陳宇軒，任明見(jiàn),2，李魯華,2，徐如宏,2

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.國(guó)家小麥改良中心貴州分中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

小麥(Triticum aestivumL.)是世界范圍內(nèi)種植最廣泛的糧食作物之一，其在不同生態(tài)條件下的適應(yīng)性主要由開(kāi)花和成熟時(shí)間決定[1]，并與含有的春化及光周期基因密切相關(guān)。春化和光周期基因又通過(guò)影響小麥的抽穗期和開(kāi)花期表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境條件的不同適應(yīng)性，直接或間接影響小麥的品質(zhì)和產(chǎn)量[2-5]。春化和光周期基因作為控制小麥生長(zhǎng)發(fā)育的重要基因，與小麥對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性緊密相關(guān)，研究春化和光周期基因的組成對(duì)小麥育種、引種和推廣具有重要意義[6]。

目前，春化和光周期基因的組成已基本明確。在小麥中，春化基因由Vrn1、Vrn2、Vrn3和Vrn4組成，其中Vrn1、Vrn2和Vrn3在通過(guò)春化作用誘導(dǎo)小麥開(kāi)花的途徑中起主要作用[7]。Vrn1在決定小麥冬春性中占主導(dǎo)地位，其基因座上存在3 個(gè)基因位點(diǎn)：VRN-A1、VRN-B1和VRN-D1，分別位于小麥5A、5B 和5D 染色體長(zhǎng)臂。其中，VRN-A1位點(diǎn)存在3 個(gè)能完全消除春化性狀的顯性變異位點(diǎn)Vrn-A1a、Vrn-A1b和Vrn-A1c以及 1個(gè)隱性等位變異vrn-A1[8]，而VRN-B1和VRN-D1上的顯性變異位點(diǎn)Vrn-B1和Vrn-D1只能導(dǎo)致部分春化性狀消失。Vrn2是一種開(kāi)花抑制因子，位于5A 染色體長(zhǎng)臂，其表達(dá)水平經(jīng)過(guò)春化作用后下調(diào)[9]，但當(dāng)植物在春化過(guò)程中和春化后經(jīng)歷高溫時(shí)，Vrn2的表達(dá)水平會(huì)被重新上調(diào)[10]。Vrn3與擬南芥光周期基因FT(flowering locusT)同源，其基因產(chǎn)物作為移動(dòng)信號(hào)蛋白發(fā)揮作用，從葉片移動(dòng)到莖尖分生組織，加速小麥開(kāi)花[11]。目前，主要春化基因Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和VRN3的同源基因Vrn-B3的相關(guān)分子標(biāo)記已被開(kāi)發(fā)[11-13]，可用于小麥春化基因的鑒定。小麥光周期基因型主要由位于2D、2B 和2A 染色體上的Ppd-D1、Ppd-B1和Ppd-A1基因所決定，其中光周期不敏感型基因能減少小麥對(duì)光照的依賴(lài)，而Ppd-D1基因位點(diǎn)攜帶了最有效的光周期不敏感型等位基因Ppd-D1a，能加快小麥開(kāi)花并加速小穗 發(fā) 育[14]。BEALES 等[15]和NISHIDA 等[16]開(kāi) 發(fā)了Ppd-A1、Ppd-B1和Ppd-D1位點(diǎn)相關(guān)的分子標(biāo)記，可用于檢測(cè)小麥品種的光周期基因型。

