孫小飛，羅國(guó)瑞，李英美，張禹茜，宮慧慧，朱文慧，勵(lì)建榮，李學(xué)鵬*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧 錦州 121013 2 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇 連云港 222000 3 達(dá)蓮食品（錦州）有限公司 遼寧 錦州 121200）

仿刺參（Apostichopus japonicus）是一種主要分布于中國(guó)、俄羅斯、韓國(guó)和日本沿海的海參，是重要的海洋食品和藥物資源[1]。仿刺參中生物活性物質(zhì)的提取和利用一直備受關(guān)注，研究主要集中在仿刺參的體壁活性物質(zhì)方面[2-7]。性腺和腸道組織屬于仿刺參的內(nèi)臟，作為仿刺參加工過(guò)程中的副產(chǎn)物常常被丟棄，沒(méi)有得到有效利用，從而導(dǎo)致資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[8]。研究表明，仿刺參性腺不僅富含多糖，而且蛋白質(zhì)、脂肪酸和其它活性成分含量豐富，其中的蛋白質(zhì)更是優(yōu)質(zhì)多肽的來(lái)源[9-11]?，F(xiàn)代生物代謝研究表明，蛋白質(zhì)是通過(guò)消化酶作用以多肽的形式被人體吸收[12-13]。與蛋白質(zhì)相比，多肽更容易被人體吸收利用，并在人體代謝方面表現(xiàn)出更重要的生物活性，如抗衰老和抗氧化活性等[14-15]。

人體正常生理代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生少量的活性氧，包括羥基自由基（·OH）、超氧自由基（·O2-）和過(guò)氧化氫（H2O2）等，這些活性氧在人體中總是處于產(chǎn)生與消失的動(dòng)態(tài)平衡中[16-19]。研究表明，適量的活性氧對(duì)人體是有益的，通過(guò)控制氧自由基的產(chǎn)生，可以消除炎癥，增強(qiáng)免疫力以及抑制腫瘤。過(guò)量的活性氧則會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，擾亂人體正常的生理代謝活動(dòng)，從而造成機(jī)體損傷，導(dǎo)致各種疾病產(chǎn)生[20]。

目前，對(duì)于仿刺參的研究主要集中在體壁的組成成分及功能活性方面，而關(guān)于仿刺參性腺的研究很少[21-22]。仿刺參性腺包括卵子和精子，在收集過(guò)程中兩者極易混合在一起，對(duì)于仿刺參卵現(xiàn)有少量的研究成果，主要涉及其營(yíng)養(yǎng)成分組成[23-25]，而關(guān)于仿刺參精的活性研究暫未見報(bào)道。本研究中，仿刺參精被單獨(dú)收集，用木瓜蛋白酶水解，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法確定最佳水解條件。采用Pall Minimate 超濾系統(tǒng)對(duì)酶解液進(jìn)行處理，收集不同分子質(zhì)量范圍的多肽。據(jù)報(bào)道，不同分子質(zhì)量的多肽通常表現(xiàn)出顯著差異的抗氧化活性[26-28]?！2-是所有氧自由基中的第一個(gè)自由基，可經(jīng)一系列反應(yīng)生成其它氧自由基，具有很強(qiáng)的氧化能力?！H 是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧物種，幾乎與生物體內(nèi)所有物質(zhì)反應(yīng)，在活性氧中，它的危害最大。本研究測(cè)試了收集的3 種多肽對(duì)·O2-和·OH 的清除能力，以此考察它們的抗氧化活性。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

仿刺參精，采集于山東煙臺(tái)，采集時(shí)大部分仿刺參處于性腺成熟期。將仿刺參解剖后，收集仿刺參精并均質(zhì)，在-20 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

木瓜蛋白酶（酶活性：100 萬(wàn)U/g），中國(guó)南寧龐博生物工程有限公司；牛血清白蛋白，中國(guó)上海藍(lán)基科技發(fā)展有限公司；超氧自由基、羥基自由基檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；其它化學(xué)品和試劑均為分析純級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 仿刺參精的酶解 仿刺參精清洗干凈，瀝干水分后經(jīng)膠體磨研磨勻漿，準(zhǔn)確稱取仿刺參精勻漿液10 g，加入一定量的木瓜蛋白酶，混合均勻，在恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解，酶解完成后立即取出，將酶解液置于100 ℃水浴鍋中滅酶10 min。

