原小迪，李 鈺，陳艷芳，李 晶，邵 婷，王 婷，虞林峰，黃 敏

(昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南省高校都市型現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程研究中心，云南 昆明 650214)

玉米是中國(guó)重要的糧食作物。近年來(lái)，各地玉米病害頻發(fā)，嚴(yán)重影響了玉米的產(chǎn)量及品質(zhì)。一種新病害——玉米細(xì)菌性頂腐病也在云南省各玉米栽培區(qū)廣泛發(fā)生。該病在玉米抽雄前均可發(fā)生，造成玉米葉緣缺刻和葉片撕裂等典型癥狀，嚴(yán)重時(shí)不能結(jié)實(shí)[1]。該病具有分布廣、癥狀多樣和發(fā)病重的特點(diǎn)，一旦發(fā)生，便大范圍傳播，給玉米生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的損失。玉米細(xì)菌性頂腐病的病原為人和動(dòng)物的條件致病菌肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae，KP)[1]。KP 在自然條件下還可導(dǎo)致香蕉葉斑病[2]，人工接種能使高粱產(chǎn)生葉斑及心葉不能展開(kāi)等癥狀[3]。

臨床上，KP 是引起醫(yī)院內(nèi)及社區(qū)感染的重要致病菌[4]，能引起肺炎、肝膿腫、腦膜炎、子宮炎、乳腺炎和腸炎等疾病[5]，常通過(guò)接觸被污染的日用品、醫(yī)療器械或留置導(dǎo)管等引發(fā)，對(duì)醫(yī)院重癥患者或免疫力低的人群威脅較大[6]。KP 還具有多重抗生素抗性和耐藥機(jī)制[7]，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和對(duì)不利條件的抵抗力都很強(qiáng)。隨著抗菌藥物的濫用，其危害性加劇。此外，KP 還能侵染魚(yú)、兔和牛等動(dòng)物[8-10]，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和從業(yè)人員的健康存在潛在威脅。除了最主要的毒力因子莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)外[5]，Ⅰ型和Ⅲ型菌毛、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、鐵載體、孔蛋白、外排泵以及與尿囊素代謝有關(guān)的基因等在KP 對(duì)人和動(dòng)物的致病性上都發(fā)揮著重要作用[11-12]。CPS 能使KP 在菌體表面聚集成復(fù)合物(莢膜)，在感染過(guò)程中使其順利地在血液中蔓延，成功地避免吞噬作用，引起菌血癥、膿血癥和肺炎克雷伯氏菌性肺炎[6]。此外，CPS 耐干燥，可保持菌體表面濕潤(rùn)，有效預(yù)防菌體脫水死亡，這使具有莢膜的細(xì)菌更容易在宿主間相互傳播[13]。莢膜的結(jié)構(gòu)和抗原性與細(xì)菌的血清型密切相關(guān)[13]。KP 菌株分為82 個(gè)K 血清型[14]，臨床上常見(jiàn)的主要有K1、K2、K5、K20、K54 和K57等[15]。其中，具有K1、K2、K54 和K57 血清型的菌株是強(qiáng)毒力菌株[15]。

KP 廣泛分布于自然界，廢水、污水、地表水、土壤、植物和零售肉類(lèi)等都可能成為其非臨床棲息地[3,16]。因其較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和跨界侵染特性，KP 能夠隨著被污染的農(nóng)家肥、灌溉水、降雨、田間玉米頂腐病病殘?bào)w或作為家畜飼料在植物與人和動(dòng)物間傳播，對(duì)人畜安全及玉米生產(chǎn)造成隱患。目前，雖已證實(shí)不同來(lái)源的KP(玉米頂腐病病原KpC4、臨床R138、環(huán)境E4)菌株能夠跨界侵染不同生物(動(dòng)物和植物)[3]，但對(duì)于這些不同來(lái)源KP 菌株系統(tǒng)進(jìn)化的關(guān)系研究仍然較少。本研究從環(huán)境中分離KP 菌株，并檢測(cè)環(huán)境菌株對(duì)玉米的致病性及其與醫(yī)院常見(jiàn)血清型的關(guān)聯(lián)性，以期為玉米細(xì)菌性頂腐病病原學(xué)和流行學(xué)的研究以及制定玉米細(xì)菌性頂腐病的防控措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品和菌株

在昆明學(xué)院(N24.979°，E102.800°)校園環(huán)境中采集土壤及水樣本，分離KP 環(huán)境菌株。以肺炎克雷伯氏菌RC4(具有500 μg/mL 利福平抗性的玉米細(xì)菌性頂腐病病原菌)、R138(具有K1 血清型和500 μg/mL 利福平抗性的臨床菌株)和E4 菌株(具有K1 血清型的野生型環(huán)境菌株[3]，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)何月秋教授惠贈(zèng))為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 克雷伯氏菌的分離