近年來(lái)，不少學(xué)者針對(duì)小麥春化或光周期基因開(kāi)展了相關(guān)研究。CHUMANOVA 等[2]研究了不同顯性VRN等位基因及其組合對(duì)普通小麥生育期和產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)Vrn-B1c 系的產(chǎn)量最高；KISS 等[17]對(duì)188 份冬小麥遺傳多樣性分析表明：小麥春化或光周期基因在不同類(lèi)群中的基因頻率存在差異，并引起抽穗期的差異。劉政等[18]研究表明：春化及光周期基因?qū)夂霞爱a(chǎn)量性狀有一定影響，攜帶vrn-D1基因的品種具有高且穩(wěn)定的光合能力及產(chǎn)量水平。游銀等[19]對(duì)黃淮麥區(qū)部分骨干品種的春化和光周期特性進(jìn)行了研究，并開(kāi)展了相關(guān)基因等位類(lèi)型分析及全基因組優(yōu)異位點(diǎn)挖掘。朱雪成[20]利用春化基因及光周期基因的分子標(biāo)記對(duì)選自江蘇境內(nèi)的114 份小麥品種(系)進(jìn)行檢測(cè)，研究了春化和光周期基因的分布情況。付亮等[21]分析了近年來(lái)河南省小麥新品種春化基因組成及其與品種的冬春性、苗穗期及產(chǎn)量性狀的相關(guān)性。前人的這些研究進(jìn)一步證實(shí)春化和光周期基因組成對(duì)小麥品種的適應(yīng)性具有重要影響，但目前有關(guān)貴州小麥春化和光周期基因組成和分布的研究鮮有報(bào)道。貴州生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，處于氣候潮濕多雨的西南麥區(qū)，在小麥灌漿成熟期也經(jīng)常會(huì)遇到延綿不斷的陰雨天，影響小麥產(chǎn)量及品質(zhì)[22-23]。因此，本研究利用小麥春化和光周期基因相關(guān)分子標(biāo)記，對(duì)272 份小麥品種(系)的春化和光周期基因等位變異類(lèi)型進(jìn)行鑒定，并結(jié)合田間鑒定結(jié)果分析春化和光周期基因在田間自然條件下與小麥抽穗期和開(kāi)花期的相關(guān)性，旨在了解春化和光周期基因的組成，探討貴州小麥春化和光周期基因?qū)Τ樗肫诤烷_(kāi)花期的效應(yīng)，為貴州小麥生態(tài)適應(yīng)性品種的選育和利用提供數(shù)據(jù)支持和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用貴州省內(nèi)和部分省外共272 份小麥品種(系)作為供試材料，均由國(guó)家小麥改良中心貴州分中心選育，其中省內(nèi)小麥材料142 份，省外小麥材料130 份(表1)。

表1 供試材料Tab.1 Tested materials

表1 (續(xù))

表1 (續(xù))

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 提取

每份材料隨機(jī)取15 粒種子進(jìn)行發(fā)芽，采用植物基因組DNA 提取試劑盒提取其DNA，利用分光光度計(jì)檢測(cè)其含量，并稀釋至50 ng/μL 備用。植物基因組DNA 提取試劑盒和2×TaqPCR Master Mix 反應(yīng)試劑均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；DL2000 DNA Marker 購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；50×TAE 溶液購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司 。

1.2.2 分子標(biāo)記檢測(cè)

所用引物均由上海生物工程有限公司合成，引物詳情見(jiàn)表2。以1.2.1 節(jié)提取的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為10 μL，包括：10×PCR 緩沖液1.2 μL，25 μmol/L dNTPs 0.2 μL，TaqDNA 聚合酶1 U，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，模板DNA 50～100 ng，其余用ddH2O 補(bǔ)足。

表2 引物信息Tab.2 Primers information

VRN-A1、VRN-B1、VRN-B3、VRN-D1、Ppd-A1和Ppd-D1位點(diǎn)PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，在不同退火溫度(表1)下退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。Ppd-B1位點(diǎn)反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，70 ℃退火1 min(每循環(huán)降1 ℃)，72 ℃延伸1 min，10 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)時(shí)以ddH2O 代替模板DNA 作為空白對(duì)照，防止試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)誤差。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，80 V 電壓電泳10 min，100 V 電壓電泳40 min，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并統(tǒng)計(jì)帶型。

1.2.3 田間抽穗期和開(kāi)花期的觀察鑒定

于2020 年11 月—2021 年6 月將供試材料種植于國(guó)家小麥改良中心貴州分中心試驗(yàn)地，不同品種分行種植，行長(zhǎng)1 m，寬20 cm，以1 行中50%以上麥穗由葉鞘露出葉長(zhǎng)的1/2 作為抽穗期標(biāo)準(zhǔn)，以1 行中50%以上麥穗中上部小花的內(nèi)外穎張開(kāi)和花藥散粉作為開(kāi)花期標(biāo)準(zhǔn)[24]，于田間觀察并記錄各品種的抽穗期和開(kāi)花期。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

記錄供試品種的基因型、抽穗期和開(kāi)花期，利用SPSS 19 分析春化基因和光周期基因與抽穗期和開(kāi)花期的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 春化基因VRN-A1位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

