劉艷晶，潘舒心，麻 琦，陳曉涵，鄧國華，施建忠，包紅梅，田國彬，曾顯營，陳化蘭

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150069）

禽流感（Avian influenza，AI）是由AI 病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的禽類的一種急性、高度接觸性傳染病。到目前為止，高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）已在全球超過60 個(gè)國家引發(fā)高致病性禽流感（HPAI）疫情，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。2004 年以來，為有效防控HPAI，我國主要采取疫苗免疫聯(lián)合撲殺感染家禽的綜合防控措施。AIV 在自然界中不斷進(jìn)化，抗原性逐漸發(fā)生變異，導(dǎo)致疫苗保護(hù)效果下降，需要不斷更新疫苗株，才能保障疫苗的免疫保護(hù)效果。2004 年以來，我國研制的一系列疫苗在家禽中大規(guī)模應(yīng)用，已取得理想防控效果[1]。

2013 年，我國出現(xiàn)H7N9 流感病毒感染并致人死亡的病例，隨后連續(xù)引起5 波次共1 564 人感染病例，其中第5 波次共有766 人感染，引起人們對下一波疫情會(huì)有更多人感染的擔(dān)憂。在人H7N9 流感疫情期間，人們由于恐懼而不敢食用家禽產(chǎn)品，造成禽蛋產(chǎn)品滯銷，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。2017 年初，H7N9亞型AIV 由低致病性突變?yōu)楦咧虏⌒?，并在多個(gè)省份的家禽中引起疫情[2-4]，導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失；研究還發(fā)現(xiàn)H7N9 亞型HPAIV 對人的危害更大[2]。國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室研制出重組AIV（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8 株+H7N9 H7-Re1 株），自2017年9 月在我國家禽中使用后有效抑制了H5 和H7 亞型AIV 在家禽中的流行，阻斷了人H7N9 流感疫情[5]。持續(xù)監(jiān)測數(shù)據(jù)表明：H5 和H7 亞型AIV 抗原性發(fā)生變異，為了達(dá)到良好免疫效果，將疫苗更新為重組AIV（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re3 株），并于2018 年底在家禽中應(yīng)用。

為升級疫苗生產(chǎn)工藝，提高疫苗生產(chǎn)過程中的生物安全防護(hù)和減少廢棄物處理，國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合相關(guān)生物制品企業(yè)研制出細(xì)胞源AIV（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re3 株）。本研究對3 批細(xì)胞源重組AIV（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re3 株）進(jìn)行免疫效力檢測，同時(shí)評估了其對2019 年監(jiān)測到的H7N9 亞型AIV 變異株及H5 亞型2.3.4.4h 分支、2.3.2.1d 分支的流行代表株的免疫保護(hù)性，為該疫苗進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 3 批細(xì)胞源AIV（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）（簡稱為細(xì)胞源三價(jià)疫苗）（2020001-s 批、2020002-s 批、2020003-s 批），由吉林冠界生物技術(shù)有限公司制備。SPF 雞胚、SPF 雞3 周齡、6 周齡SPF 雞均由依托中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的國家禽類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源庫提供。H5 亞型Re-11 株、Re-12 株HI 試驗(yàn)抗原和H7 亞型H7-Re3 株HI 試驗(yàn)抗原由國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室制備。本研究攻毒用病毒株信息見表1，各病毒株均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。