本試驗(yàn)于昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)樓旁的大棚和露地玫瑰園等地取13 個(gè)土樣，于聽(tīng)心湖湖水、聶耳廣場(chǎng)、南門(mén)和博實(shí)樓附近的3 個(gè)池塘、地表積水和灌溉水等取19 個(gè)水樣。取研磨后土樣0.5 g 于20 mL 離心管中，加入無(wú)菌水5 mL 漩渦振蕩；靜置10 min，各取100 μL 分別涂布于MIAC(麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素培養(yǎng)基)和LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基。將采集的水樣(1 mL)漩渦振蕩，各取100 μL 分別涂布于MIAC 和LB 培養(yǎng)基。37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，從MIAC 培養(yǎng)基上挑取大小及形態(tài)不同的單菌落在LB 培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，重復(fù)2～3 次得到單菌落。MIAC 培養(yǎng)基是高效的Klebsiella屬分離培養(yǎng)基，Klebsiella屬細(xì)菌可以發(fā)酵肌醇和阿東醇，且抗羧芐青霉素，因此，能在MIAC 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落可初步判定為Klebsiella[17]。以RC4 菌株為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2 肺炎克雷伯氏菌的鑒定

參照東秀珠等[18]的方法，對(duì)從MIAC 培養(yǎng)基上篩選得到的單菌落進(jìn)行菌落形態(tài)觀察和革蘭氏染色，并進(jìn)行丙二酸鹽、酒石酸鹽、V-P、乳糖、脲酶、精氨酸、葡萄糖、賴(lài)氨酸和明膠液化等生理生化指標(biāo)的測(cè)定。參照說(shuō)明書(shū)，用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司)提取細(xì)菌DNA。使用16S rRNA 基因通用引物27F/1492R(表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系25 μL，包括：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。以ddH2O 為空白對(duì)照。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取16S rRNA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳(100 V，40 min)檢測(cè)。將條帶長(zhǎng)度與預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度基本相符的PCR 產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司昆明公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI GenBank 中進(jìn)行比對(duì)分析。通過(guò)MEGA 7.0 軟件的最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(bootstrap runs=1 000)，確認(rèn)該菌株的分類(lèi)地位。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.2.3 肺炎克雷伯氏菌血清型鑒定

參照王建莉[15]的方法，使用表2 中引物，以KP 環(huán)境菌株基因組DNA 為底物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL，以ddH2O 為空白對(duì)照。反應(yīng)條件見(jiàn)表3。每對(duì)引物PCR 擴(kuò)增重復(fù)3 次。基因擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳(100 V，40 min)檢測(cè)。

表2 擴(kuò)增肺炎克雷伯氏菌血清型的引物Tab.2 Primers for identification of Klebsiella pneumoniae capsular serotype

表3 PCR 反應(yīng)條件Tab.3 PCR reaction conditions

1.2.4 肺炎克雷伯氏菌致病性的測(cè)定

用針刺葉片和莖部以及棉簽涂抹的方法，將鑒定為KP 的環(huán)境菌株菌懸液(1×108CFU/mL)接種至2～3 葉期、長(zhǎng)勢(shì)一致的健康玉米(糯玉米品種：白雪公主)植株；以LB 液體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，E4 和RC4 菌懸液為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)處理接種3 盆，每盆3 株。接種后置于光照培養(yǎng)箱(相對(duì)濕度60%～80%；光照10 h，28 ℃/黑暗14 h，23 ℃)中培養(yǎng)，每天觀察并記錄發(fā)病情況和發(fā)病率。玉米發(fā)病后取病健交界處進(jìn)行病原物的分離和純化。此試驗(yàn)根據(jù)柯赫氏法則重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 肺炎克雷伯氏菌環(huán)境菌株的分離

2.1.1 形態(tài)特征及生理生化鑒定結(jié)果

本試驗(yàn)在MIAC 平板上得到108 個(gè)單菌落。其中，分離自南苑大棚草莓土壤表面的E23 菌株菌落形態(tài)在MIAC(圖1a)及LB(圖1b)培養(yǎng)基上都表現(xiàn)出Klebsiella屬的典型形態(tài)特征；染色鏡檢可見(jiàn)菌體在顯微鏡下呈紅色短桿狀，單個(gè)存在或2 個(gè)相連，為革蘭氏陰性菌(圖1c)。生理生化鑒定的12 項(xiàng)指標(biāo)(表4)皆與玉米細(xì)菌性頂腐病病原菌KP RC4 菌株一致，與變棲克雷伯氏菌(K.variicola)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、植生克雷伯氏菌(K.planticola)的生理生化特性存在差異。

表4 E23 的生理生化鑒定結(jié)果Tab.4 Physiological and biochemical identification results of E23

圖1 E23 的菌落形態(tài)和革蘭氏染色圖Fig.1 Colony morphology of E23 and microscopic examination of Gram staining

2.1.2 基于16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖2 可知：在KP 16S rRNA 基因序列進(jìn)化樹(shù)中，E23 基因序列(NMDC 登錄號(hào)：NMDCN 0000Q7L)與KP 模式菌株K.pneumoniaeNBRC 14940T(AB680713)穩(wěn)定地構(gòu)成一簇，并與Escherichia coli相區(qū)分。

