中K、Mg、Ca、Mn、B、Ba、Cd、Pb、Mo、As、Ce、Nd、La、Co、Pr 和Sm元素含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；大貝種源和中貝種源浙貝母中P、Fe、Cu、Zn、Ni、Sb 和Se 元素含量差異不顯著，但與小貝種源浙貝母中元素含量差異顯著。對(duì)照中國(guó)及部分國(guó)家有關(guān)中藥重金屬的限量標(biāo)準(zhǔn)，Cd 和Cu 兩種元素含量超過(guò)上述限量標(biāo)準(zhǔn)，As和Pb含量處于安全水平。

表3 不同規(guī)格種源浙貝母礦質(zhì)元素含量差異分析（mg·kg-1）Tab. 3 Contents of mineral elements in F. thunbergii from different grades（mg·kg-1）

2.2 浙貝母礦質(zhì)元素主成分分析（PCA）

主成分分析是將眾多的變量通過(guò)降維，重新組合成為少數(shù)幾個(gè)因子表示，并且保證原始信息損失最小。為探索不同種源浙貝母礦質(zhì)元素間的因子關(guān)系，運(yùn)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表4。由表4可知，不同種源浙貝母礦物元素含量信息主要集中在前4 個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率高達(dá)88.009%，說(shuō)明所提取的4個(gè)主成分能夠較為全面地反映礦物元素的主要特征。其中，主成分1 的特征值為12.63，可以解釋54.913%的原始數(shù)據(jù)變量信息，K、P、Mg、Fe、Cu、Zn、Mn、B、Ba、Cd、Ce、Nd、La、Co、Sb、Se、Pr和Sm18種礦質(zhì)元素的載荷值大于0.6，說(shuō)明這些元素對(duì)主成分1 貢獻(xiàn)較大；主成分2 的特征值為3.853，可以解釋16.753%的原始數(shù)據(jù)變量信息，對(duì)主成分2 貢獻(xiàn)最大的是As 和Mo；主成分3 的特征值為2.597，可以解釋11.289%的原始數(shù)據(jù)變量信息，對(duì)主成分3 貢獻(xiàn)最大的是Ca；主成分4 的特征值為1.162，可以解釋5.053%的原始數(shù)據(jù)變量信息，各元素在主成分4 中的載荷值比較低，可作為前3個(gè)主成分變量信息的補(bǔ)充。

表4 主成分的特征值及方差貢獻(xiàn)率Tab. 4 Eigenvalues and variance contribution of principal components

2.3 不同種源和規(guī)格浙貝母對(duì)礦質(zhì)元素的吸收富集分析

富集系數(shù)（EC）是植物體中的元素含量與土壤中同種元素含量的比值，能客觀反映植物對(duì)土壤中元素富集作用的強(qiáng)弱［18］。不同種源和規(guī)格浙貝母對(duì)礦質(zhì)元素的富集能力如表5 所示，可以看出不同種源浙貝母對(duì)植物必須營(yíng)養(yǎng)元素的富集作用較強(qiáng)，富集能力順序?yàn)椋篊u>P>K>Mg>Zn>B>Mo>Ca>Ni>Fe，其中對(duì)Mg、P、K、Cu元素的富集系數(shù)均大于1，重慶奉節(jié)種源浙貝母的Zn 富集系數(shù)最高，為1.23；浙貝母對(duì)重金屬及有害元素的富集能力順序?yàn)椋篊d>Sb>As>Pb>Co>Ba，其中Cd 的富集系數(shù)最大，江蘇南通、浙江磐安、重慶奉節(jié)、浙江寧波4 個(gè)種源浙貝母對(duì)Cd 的 富 集 系 數(shù) 分 別 為4.354、4.896、12.888、15.619；浙貝母對(duì)5 種稀土元素的富集能力順序?yàn)椋篖a>Pr>Ce>Nd>Sm，其富集系數(shù)均小于1，說(shuō)明浙貝母對(duì)稀土元素的富集能力較弱。

表5 富集系數(shù)Tab. 5 Enrichment factors

種源規(guī)格大小對(duì)浙貝母富集礦質(zhì)元素能力：植物必需營(yíng)養(yǎng)元素>重金屬及有害元素>稀土元素，Cu>P>K>Mg>Zn>B>Mo>Ca>Ni>Fe>Cd>Sb>As>Pb>Co>Ba>La>Pr>Ce>Nd>Sm；大貝種源浙貝母>中貝種源浙貝母>小貝種源浙貝母，說(shuō)明浙貝母種源規(guī)格越大，浙貝母產(chǎn)量越高，越能吸收礦質(zhì)元素。