利用3 對(duì)引物(VRNA1F 和VRNA1R、VRNA1F1 和VRNA1R1、VRNA1F2 和VRNA1R2)對(duì)所有供試材料檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：貴綠麥、Ciano、Banks和寧春13 等4 個(gè)品種在VRN-A1位點(diǎn)擴(kuò)增出(965+876)bp 的條帶，攜帶顯性等位基因Vrn-A1a的占1.5%，其余貴麥1 號(hào)等268 份供試材料均擴(kuò)增出734 bp 的條帶，攜帶Vrn-A1c或vrn-A1顯性等位基因。后續(xù)268 份供試材料均擴(kuò)增出1 068 bp的條帶，說(shuō)明這些材料中均攜帶隱性等位基因vrn-A1。部分VRN-A1位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 部分小麥品種VRN-A1 位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection results of VRN-A1 locus in some wheat varieties

2.1.2 春化VRN-B1位點(diǎn)鑒定

利用2 對(duì)引物(VRNB1F、VRNB1R 和VRNB1F1、VRNB1R1)分別對(duì)所有供試材料檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：貴紫麥1 號(hào)等145 份供試材料在VRN-B1位點(diǎn)擴(kuò)增出709 bp 的條帶，攜帶顯性等位基因Vrn-B1的占53.3%；貴農(nóng)775 等127 份供試材料擴(kuò)增出1149 bp 的條帶，攜帶隱性等位基因vrn-B1的占46.7%。部分VRN-B1位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 部分小麥品種VRN-B1 位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection results of VRN-B1 locus in some wheat varieties

2.1.3 春化VRN-B3位點(diǎn)鑒定

利用2 對(duì)引物(VRNB3F、VRNB3R 和VRNB-3F1、VRNB3R1)分別對(duì)所有供試材料檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：所有供試材料在VRN-B3位點(diǎn)均擴(kuò)增出1140 bp的條帶，均攜帶隱性等位基因vrn-B3。部分VRNB3位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 部分小麥品種VRN-B3 位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of VRN-B3 locus in some wheat varieties

2.1.4 春化VRN-D1位點(diǎn)鑒定

利用2 對(duì)引物(VRND1F、VRND1R 和VRND1F1、VRND1R1)分別對(duì)所有供試材料檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：貴州本地小麥等132 份供試材料在VRN-D1位點(diǎn)擴(kuò)增出1 671 bp 的條帶，攜帶顯性等位基因Vrn-D1的占48.5%；中燕特大粒等140 份供試材料擴(kuò)增出997 bp 的條帶，攜帶隱性等位基因vrn-D1的占51.5%。部分VRN-D1位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 部分小麥品種VRN-D1 位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of VRN-D1 locus in some wheat varieties

2.1.5 光周期Ppd-A1位點(diǎn)鑒定

利用2 對(duì)引物(PpdA1F、Ppd-A1R、Ppd-A1F和Ppd-A1R)分別對(duì)所有供試材料檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：所有供試材料在Ppd-A1位點(diǎn)均擴(kuò)增出299 bp 的條帶，均攜帶光敏感敏感型等位變異Ppd-D1b。部分Ppd-A1位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 部分小麥品種Ppd-A1 位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection results of Ppd-A1 locus of some wheat varieties

2.1.6 光周期Ppd-B1位點(diǎn)鑒定

利用引物PpdB1F 和Ppd-B1R 對(duì)所有供試材料檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：所有供試材料在Ppd-B1位點(diǎn)均擴(kuò)增出312 bp 的條帶，均攜帶光敏感敏感型等位變異Ppd-B1b。部分Ppd-B1位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 部分小麥品種Ppd-B1 位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Detection results of Ppd-B1 locus in some wheat varieties

2.1.7 光周期Ppd-D1位點(diǎn)鑒定

利用2 對(duì)引物(Ppd-D1F、Ppd-D1R 和Ppd-D1F、Ppd-D1R)分別對(duì)所有供試材料檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：川育38、毛穎阿夫和Gabo 等3 份供試材料在Ppd-D1位點(diǎn)擴(kuò)增出414 bp 的條帶，攜帶光敏感型等位變異Ppd-D1b的占1.1%；其余貴農(nóng)18 等269 份供試材料擴(kuò)增出288 bp 的條帶，攜帶光不敏感型等位變異Ppd-D1a的占98.9%。部分Ppd-D1位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 部分小麥品種Ppd-D1 位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Detection results of Ppd-D1 locus in some wheat varieties

