段強(qiáng) 馮群燕

[摘要]目的：研究葛根素對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）中磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路激活狀態(tài)的干預(yù)作用。方法：收集人CSCC組織（52例）及正常皮膚組織（35例），培養(yǎng)人CSCC細(xì)胞株SCL-1、A431、HSC-5和人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞，檢測(cè)p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平;SCL-1細(xì)胞進(jìn)行分組，用不同劑量葛根素（20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）處理，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照（NC）質(zhì)?；騊I3K質(zhì)粒，檢測(cè)細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目及p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平;BALB/c-nu裸鼠皮下注射SCL-1細(xì)胞建立移植瘤模型，100 mg/kg葛根素灌胃處理3周后檢測(cè)移植瘤質(zhì)量、體積及p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平。結(jié)果：人CSCC組織中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平高于正常皮膚組織（P<0.05）;人CSCC細(xì)胞株中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平高于HaCaT細(xì)胞且SCL-1中p-PI3K、p-AKT表達(dá)上調(diào)最顯著（P<0.05）;不同劑量葛根素處理后，SCL-1細(xì)胞的增殖活力、侵襲數(shù)目及p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平均降低（均P<0.05）;轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，PI3K質(zhì)粒+80μmol/L葛根素組SCL-1細(xì)胞的增殖活力、侵襲數(shù)目高于NC質(zhì)粒+80μmol/L葛根素組（P<0.05）;葛根素組裸鼠的移植瘤質(zhì)量、體積及p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：PI3K/AKT信號(hào)通路過度激活與CSCC發(fā)病有關(guān)，葛根素通過抑制該通路發(fā)揮抗CSCC作用。

[關(guān)鍵詞]皮膚鱗狀細(xì)胞癌;葛根素;增殖;侵襲;PI3K/AKT信號(hào)通路

[中圖分類號(hào)]R739.5? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2022）04-0105-04

Activation Status of PI3K/AKT Signaling Pathway in Human Cutaneous Squamous Cell Carcinoma and the Intervention Effect of Puerarin

DUAN Qiang，F(xiàn)ENG Qunyan

（Department of Dermatology，Xianyang Central Hospital，Xianyang 712000，Shaanxi，China）

Abstract： Objective To study the intervention effect of puerarin on the activation status of phosphatidylinositol-3 kinase （PI3K） / protein kinase B （AKT） signaling pathway in human? cutaneous squamous cell carcinoma（CSCC）. Methods human CSCC tissues （52 cases）and normal skin tissues （35 cases） were collected， human CSCC cell lines SCL-1， A431， HSC-5 and human immortalized keratinocyte line HaCaT were cultured. Then the expression levels of p-PI3K and p-AKT were detected. SCL-1 cells were divided into groups， treated with different doses of Puerarin （20 μmol/L， 40 μmol/L， 80 μmol/L）， and transfected with negative control （NC） plasmid or PI3K plasmid. Then the proliferation viability， invaded numbers， the expression levels of p-PI3K and p-AKT were detected. The transplanted tumor model was established by subcutaneous injection of SCL-1 cells into BALB /c-nu nude mice， 100 mg/kg puerarin was given by gavage for 3 weeks and the weight and volume of transplanted tumor， the expression levels of p-PI3K and p-AKT were detected. Results The expression levels of p-PI3K and p-AKT in human CSCC tissue were higher than those in normal skin tissue （P<0.05）， the expression levels of p-PI3K and p-AKT in human CSCC cell line were higher than those in HaCaT cell line （P<0.05）， and the expression levels of p-PI3K and p-AKT in SCL-1 were up-regulated most significantly（P<0.05）. After different doses of puerarin treatment， the proliferation viability， invaded number and the expression levels of p-PI3K and p-AKT in SCL-1 cells decreased （all P<0.05）.After plasmid transfection， the proliferation viability， invaded number of PI3K plasmid+80 μmol/L puerarin group were higher than those in NC plasmid+80 μmol/L puerarin group（P<0.05）. The weight and volume of transplanted tumor and the expression levels of p-PI3K and p-AKT in puerarin group were lower than those in control group （P<0.05）. Conclusion The overactivation of PI3K/AKT signaling pathway relates to the pathogenesis of CSCC. Puerarin exerts its anti CSCC effect by inhibiting this pathway.