圖2 基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)分析環(huán)境菌株E23 與其他近源種的親緣關(guān)系Fig.2 Phylogenetic tree reconstructed based on 16S rRNA gene sequences to analyze the relationship between the environmental strain E23 and its related bacterial species

2.2 血清型鑒定

由表5 可知：E23 菌株的醫(yī)院常見(jiàn)血清型(K1、K2、K5、K20、K54 和K57)均表現(xiàn)為陰性；陽(yáng)性對(duì)照E4 和R138 菌株K1 血清型擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性，其他血清型為陰性。

表5 不同來(lái)源KP 菌株的血清分型Tab.5 Capsular serotype of KP strains

2.3 E23 對(duì)玉米的致病性

KP 環(huán)境菌株E23 接種玉米2 d 后開(kāi)始發(fā)病，3～4 d 后出現(xiàn)葉片失綠變薄、缺刻和心葉扭曲等玉米細(xì)菌性頂腐病的典型癥狀(圖3a)；與接種RC4 和E4(陽(yáng)性對(duì)照)的玉米癥狀相同(圖3b)，其發(fā)病率均為100%。分離純化后的細(xì)菌在LB培養(yǎng)基上呈現(xiàn)Klebsiella屬細(xì)菌的典型菌落形態(tài)，回接健康玉米也表現(xiàn)出相同的癥狀。

圖3 接種KP 環(huán)境菌株第4 天后玉米發(fā)病癥狀Fig.3 Symptoms of maize on the 4th day after inoculated with environmental strain KP

3 討論

本研究結(jié)合細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及系統(tǒng)發(fā)育分析，將從草莓大棚土壤表面分離得到菌株E23 鑒定為肺炎克雷伯氏菌(KP)。研究表明：KP 廣泛存在于自然界，土壤也是其常見(jiàn)的非臨床棲息地之一，具有極強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性[16]；但本研究從32 個(gè)樣本中僅分離到1 株KP，其原因可能是新型冠狀病毒肺炎疫情期間校園內(nèi)定期對(duì)露天環(huán)境進(jìn)行消殺所致，而分離出KP 的土樣來(lái)源于市售腐殖質(zhì)土，且用于大棚內(nèi)種植草莓，并未進(jìn)行消毒。該土壤帶菌的原因可能是土壤未能充分腐熟，使KP 殘留其中。草莓坐果后，土壤中的KP 能夠隨著灌溉水的飛濺污染草莓果實(shí)，又因草莓為鮮食漿果，沒(méi)有果皮，若不能將KP 徹底清除，食用后易導(dǎo)致腹痛和腹瀉等食物中毒癥狀，對(duì)人體健康具有潛在威脅。目前，各地由于食用被KP 污染的新鮮果蔬所導(dǎo)致的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生[23]。戴寶玲等[24]推測(cè)楊梅上檢出KP 是由于在采摘、包裝和加工過(guò)程中徒手操作或包裝物污染所致。因此，鮮食果蔬上市前有必要進(jìn)行KP 檢測(cè)[23]，并進(jìn)一步加強(qiáng)食品安全監(jiān)督，制定市場(chǎng)標(biāo)準(zhǔn)并嚴(yán)格執(zhí)行。

目前，KP 對(duì)人和動(dòng)物的致病機(jī)理及血清分型等研究已取得了一定進(jìn)展，但有關(guān)KP 跨界侵染植物的研究卻相對(duì)較少。有研究顯示：生態(tài)適應(yīng)性是KP 跨界侵染玉米的生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)[3]，且同為K1 血清型的臨床菌株和環(huán)境菌株以及非醫(yī)院常見(jiàn)血清型的玉米細(xì)菌性頂腐病病原KpC4 對(duì)小白鼠和玉米均有較高的致病性[3,20]。本研究表明：E23 菌株不具有醫(yī)院常見(jiàn)的血清型，在人工接種條件下能夠?qū)е掠衩壮霈F(xiàn)葉片失綠變薄、缺刻和心葉扭曲等玉米細(xì)菌性頂腐病的典型癥狀，表明不同來(lái)源的KP 都可以侵染玉米。了解不同來(lái)源KP 菌株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及血清分型對(duì)玉米細(xì)菌性頂腐病的病原學(xué)和流行學(xué)研究以及玉米細(xì)菌性頂腐病的防控具有重要意義，課題組將進(jìn)一步進(jìn)行E23 毒力基因的研究并分離鑒定更多的KP 環(huán)境菌株，為研究KP 跨界侵染玉米的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

分離自昆明學(xué)院南苑大棚草莓土壤表面的E23 菌株鑒定為肺炎克雷伯氏菌。E23 在人工接種條件下能夠?qū)е掠衩装l(fā)病，其癥狀與玉米細(xì)菌性頂腐病癥狀相同。E23 不具有醫(yī)院常見(jiàn)血清型(K1、K2、K5、K20、K54 和K57)。