2.4 不同種源浙貝母總生物堿及其與礦質(zhì)元素相關(guān)性分析

采用HPLC 法測(cè)定了浙貝母中總生物堿含量，結(jié)果見表6?？梢钥闯觯N源地對(duì)生物堿含量有顯著影響，不同種源浙貝母生物堿含量差異顯著。其中，江蘇南通種源浙貝母總生物堿含量最高，重慶奉節(jié)和浙江寧波種源浙貝母總生物堿含量差異不顯著，但與浙江磐安種源浙貝母總生物堿含量差異顯著。雖然不同規(guī)格浙貝母總生物堿含量差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但總的來(lái)看，大貝種源浙貝母總生物堿含量>中貝種源浙貝母總生物堿含量>小貝種源浙貝母總生物堿含量，說(shuō)明浙貝母規(guī)格越大，浙貝母產(chǎn)量越高，總生物堿含量越高。

表6 浙貝母總生物堿含量（mg/g）Tab. 6 Total alkaloid content of F. thunbergii （mg/g）

通過(guò)對(duì)浙貝母礦質(zhì)元素與總生物堿進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表7 所示，總生物堿含量與B 和Mo具有顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.670 和0.825。雖然B 和Mo 不是生物堿的組成元素，但它們作為酶的輔助成分，可以參與浙貝母生物堿的合成與積累。同時(shí)也說(shuō)明，在浙貝母的栽培過(guò)程中，要重視含微量元素B 和Mo 肥料的施用。

表7 浙貝母中總生物堿與礦質(zhì)元素相關(guān)性分析Tab. 7 Correlation analysis of total alkaloid and mineral elements in F. thunbergii

3 結(jié)論與討論

本研究采用ICP-MS 法和HPLC 法分別測(cè)定不同種源地產(chǎn)新浙貝母中K、P、Mg、Ca、Fe、Cu、Zn、Mn、B、Ni、Ba、Cd、Pb、Mo、As、Ce、Nd、La、Co、Sb、Se、Pr和Sm 23種礦質(zhì)元素含量及浙貝母總生物堿的含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和綜合評(píng)價(jià)，為重慶地區(qū)引種栽培浙貝母提供科學(xué)依據(jù)。不同產(chǎn)區(qū)地球化學(xué)背景對(duì)浙貝母元素吸收的影響大于種源和生長(zhǎng)物候期等因子［19-20］。本研究結(jié)果表明，總體上各礦質(zhì)元素分布趨勢(shì)為：K>P>Mg>Ca>Fe>Cu>Zn>Mn>B>Ni>Ba>Cd>Pb>Mo>As>Ce>Nd>La>Co>Sb>Se>Pr>Sm，重慶奉節(jié)和浙江寧波種源浙貝母中重金屬Cd 含量超過(guò)限量標(biāo)準(zhǔn)，4 個(gè)種源地浙貝母Cu 元素含量均超過(guò)相應(yīng)限量標(biāo)準(zhǔn)；As 和Pb 含量處在安全水平。此外，不同規(guī)格種源浙貝母對(duì)元素的吸收能力也具有一定差異性，大貝種源浙貝母對(duì)礦質(zhì)元素吸收能力較高。主成分分析結(jié)果表明，K、P、Mg、Fe、Cu、Zn、Mn、B、Ba、Cd、Ce、Nd、La、Co、Sb、Se、Pr、Sm、As、Mo 和Ca 21 種礦質(zhì)元素的載荷值均大于0.6，累計(jì)貢獻(xiàn)率83%，可以用它們作為評(píng)價(jià)浙貝母的特征礦質(zhì)元素；富集系數(shù)表明，浙貝母對(duì)Mg、P、K、Cd、Cu 元素均表現(xiàn)出較強(qiáng)的富集作用。因此，引種栽培浙貝母時(shí)，一方面要對(duì)土壤中重金屬元素含量進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，另一方面要引入消減重金屬含量的栽培措施，以此降低浙貝母對(duì)重金屬的富集。

在浙貝母總生物堿分析中，不同種源浙貝母生物堿含量差異顯著。其中，江蘇南通種源浙貝母總生物堿含量最高，大貝種源浙貝母總生物堿含量>中貝種源浙貝母總生物堿含量>小貝種源浙貝母總生物堿含量。浙貝母總生物堿含量與B 和Mo 具有顯著正相關(guān)。因此，在今后浙貝母引種栽培時(shí)，可優(yōu)先引種江蘇南通種源。同時(shí)，在浙貝母的栽培過(guò)程中，注意微量必需營(yíng)養(yǎng)元素B和Mo的施用。

不同種源和不同規(guī)格種源浙貝母礦質(zhì)元素及總生物堿的分布特征為引種浙貝母提供了科學(xué)參考依據(jù)，也將為下一步課題組深入研究礦質(zhì)元素對(duì)浙貝母藥用成分積累影響奠定基礎(chǔ)。