Key words： cutaneous squamous cell carcinoma; puerarin; proliferation; invasion; PI3K/AKT signaling pathway

人皮膚鱗狀細(xì)胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）是常見的皮膚惡性腫瘤之一，起源于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)。其惡性程度高、生長(zhǎng)迅速，發(fā)病受到多種因素的影響，涉及復(fù)雜生物信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的異常激活[1-2]。磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的重要信號(hào)通路，該通路的異常激活與食管鱗狀細(xì)胞癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]。CSCC相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)PI3K/AKT通路抑制劑LY294002對(duì)CSCC細(xì)胞的增殖和侵襲具有抑制作用[5]，提示PI3K/AKT通路是CSCC潛在的治療靶點(diǎn)。

葛根是臨床上應(yīng)用廣泛的中藥材，其活性成分葛根素被證實(shí)具有抗腫瘤作用，國(guó)內(nèi)李冰的研究證實(shí)葛根素對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲具有抑制作用，抑制PI3K/AKT通路是與之相關(guān)的分子機(jī)制[6]。目前，CSCC發(fā)病過程中PI3K/AKT通路的變化及葛根素的治療價(jià)值均不清楚。因此，本研究將通過一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探究CSCC中PI3K/AKT信號(hào)通路的狀態(tài)及葛根素對(duì)該通路的干預(yù)作用。

1? 材料和方法

1.1 臨床樣本：人CSCC組織為2017年4月-2020年6月在筆者醫(yī)院手術(shù)切除的標(biāo)本，均經(jīng)術(shù)后病理診斷為CSCC且術(shù)前未接受過放化療;人正常皮膚組織為同期在筆者醫(yī)院接受植皮手術(shù)的患者，均為全厚皮片。人CSCC組織共52例，其中男性患者34例、女性患者18例，年齡42～67歲、平均（58.69±10.28）歲;人正常皮膚組織共35例，其中男性18例、女性17例，年齡36～60歲、平均（52.03±11.31）歲。臨床樣本的收集及檢測(cè)均取得筆者所在醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株及動(dòng)物：人CSCC株SCL-1、A431、HSC-5和人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞（ATCC公司，美國(guó)）;BALB/c-nu裸鼠、雄性、8～10周齡、16只[菲諾克生物科技有限公司，上海，生產(chǎn)許可SCXK（滬）2018-0005]。

1.3 試劑與儀器：葛根素、結(jié)晶紫（Sigma公司）;陰性對(duì)照（Negative control，NC）質(zhì)粒、PI3K質(zhì)粒（生工生化公司，上海）;MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Promega公司，美國(guó)）;PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT一抗（CST公司，美國(guó)）;顯微鏡（尼康公司，日本）;凝膠電泳系統(tǒng)及成像系統(tǒng)（Bio-rad公司，美國(guó)）;酶標(biāo)儀（ABI公司，美國(guó)）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：SCL-1、A431、HSC-5、HaCaT細(xì)胞在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿90%后用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，接種在培養(yǎng)板內(nèi)用于p-PI3K、p-AKT表達(dá)的檢測(cè)。

另取消化傳代的SCL-1細(xì)胞進(jìn)行分組。為驗(yàn)證葛根素的調(diào)控作用，SCL-1細(xì)胞分為對(duì)照組及不同劑量葛根素組，對(duì)照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理，不同劑量葛根素組分別用含有20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L葛根素的培養(yǎng)基處理。為驗(yàn)證PI3K/AKT通路在葛根素發(fā)揮調(diào)控作用中的意義，SCL-1細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒的NC質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒并用80 μmol/L葛根素處理的NC質(zhì)粒+80 μmol/L葛根素組、轉(zhuǎn)染PI3K質(zhì)粒并用80 μmol/L葛根素處理的PI3K質(zhì)粒+80μmol/L葛根素組。

1.4.2 p-PI3K、p-AKT表達(dá)的檢測(cè)：取CSCC組織及正常皮膚組織，加入RIPA裂解液提取組織中的蛋白;收集培養(yǎng)板內(nèi)的細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞內(nèi)的蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果取20μg蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)電泳分離不同分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后封閉1 h、孵育一抗過夜，分別使用1：1 000稀釋的p-PI3K及p-AKT一抗、1：2 000稀釋的PI3K、AKT一抗、1：5 000稀釋的β-actin一抗。次日，孵育二抗1 h，最后在凝膠系統(tǒng)內(nèi)顯影，得到p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT、β-actin的條帶及吸光值，計(jì)算p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT作為p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平。