1.2.2 水解度的測(cè)定 根據(jù)三氯乙酸（TCA）方法測(cè)定水解度[29]。取1 mL 酶解液加入1 mL 的10 g/100 mL 的TCA，混合振蕩，靜止10 min 后，10 000 r/min 離心10 min，取上清液以雙縮脲法測(cè)定可溶性蛋白含量，用凱氏定氮法測(cè)總蛋白含量[30]。按照式（1）計(jì)算水解度（DH）：

式中，ρ1——反應(yīng)后酶解液中可溶性蛋白含量（mg/mL）；ρ2——反應(yīng)前仿刺參精中可溶性蛋白含量 （mg/mL）；ρ0——仿刺參精中總蛋白含量（mg/mL）。

1.2.3 單因素研究 為了考察酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間3 個(gè)因素對(duì)水解度的影響，首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。制定酶解的基本條件為：酶解溫度65 ℃，加酶量（[E/S]）3%，時(shí)間5 h。固定其中2 個(gè)條件，改變另外1 個(gè)條件，分別考察不同的影響因素，各因素取值范圍如下：酶解溫度分別為50，60，65，70，80 ℃，加酶量分別為1%，2%，3%，4%，5%，時(shí)間分別為3，4，5，6，7 h。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化水解條件[31-32]在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解度為衡量指標(biāo)，選取酶解溫度、加酶量和時(shí)間3 個(gè)因素，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，選用木瓜蛋白酶，進(jìn)行酶解條件優(yōu)化。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分析3 個(gè)因素對(duì)水解度的影響，試驗(yàn)次數(shù)為17 次，其中析因部分試驗(yàn)次數(shù)12 次，中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)為5 次。

1.2.5 梯級(jí)肽的制備 將仿刺參精酶解液加蒸餾水稀釋2 倍，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，先用普通濾紙過(guò)濾，再依次用0.45 μm 和0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾。然后采用Pall Minimate 超濾系統(tǒng)，將過(guò)濾后的仿刺參精酶解液加到超濾杯中，安裝合適的切向流膜包，控制壓力在20～30 psig 進(jìn)行超濾，分別收集濾出液和截留液。選擇截留分子質(zhì)量為10 ku 的膜包超濾，超濾開始后，當(dāng)超濾杯中酶解液剩余1/5 時(shí)，收集過(guò)濾液，并將超濾杯中補(bǔ)充蒸餾水至初始體積，再次超濾，重復(fù)3次后停止超濾，收集每次過(guò)濾液（分子質(zhì)量＜10 ku 的多肽） 和截留液 （分子質(zhì)量＞10 ku 的蛋白質(zhì)）。再分別選用截留分子質(zhì)量為5 ku 和1 ku 的切向流膜包，最終制備出3 種不同分子質(zhì)量的多肽，將收集到的3 種多肽溶液真空冷凍干燥處理。

1.2.6 抗氧化活性測(cè)定

1.2.6.1 清除·O2-能力測(cè)定 模擬機(jī)體中黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生·O2-，加入電子傳遞物質(zhì)及Griess 顯色劑，使反應(yīng)體系呈紫紅色，用分光光度計(jì)測(cè)其在波長(zhǎng)550 nm 處的吸光度，計(jì)算出多肽對(duì)·O2-的抑制能力。在反應(yīng)系統(tǒng)中，每升樣品在37 ℃下反應(yīng)40 min 所抑制的·O2-相當(dāng)于1 mg的維生素C 所抑制的·O2-變化值為一個(gè)活力單位。按式（2）計(jì)算：

1.2.6.2 清除·OH 能力測(cè)定 利用Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生·OH，該反應(yīng)是最常見的產(chǎn)生·OH 的化學(xué)反應(yīng)，H2O2的量和該反應(yīng)產(chǎn)生的·OH 量成正比，當(dāng)給予電子受體后，用Griess 試劑顯色，形成紅色物質(zhì)，其呈色與·OH 的量成正比。按照試劑盒說(shuō)明依次加樣，于分光光度計(jì)波長(zhǎng)550 nm 處測(cè)定各管吸光度值。每毫升樣品在37 ℃下反應(yīng)1 min，使反應(yīng)體系中H2O2濃度降低1 mmol/L 為1 個(gè)抑制·OH 能力單位。按式（3）計(jì)算：