表1 H5和H7亞型AIV病毒株Table 1 The information of H5 and H7 subtype AIV strains

1.2 3 批細(xì)胞源三價(jià)疫苗效力試驗(yàn) 將90 只3 周齡SPF 雞隨機(jī)分成3 組，每組30 只，以頸部皮下注射途徑各接種1 批細(xì)胞源三價(jià)疫苗（0.3 mL/只）；另取相同日齡SFP雞30只，不接種疫苗，作為對照組。疫苗接種后21 d，采集所有試驗(yàn)雞血清，參照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T-18936-2003），分別利用H5亞型AIV Re-11株、Re-12 株和H7 亞型血凝抑制抗原測定每組雞的HI 抗體效價(jià)：免疫后21 d，各疫苗組和對照組隨機(jī)各選取10只雞，鼻腔感染H5亞型AIV DK/GZ/S4184/2017株（H5N6）含[100 半數(shù)雞致死量（CLD50）]，進(jìn)行疫苗對H5 亞型2.3.4.4h分支病毒的免疫效力檢驗(yàn)。同樣方式分別感染H5 亞型AIV 病毒CK/LN/SD007/2017 株（H5N1）（含100 CLD50）和CK/IM/SD010/2019（H7N9）（含100 CLD50），進(jìn)行疫苗對H5 亞型AIV 2.3.2.1d 分支病毒和H7N9 病毒的免疫效力檢驗(yàn)。攻毒后觀察14 d，攻毒后第3 d 和第5 d 采集每只雞喉頭和泄殖腔拭子，經(jīng)尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚進(jìn)行病毒滴定。

1.3 疫 苗 對H5 亞 型2.3.4.4h 和2.3.2.1d 分 支AIV 分離株的效力評估 選擇2020001-s 批三價(jià)疫苗以頸部皮下注射方式接種20 只3 周齡SPF 雞，接種劑量為0.3 mL/只， 20 只同日齡SPF 雞，不接種疫苗，作為對照組。各組接種后21 d，所有雞各采血分離血清，采用H5 亞型AIV（Re-11 株、Re-12 株）血凝抑制抗原測定該組雞的HI 抗體效價(jià)。具體試驗(yàn)方法根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T-18936-2003）進(jìn)行。同時(shí)，免疫后21 d，各疫苗組和對照組隨機(jī)各選取10 只雞，以鼻腔感染途徑分別感染H5亞型AIV 2.3.4.4h分支H5N6亞型AIV（DK/JX/S40947/2019 株，含105EID50）；另取10 只免疫雞和10 只對照雞，感染H5N1 亞型AIV 2.3.2.1d 分支（CK/LN/2/2019 株，含105EID50）。攻毒后第3 d 和第5 d 采集每只雞喉頭和泄殖腔拭子，經(jīng)尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚進(jìn)行排毒檢測，評估疫苗對H5 分離株的效力。

1.4 疫苗對H7 亞型AIV 分離株的免疫保護(hù)效力評估 將2020001-s 批三價(jià)疫苗以0.3 mL/只、肌肉注射途徑接種30只3周齡SPF 雞，并設(shè)30只同周齡SPF 雞不免疫作為對照組。免疫后3 周，采血并分離血清，用H7 亞型H7-Re3 株抗原檢測HI 抗體。采血后各疫苗組和對照組隨機(jī)各選取10 只雞，使用H7 亞型AIV PCK/LN/SD004/2019（H7N9）（105EID50）進(jìn) 行 攻 毒 試驗(yàn)；相同方法進(jìn)行疫苗對CK/LN/SD25/2019（H7N9）和DK/FJ/SE0195/2018（H7N2）分離株的攻毒試驗(yàn)。攻毒后觀察臨床癥狀和排毒檢測，方法同1.3。

2 結(jié) 果

2.1 3 批次疫苗接種SPF 雞后的HI 抗體檢測及效力試驗(yàn)結(jié)果 將3 批細(xì)胞源三價(jià)疫苗接種3 周齡SPF雞，免疫后3 周，采血分離血清，HI 抗體效價(jià)檢測結(jié)果顯示， 針對H5 亞型Re-11 株平均HI 抗體效價(jià)分別為8.1log2、7.9log2 和7.9log2，針對H5 亞型Re-12 株 平 均HI 抗 體 效 價(jià) 分 別 為8.3log2、7.9log2 和8.2log2，針對H7 亞型H7-Re3 株平均HI 抗體效價(jià)分別為7.7log2、7.7log2 和8.0log2，對照組HI 抗體效價(jià)均為陰性（圖1）。結(jié)果表明，3 批細(xì)胞源三價(jià)疫苗均具有良好的免疫原性。

圖1 三價(jià)疫苗免疫SPF雞后3周的HI抗體效價(jià)測定結(jié)果Fig.1 HI antibody detection of SPF chickens immunized with the trivalent vaccine at 3 weeks post vaccination