1.4.3 細(xì)胞增殖活力的檢測(cè)：SCL-1細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，按照1.4.1的方法分組干預(yù)24 h，采用MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒進(jìn)行增殖活力的檢測(cè)，按照試劑盒說明書進(jìn)行染色后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞孔490 nm波長(zhǎng)的吸光值A(chǔ)490。

1.4.4 細(xì)胞侵襲的檢測(cè)：收集分組干預(yù)后的SCL-1細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸并接種在Transwell上層小室內(nèi)，將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基放入Transwell下層小室內(nèi)以趨化上層小室內(nèi)的SCL-1細(xì)胞侵襲，12 h后取上層小室膜，4%多聚甲醛固定后用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察并對(duì)侵襲細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.5 成瘤能力的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：取BALB/c-nu裸鼠，在右背部皮下注射SCL-1細(xì)胞密度為5×107個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液100 μl。接種第15天時(shí)，移植瘤直徑約4 mm，將移植瘤裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和葛根素組，對(duì)照組給予20 ml/kg生理鹽水灌胃、1次/天，葛根素組給予含有100 mg/kg葛根素的生理鹽水（體積20 ml/kg）灌胃、1次/天，連續(xù)3周后解剖移植瘤并稱重、測(cè)量長(zhǎng)寬，計(jì)算移植瘤體積=0.5×長(zhǎng)×寬2。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 21.0軟件錄入數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料且經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 人CSCC組織與正常皮膚組織中p-PI3K、p-AKT表達(dá)的比較：人CSCC組織中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平高于正常皮膚組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 人CSCC細(xì)胞株和人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株中p-PI3K、p-AKT表達(dá)的比較：SCL-1、A431、HSC-5細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平高于HaCaT細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且SCL-1細(xì)胞中p-PI3K的表達(dá)水平高于A431、HSC-5細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且p-AKT的表達(dá)水平高于HSC-5細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與A431細(xì)胞比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

2.3 不同劑量葛根素對(duì)SCL-1細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT表達(dá)的影響：20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L葛根素處理后，SCL-1細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

2.4 不同劑量葛根素對(duì)SCL-1細(xì)胞增殖、侵襲的影響：20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L葛根素處理后，SCL-1細(xì)胞的A490水平、侵襲數(shù)目均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖4。

2.5 過表達(dá)PI3K對(duì)80 μmol/L葛根素抑制SCL-1細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT表達(dá)的影響：與NC質(zhì)粒組比較，NC質(zhì)粒+80μmol/L葛根素組SCL-1細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與NC質(zhì)粒+80 μmol/L葛根素組比較，PI3K質(zhì)粒+80 μmol/L葛根素組SCL-1細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.6 LY294002對(duì)葛根素抑制SCL-1細(xì)胞增殖、侵襲的影響：與NC質(zhì)粒組比較，NC質(zhì)粒+80 μmol/L葛根素組SCL-1細(xì)胞的A490水平、侵襲數(shù)目降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與NC質(zhì)粒+80 μmol/L葛根素組比較，PI3K質(zhì)粒+80μmol/L葛根素組SCL-1細(xì)胞的A490水平、侵襲數(shù)目增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.7 葛根素對(duì)SCL-1細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響：與對(duì)照組比較，葛根素組移植瘤小鼠的移植瘤體積及質(zhì)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.8 葛根素對(duì)移植瘤中p-PI3K、p-AKT表達(dá)的影響：與對(duì)照組比較，葛根素組移植瘤小鼠的移植瘤中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3? 討論

多數(shù)CSCC可以通過手術(shù)切除獲得根治、預(yù)后良好，但也有少部分CSCC患者會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[7-8]，因此需要尋找有效的輔助治療手段以抑制CSCC細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究將具有抗腫瘤作用的葛根素用于CSCC的治療，以PI3K/AKT信號(hào)通路為切入點(diǎn)，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究了葛根素的抗CSCC作用。