1.2.7 統(tǒng)計(jì)方法 每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，使用Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA）并求解回歸方程，P＜0.05 差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)仿刺參精酶解的影響

由圖1a 可知，隨著溫度升高，仿刺參精的水解度呈上升趨勢(shì)，在70 ℃時(shí)水解度達(dá)到最高；繼續(xù)升高溫度，水解度開始下降。木瓜蛋白酶在70℃時(shí)有很高的活力，同時(shí)高溫激活了仿刺參精中某些自溶酶，促進(jìn)了仿刺參精蛋白的降解，從而使70 ℃時(shí)仿刺參精的水解度達(dá)到最高。如果繼續(xù)升高溫度會(huì)增加加熱成本，也會(huì)對(duì)木瓜蛋白酶造成一定程度的變性影響，因此將木瓜蛋白酶最佳溫度控制在70 ℃左右。

酶與底物的比例對(duì)水解度也有顯著影響。如圖1b 所示，當(dāng)加酶量由1%增加到4%時(shí)，水解度隨著加酶量的增加而升高，當(dāng)加酶量增加到5%時(shí)，水解度變化不大。此時(shí)底物已經(jīng)接近飽和，再增大加酶量難以使水解度有明顯的提高，且增大加酶量會(huì)使生產(chǎn)成本增加，因此木瓜蛋白酶最佳加酶量控制在4%左右。

由圖1c 可知，反應(yīng)4 h 時(shí)水解度最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度呈下降趨勢(shì)。這可能是由于開始時(shí)酶與底物充分反應(yīng)，使水解度升高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，可能會(huì)出現(xiàn)過(guò)度酶解現(xiàn)象，多肽分解為氨基酸從而導(dǎo)致水解度下降，因此，最佳酶解時(shí)間控制在4 h 左右。

圖1 溫度（a）、加酶量（b）和時(shí)間（c）對(duì)水解度的影響Fig.1 Effects of temperature （a），[E/S]（b），and time on DH （c）

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，暫定如下參數(shù)條件：用木瓜蛋白酶水解仿刺參精時(shí)，適宜的酶解溫度為70 ℃，加酶量4%，反應(yīng)時(shí)間4 h。

2.2 回歸模型建立及響應(yīng)面分析

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察酶解溫度（X1）、加酶量（X2）和時(shí)間（X3）3 個(gè)變量對(duì)水解度的影響，計(jì)算二階多項(xiàng)式方程的系數(shù)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。水解度對(duì)應(yīng)的回歸方程為：

利用Design Expert 軟件對(duì)表1的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2所示?；貧w方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性，由F 檢驗(yàn)來(lái)判定，概率P 值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，P＜0.05 表示變量項(xiàng)顯著，P＞0.1 則代表變量項(xiàng)不顯著。由表2可知，本試驗(yàn)所選二次項(xiàng)模型F 值為43.89，具有高度顯著性（P＜0.0001）。在所有變量中，X2、X3、X1X2、X12、X22和X32對(duì)應(yīng)的P 值均小于0.05，說(shuō)明其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著。F 值為0.31 表明失擬項(xiàng)的影響不顯著。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.9826，表明水解度的變化有98.26%來(lái)源于所選變量，并且0.9257 的預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)與校正相關(guān)系數(shù)0.9602 值相吻合，因此，回歸方程可以很好地描述各變量與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以用該回歸方程確定最佳水解條件。此外，信噪比大于4 時(shí)所建立的模型可信，本試驗(yàn)的信噪比為19.768 遠(yuǎn)大于4，進(jìn)一步說(shuō)明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煽浚梢院芎玫胤磻?yīng)水解度與溫度、加酶量和時(shí)間之間的關(guān)系。在所選取的因素水平范圍內(nèi)，各變量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響作用依次為：加酶量＞時(shí)間＞溫度。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Box-Behnken design and results

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 2 ANOVA for DH response surface quadratic model