用DK/GZ/S4184/2017 株（H5N6，2.3.4.4h 分支）、CK/LN/SD007/2017（H5N1，2.3.2.1d 分 支）、CK/IM/SD010/2019（H7N9）效力檢驗(yàn)用病毒攻毒后14 d 觀察期內(nèi)，所有免疫組雞均全部健活，且未從免疫組雞喉頭和泄殖肛拭子分離到病毒；對照組雞在攻毒后2 d 開始發(fā)病，3 d 后開始出現(xiàn)死亡，并在攻毒后6 d全部發(fā)病死亡，而且病毒分離率為10/10（表2）。結(jié)果表明，3 批細(xì)胞源三價(jià)疫苗具有良好的免疫效力。

表2 3批細(xì)胞源三價(jià)疫苗的效檢檢測結(jié)果Table 2 The protection efficacy of the chickens immunized with cell-cultured trivalent vaccine

2.2 三價(jià)細(xì)胞源疫苗對H5 亞型2.3.4.4h 和2.3.2.1d分支AIV 流行株的免疫效力結(jié)果 將細(xì)胞源三價(jià)疫苗免疫3 周齡SPF 雞3 周后，采血分離血清測定HI抗體，結(jié)果顯示， 針對H5 亞型Re-11 株平均HI 抗體效價(jià)為7.8log2，針對Re-12 株平均HI 抗體效價(jià)為為8.1log2，對照組雞抗體均為陰性。結(jié)果表明細(xì)胞源三價(jià)疫苗對H5 亞型2.3.4.4h 和2.3.2.1d 分支AIV 流行株有良好的免疫原性。

免 疫21 d 時(shí) 感 染H5N6 亞 型2.3.4.4h 分 支AIV（DK/JX/S40947/2019 株）和H5N1 亞 型2.3.2.1d 分 支AIV（CK/LN/2/2019 株）后結(jié)果顯示，免疫組雞均全部健活，且均未分離到病毒；2 組對照組雞攻毒2 d 后開始發(fā)病，3 d 后開始出現(xiàn)死亡，4 d 全部發(fā)病、死亡，而且10/10 病毒分離陽性（表3）。上述結(jié)果表明細(xì)胞源三價(jià)疫苗針對H5 亞型2.3.4.4h 和2.3.2.1d 分支AIV 流行株具有良好免疫效力。

表3 三價(jià)疫苗免疫雞對H5亞型2.3.4.4h和2.3.2.1d分支AIV攻毒試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The protection efficacy of immunized chickens against the challenge of H5N6 subtype clade 2.3.4.4h andH5N1 clade 2.3.2.1d viruses isolated in poultry

2.3 三價(jià)細(xì)胞源疫苗對H7 亞型AIV 流行株的免疫效力結(jié)果 用3 批細(xì)胞源三價(jià)疫苗免疫3 周齡SPF 雞3 周后，采血分離血清，檢測針對H7 亞型AIV 的HI 抗體。結(jié)果顯示，細(xì)胞源三價(jià)疫苗免疫后3 周H7 亞型H7-Re3 株平均HI 抗體效價(jià)分別為7.7log2、7.9log2 和7.7log2，對 照 組 抗 體 均 為 陰 性，結(jié)果表明細(xì)胞源三價(jià)疫苗可誘導(dǎo)SPF 雞產(chǎn)生針對H7亞型AIV 的HI 抗體。

細(xì)胞源三價(jià)疫苗免疫21d 時(shí)分別攻擊2 株H7N9亞型AIV 抗原變異株（PCK/LN/SD004/2019 和CK/LN/SD25/2019）和1 株H7N2 亞型AIV（DK/FJ/SE0195/18）后結(jié)果顯示，免疫組雞均全部健活，且均未分離到病毒；3 組對照組雞攻毒2 d 后開始發(fā)病，3 d 后開始出現(xiàn)死亡，6 d 后雞全部發(fā)病、死亡，而且10/10 病毒分離陽性（表4）。上述結(jié)果表明，3批細(xì)胞源三價(jià)疫苗對H7亞型AIV抗原變異株具有良好免疫效果。