2.2 春化和光周期基因分布頻率分析

由表3 可知：在春化基因顯性等位基因中，僅貴綠麥、Ciano、Banks 和寧春13 等4 份材料攜帶Vrn-A1a，其中貴綠麥為貴州小麥品種，Vrn-B1和Vrn-D1在貴州品種中的分布頻率分別為85.2%和55.6%，均高于省外品種，沒(méi)有檢測(cè)到Vrn-B3；在光周期基因Ppd-D1位點(diǎn)，所有供試材料中僅Gabo、川育38 和毛穎阿夫等3 份材料檢測(cè)出攜帶光敏感型基因Ppd-D1b，且均為省外品種，其余光周期基因位點(diǎn)均為Ppd-A1b+PpdB1b等位變異。

表3 春化和光周期等位基因分布頻率Tab.3 Distribution frequency of vernalization and photoperiod allele

2.3 春化和光周期基因組成類(lèi)型分析

由表4 可知：貴州省小麥品種存在5 種等位基因類(lèi)型，其中vrn-A1/Vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3+Ppd-A1b/Ppd-B1b/Ppd-D1a和vrn-A1/Vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3+Ppd-A1b/Ppd-B1b/Ppd-D1a為主要的2 種類(lèi)型，共占84.5%；省外品種選自不同地區(qū)，多為冬性和半冬性品種，存在8 種等位變異組合類(lèi)型，其中vrn-A1/vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3+Ppd-A1b/Ppd-B1b/Ppd-D1a和vrn-A1/vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3+Ppd-A1b/Ppd-B1b/Ppd-D1a為主要的2 種類(lèi)型，共占78.4%，其余組合類(lèi)型均低于10%。

表4 春化和光周期等位基因組合Tab.4 Allele combinations of vernalization and photoperiod genes

2.4 春化和光周期基因與抽穗期和開(kāi)花期的相關(guān)性

由表5 可知：272 份小麥品種(系)的抽穗天數(shù)和開(kāi)花天數(shù)都有明顯差異。

表5 省內(nèi)外品種抽穗期和開(kāi)花期比較Tab.5 Comparison of heading stage and flowering stage of varieties inside and outside the province

由表6 可知：Vrn-B1與抽穗期呈極顯著負(fù)相關(guān)，與開(kāi)花期無(wú)顯著相關(guān)性；Vrn-D1顯性等位基因與抽穗期和開(kāi)花期呈極顯著負(fù)相關(guān)；當(dāng)材料中同時(shí)存在Vrn-B1和Vrn-D1等位基因時(shí)，與抽穗期和開(kāi)花期呈極顯著負(fù)相關(guān)，且它們之間存在加性效應(yīng)。在本研究試驗(yàn)材料中，攜帶光敏感型等位變異Ppd-D1b的品種均同時(shí)攜帶了可以使抽穗期和開(kāi)花期提前的Vrn-D1或Vrn-B1，但對(duì)供試材料Ppd-D1b與抽穗期和開(kāi)花期的相關(guān)性分析結(jié)果表明：Ppd-D1b與抽穗期和開(kāi)花期均呈極顯著正相關(guān)。因此，可推測(cè)Ppd-D1位點(diǎn)對(duì)小麥抽穗期和開(kāi)花期的影響程度可能高于Vrn-B1和Vrn-D1。

表6 春化與光周期基因位點(diǎn)相關(guān)性分析Tab.6 Correlation analysis between vernalization and photoperiodic gene loci

進(jìn)一步分析結(jié)果顯示：與全部攜帶隱性等位基因的小麥品種相比，攜帶單一顯性等位基因Vrn-B1的小麥品種抽穗期和開(kāi)花期分別提前1.6和0.7 d，攜帶單一顯性等位基因Vrn-D1的小麥品種分別提前2.6 和2.7 d，同時(shí)攜帶Vrn-B1和Vrn-D1的小麥品種分別提前3.8 和4.0 d。