通過(guò)固定1 個(gè)變量值，考察另外2 個(gè)變量對(duì)水解度的影響來(lái)繪制響應(yīng)面圖，溫度、加酶量和時(shí)間對(duì)水解度的影響結(jié)果如圖2所示。隨著變量的改變，水解度首先呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)?shù)竭_(dá)最高點(diǎn)后開始下降。溫度和加酶量同時(shí)改變引起的水解度下降，可歸因于隨著溫度的升高，對(duì)酶活性產(chǎn)生抑制作用，以及加酶量增大后，酶與底物濃度逐漸達(dá)到飽和。加酶量和時(shí)間改變導(dǎo)致的水解度下降，可能是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶變性從而使活性降低[33]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，響應(yīng)面底部呈現(xiàn)橢圓形的等高線，表明該變量交互作用顯著[34]，試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度和加酶量的交互作用最強(qiáng)。該響應(yīng)面圖在預(yù)測(cè)水解度和兩個(gè)組合變量之間的顯著交互作用方面顯示出極高的準(zhǔn)確性，結(jié)果與回歸模型一致。

圖2 溫度與加酶量（a）、溫度與時(shí)間（b）、加酶量與時(shí)間（c）交互作用對(duì)水解度的影響Fig.2 Interaction effects of temperature and [E/S]（a），temperature and time （b），and [E/S]and time （c） on DH

根據(jù)分析結(jié)果，得到最佳水解條件為：溫度為70.10 ℃、加酶量4.43%、反應(yīng)時(shí)間3.88 h 時(shí)，預(yù)測(cè)的最高水解度為43.75%?？紤]到實(shí)際操作的便利性，將最佳水解條件修正為：溫度70 ℃、加酶量4%、時(shí)間4 h，在此條件下，得到的水解度為43.18%。與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差僅為1.30%。這表明所建立的回歸方程能夠很好地反映溫度、加酶量和時(shí)間對(duì)仿刺參精水解度的影響，通過(guò)該優(yōu)化模型可以有效地改善水解度。

2.3 梯級(jí)肽的分布

使用Pall Minimate 超濾系統(tǒng)，最終得到分子質(zhì)量范圍分別為1 ku，1～5 ku 和5～10 ku 的3 種仿刺參精多肽，分別命名為P1、P2 和P3。

2.4 清除·O2-和·OH 能力

在模擬生理?xiàng)l件下（pH 7.4，37 ℃），測(cè)試了仿刺參精多肽對(duì)·O2-和·OH 的清除能力。如圖3a 所示，仿刺參精多肽清除·O2-的能力在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的濃度依賴性，隨著濃度的升高其清除·O2-能力不斷增強(qiáng)。3 種多肽對(duì)·O2-的清除能力表現(xiàn)出比較顯著的差異，分子質(zhì)量越低的肽段，清除·O2-的能力越強(qiáng)，強(qiáng)度依次為P1＞P2＞P3。

如圖3b 所示，不同分子質(zhì)量的仿刺參精多肽對(duì)·OH 的清除能力差異較大。在低濃度范圍內(nèi)，3種多肽清除·OH 的能力與其分子質(zhì)量密切相關(guān)。質(zhì)量濃度為2.5～5 mg/mL 時(shí)，分子質(zhì)量＜1 ku 的多肽P1 的活性遠(yuǎn)低于P2 和P3。P1 對(duì)·OH 的清除能力具有很強(qiáng)的濃度依賴性，隨著質(zhì)量濃度的增加，P1 的活性迅速增強(qiáng)，分別在約12 mg/mL 和10 mg/mL 時(shí)超過(guò)P2 和P3。而P2 和P3 在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均保持較高的活性，隨著質(zhì)量濃度的增加，P2 的活性變化不大，P3 的活性略有下降。研究結(jié)果表明，P1、P2 和P3 均具有較好的清除·OH 的能力，表明它們具有較好的抗氧化活性。

圖3 仿刺參精多肽清除·O2-（a）和·OH（b）能力Fig.3 Scavenging effects of peptides from Aj sperm against ·O2- （a） and ·OH （b）

3 結(jié)論

綜上所述，酶解溫度、加酶量和時(shí)間對(duì)仿刺參精的水解程度有顯著的影響。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法，確定的最佳水解條件為溫度70 ℃，加酶量4.4%，水解時(shí)間4 h。從酶解液中分離得到的3 種不同分子質(zhì)量范圍的多肽，對(duì)·O2-和·OH 均表現(xiàn)出比較好的清除能力。其中，分子量1 ku 的多肽P1 抗氧化活性最好。本研究可為仿刺參副產(chǎn)物的高值化提供一定的參考依據(jù)。