表4 三價(jià)疫苗免疫雞對H7N9分離株攻毒試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of protection efficacy of the trivalent vaccine-immunized chickens against the challenge of H7 subtype viruses

3 討 論

HPAIV 因其在禽類中傳播快、危害大、死亡率高，對人類和動(dòng)物的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，成為優(yōu)先防控的家禽傳染病。疫苗接種是一種重要的防控策略，可有效控制HPAI 疫情的暴發(fā)[6]。H5N1 亞型AIV引起的AI 疫情于2004 年出現(xiàn)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，2005 年針對該亞型AI 防控疫苗開始使用，并取得良好的效果[7-8]。但由于AIV 高度變異的特性，致其抗原性不斷發(fā)生變異，這就使得防控疫苗需要不斷更新，目前Re-11、Re-12 株疫苗被用于防控H5亞型HPAI[9]。2017 年初低致病性H7N9 亞型AIV 突變?yōu)镠PAIV，并導(dǎo)致我國多個(gè)省出現(xiàn)HPAI疫情[10]。針對H7 亞型AIV 的H5+H7 二價(jià)疫苗使用后，有效控制了我國家禽和人H7N9流感，但H7亞型疫苗株也在及時(shí)更新，H7-Re1 疫苗株于2018 年12 月更新為H7-Re2疫苗株，2020 年7 月又被更新為H7-Re3 疫苗株。因此，AI防控疫苗毒種的及時(shí)更新是保障疫苗免疫效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究中的細(xì)胞源三價(jià)滅活疫苗就是針對更新后的H7-Re3 疫苗株所作的免疫效力評估。

當(dāng)前用于防控禽流感的疫苗大多為雞胚生產(chǎn)，但雞胚生產(chǎn)工藝受到許多限制，比如：雞胚來源、大量雞胚殘?bào)w處理、難以進(jìn)行產(chǎn)量快速放大和智能化生產(chǎn)。而細(xì)胞懸浮培養(yǎng)作為一種新的疫苗生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)的禽流感疫苗與傳統(tǒng)方法相比具有生產(chǎn)周期短、疫苗質(zhì)量更容易控制、產(chǎn)量快速放大、無雞胚殘?bào)w處理、人力成本低等優(yōu)點(diǎn)。一種懸浮細(xì)胞生產(chǎn)重組AIV 滅活疫苗的方法已申請專利，表明無血清全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方法是切實(shí)可行的，該技術(shù)解決了傳統(tǒng)工藝的弊端，將有效推動(dòng)動(dòng)物疫苗生產(chǎn)工藝的升級。研究表明，從相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗免疫應(yīng)答效果和用雞胚生產(chǎn)的疫苗在安全性和免疫原性及免疫效果方面無顯著差異[11]。本研究中的細(xì)胞源三價(jià)滅活疫苗以0.3 mL 的劑量免疫SPF 雞21d后，測定的H5 亞型Re-11 株、Re-12 株和H7 亞型H7-Re3 株HI 抗體效價(jià)均在7.7log2 以上，產(chǎn)生的抗體比較均衡。將效力檢驗(yàn)用病毒株以100 CLD50采用鼻腔感染的方式攻擊免疫雞后，結(jié)果顯示免疫雞均獲得完全保護(hù)；在對近期流行株的保護(hù)效果試驗(yàn)中，免疫后的SPF 雞針對3 種抗原的HI 抗體效價(jià)均在8log2 以上，以105EID50攻擊AIV 后所有免疫組雞均獲得完全免疫保護(hù)。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，正如雞胚源疫苗一樣，細(xì)胞源疫苗也具有良好的安全性和免疫效果。

本研究評估了3 批細(xì)胞源AIV（H5+H7）三價(jià)滅活細(xì)胞疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re3 株）的免疫效力及疫苗對流行株的免疫保護(hù)性，結(jié)果表明該細(xì)胞源疫苗可以作為當(dāng)前防控我國H5亞型和H7 亞型AI 的疫苗，本研究數(shù)據(jù)為細(xì)胞疫苗生產(chǎn)工藝的大規(guī)模應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。