PI3K/AKT信號(hào)通路是目前已知在多種惡性腫瘤發(fā)病及病理進(jìn)展中起重要作用的通路。PI3K和AKT是該通路中主要的信號(hào)分子，以磷酸化的形式發(fā)生級(jí)聯(lián)激活，進(jìn)而啟動(dòng)下游cyclinD1、c-myc、β-catenin等原癌基因表達(dá)并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及侵襲、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[9-10]。在食管鱗癌[3]、宮頸鱗癌[4]、頭頸部鱗癌[11]等鱗狀細(xì)胞癌的病灶內(nèi)，p-PI3K、p-AKT的表達(dá)均明顯增加。本研究以正常皮膚組織為對(duì)照，檢測(cè)到CSCC組織中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)明顯增加;以人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT為對(duì)照，檢測(cè)到三種CSCC細(xì)胞株中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)明顯增加，表明PI3K/AKT通路的異常激活與CSCC的發(fā)病有關(guān)。

在三種CSCC細(xì)胞株中，SCL-1細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT表達(dá)增加最顯著，因此本研究繼續(xù)在該細(xì)胞株中觀察了葛根素的抗CSCC作用。鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的研究證實(shí)，葛根素對(duì)食管鱗癌細(xì)胞[6]、宮頸鱗癌細(xì)胞[12]的增殖、侵襲及細(xì)胞中PI3K/AKT通路的激活具有抑制作用。本研究將不同劑量的葛根素用于CSCC細(xì)胞株SCL-1的干預(yù)，結(jié)果顯示葛根素顯著抑制SCL-1細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)，同時(shí)也使細(xì)胞的增殖活力及侵襲數(shù)目降低，表明葛根素具有抗CSCC作用且這一作用可能與抑制PI3K/AKT通路激活有關(guān)，與既往文獻(xiàn)在其他類型鱗癌中觀察到的葛根素抗腫瘤作用及相關(guān)機(jī)制吻合。

PI3K/AKT通路的激活在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到促增殖、促侵襲作用。已有國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究證實(shí)，該通路的抑制劑LY294002顯著抑制多種鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖及侵襲[5，13-15]。本研究已經(jīng)證實(shí)葛根素抑制CSCC細(xì)胞增殖、侵襲及PI3K/AKT通路的激活，進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、過表達(dá)PI3K的方式驗(yàn)證PI3K/AKT通路在葛根素抑制CSCC細(xì)胞增殖、侵襲中的作用，過表達(dá)PI3K后p-PI3K、p-AKT的表達(dá)均增加，同時(shí)葛根素抑制SCL-1細(xì)胞增殖及侵襲的作用明顯減弱，表明葛根素至少部分通過抑制PI3K/AKT通路抑制SCL-1細(xì)胞的增殖及侵襲。最后，本研究還通過移植瘤小鼠驗(yàn)證了葛根素抗CSCC的作用，皮下注射建立CSCC移植瘤模型后給予葛根素灌胃干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植瘤體積、質(zhì)量及p-PI3K、p-AKT的表達(dá)均降低，表明葛根素能夠抑制CSCC移植瘤的生長(zhǎng)及PI3K/AKT通路的激活。

目前葛根素的臨床應(yīng)用主要集中在心血管疾病領(lǐng)域，葛根素注射液用于冠心病、心力衰竭的治療能夠改善血液流變學(xué)、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)[16-17]，但葛根素注射液在惡性腫瘤患者中的應(yīng)用尚缺乏臨床證據(jù)。盡管如此，本研究的上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)葛根素具有抗CSCC作用，在細(xì)胞水平葛根素顯著抑制CSCC細(xì)胞的增殖和侵襲，在動(dòng)物水平葛根素顯著抑制CSCC移植瘤的生長(zhǎng);同時(shí)，葛根素顯著抑制CSCC細(xì)胞及移植瘤中PI3K/AKT通路的激活，這是葛根素發(fā)揮抗CSCC作用的分子機(jī)制之一。未來(lái)，葛根素有望成為治療CSCC的備選藥物，但仍需更多的研究來(lái)將其推廣至臨床應(yīng)用。

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[收稿日期]2021-03-03

本文引用格式：段強(qiáng)，馮群燕.葛根素對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌中PI3K/AKT信號(hào)通路激活狀態(tài)的干預(yù)作用[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2022，31（4）：105-109.