3 討論

小麥屬于長(zhǎng)日照植物，不同小麥品種對(duì)光周期的響應(yīng)差異較大，攜帶光周期不敏感型基因的品種在長(zhǎng)或短日照下均能開(kāi)花，具有較好的適應(yīng)性[25]，更受小麥育種者的青睞。在本研究的所有材料中，效應(yīng)最強(qiáng)的Ppd-D1位點(diǎn)由光周期不敏感型基因Ppd-D1a占主導(dǎo)地位，僅極少數(shù)材料攜帶光敏感型基因Ppd-D1b，Ppd-A1和Ppd-B1位點(diǎn)上則均攜帶Ppd-A1b和Ppd-B1b基因，這與韓領(lǐng)鋒等[26]對(duì)西南麥區(qū)部分地區(qū)的小麥品種檢測(cè)結(jié)果相近。ZHANG 等[27]檢測(cè)了中國(guó)不同麥區(qū)的春化基因分布頻率，檢測(cè)到西南冬麥區(qū)中春化基因vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和Vrn-B3的分布頻率分別為15.2%、42.4%、78.8%和0。在本研究中，Vrn-B3基因的分布頻率與ZHANG 等[27]的研究結(jié)果一致，均為0；而貴州小麥品種的其余春化顯性等位基因中Vrn-B1的分布頻率最高(85.2%)，其次是Vrn-D1(55.6%)和Vrn-A1a(0.7%)，與ZHANG 等[27]的研究結(jié)果存在部分差異，其原因可能與其供試材料中無(wú)貴州品種或與貴州獨(dú)特的光溫條件有關(guān)。

田芳慧等[28]研究發(fā)現(xiàn)：春化基因Vrn-B1、Vrn-D1和光周期基因Ppd-D1a與小麥抽穗期顯著相關(guān)；朱雪成[20]則認(rèn)為：Vrn-B1基因與小麥抽穗期并不存在顯著相關(guān)性。本研究認(rèn)為：Vrn-B1、Vrn-D1和Ppd-D1b與小麥抽穗期顯著相關(guān)，Vrn-D1和Ppd-D1b與小麥開(kāi)花期顯著相關(guān)，且Vrn-B1和Vrn-D1間存在加性效應(yīng)，并推測(cè)Ppd-D1b對(duì)于小麥抽穗期和開(kāi)花期的影響程度高于Vrn-B1或Vrn-D1。但本研究中的開(kāi)花期和抽穗期田間觀察結(jié)果只有1 年，相關(guān)性分析結(jié)果的精確性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

貴州小麥在灌漿成熟期間經(jīng)常遭遇陰雨天氣，降水過(guò)多，產(chǎn)生漬害的同時(shí)還易引起病蟲(chóng)害，影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[23]。合理的春化和光周期基因組合能讓小麥避開(kāi)極端天氣，達(dá)到豐產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的作用。目前，貴州小麥品種中含有春化和光周期等位基因類(lèi)型和組合較省外品種少，其中，光周期等位基因組合僅有Ppd-A1b+Ppd-B1b+Ppd-D1a類(lèi)型。

光周期不敏感型等位變異基因Ppd-A1a和Ppd-B1a以及春化顯性等位基因Vrn-B3在中國(guó)出現(xiàn)的頻率較低，且由于本研究中檢測(cè)的省外小麥品種缺乏廣泛性，故在供試材料中未檢測(cè)到這些基因，此類(lèi)基因構(gòu)成的組合類(lèi)型對(duì)小麥開(kāi)花和抽穗期的效應(yīng)關(guān)系尚未清楚。此外，在春化和光周期基因中還可能存在新的等位變異[29-31]，這些不同的等位變異類(lèi)型影響小麥的生育周期，為育種工作者選育適合各地區(qū)的品種提供了更多可能性。因此，今后貴州的育種工作應(yīng)多引進(jìn)省外不同春化和光周期基因類(lèi)型的小麥品種，為貴州各地區(qū)選育適合當(dāng)?shù)貧夂驐l件的小麥品種提供參考。

4 結(jié)論

貴州小麥中春化基因類(lèi)型和組合較省外品種少，光周期基因組合類(lèi)型僅有Ppd-A1b+Ppd-B1b+Ppd-D1a，種質(zhì)資源有待進(jìn)一步豐富。其中，春化顯性基因Vrn-B1與小麥抽穗期顯著相關(guān)，春化顯性基因Vrn-D1和光周期敏感型基因Ppd-D1b與小麥抽穗期和開(kāi)花期顯著相關(guān)，可影響小麥的抽穗期和開(kāi)花期。