付 余，張宇昊

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 川渝共建特色食品重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶 400715）

流行病學(xué)研究表明，長(zhǎng)期高鈉鹽飲食不僅會(huì)引發(fā)心血管疾病，還會(huì)引發(fā)腎結(jié)石、骨質(zhì)疏松癥、糖尿病等疾病[1]。目前，全球人均食鹽攝入量遠(yuǎn)高于世界衛(wèi)生組織（WHO）的人均推薦量（5 g/d），如美國(guó)人均每日食鹽攝入量超過(guò)10 g，歐洲國(guó)家人均每日食鹽攝入量為8～13 g[2]，而我國(guó)人均每日食鹽攝入量約為12 g，超出推薦量近1 倍。由此可見(jiàn)，減少膳食中鈉鹽的攝入，有助于降低全民潛在健康風(fēng)險(xiǎn)。食品工業(yè)上目前使用氯化鉀、氯化鈣等非鈉鹽部分替代氯化鈉，易導(dǎo)致食品感官品質(zhì)降低，而“減鹽不減味”是減少膳食鈉鹽攝入的關(guān)鍵。一些食源性肽具有咸味增強(qiáng)作用，其本身沒(méi)有咸味，當(dāng)其與氯化鈉共同攝入時(shí)能夠增強(qiáng)味蕾對(duì)咸味的感知。有學(xué)者對(duì)一些咸味增強(qiáng)物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰肽是其中關(guān)鍵組分之一。γ-谷氨酰肽是含有γ-谷氨酰殘基的一類小分子肽[3]，可用于增強(qiáng)食物的濃厚味（Kokumi）和持續(xù)性[4]，并與食鹽協(xié)同起到增咸、提鮮的效果[5]，有望為食品工業(yè)減鹽的實(shí)施提供全新的思路與策略。

雖然γ-谷氨酰肽因突出的呈味效果逐漸受到關(guān)注，但是在研究與應(yīng)用過(guò)程中仍存在許多問(wèn)題與挑戰(zhàn)。在產(chǎn)物制備方面，γ-谷氨酰肽在自然界中分布廣泛，在動(dòng)物、植物、微生物中均有檢出，然而，其含量或產(chǎn)率較低，且分布差異較大，如何經(jīng)濟(jì)、有效地富集或制備γ-谷氨酰肽，尚缺乏成熟方案。目前常采用一些蛋白酶，如γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、谷氨酰胺酶等催化制備γ-谷氨酰肽[6]，然而，此方法受限于缺乏高特異性和高活性的食品級(jí)蛋白酶，生產(chǎn)效率較低，難以真正用于規(guī)模化的食品工業(yè)生產(chǎn)中。在呈味構(gòu)效方面，γ-谷氨酰肽的濃度、閾值、C 端氨基酸殘基與濃厚味的強(qiáng)、弱及呈味特性密切相關(guān)，而濃厚味與γ-谷氨酰肽的構(gòu)效關(guān)系尚不明確[7]，造成環(huán)境因素對(duì)γ-谷氨酰肽呈味的影響規(guī)律研究難以深入。在呈味機(jī)制方面，目前已證實(shí)γ-谷氨酰肽是鈣敏感受體（CaSR）的變構(gòu)激動(dòng)劑，而γ-谷氨酰肽激活CaSR 過(guò)程中是否與咸味、鮮味受體之間存在一定的聯(lián)系，且誘發(fā)濃厚味特性與細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度的關(guān)系也尚不明確。在評(píng)價(jià)方法方面，當(dāng)前濃厚味的評(píng)價(jià)方法主要包括感官評(píng)價(jià)法和CaSR 活性檢測(cè)法等[8]，仍缺少較為系統(tǒng)、客觀的評(píng)價(jià)方法。例如，感官評(píng)價(jià)法主觀性較強(qiáng)，單獨(dú)使用難以實(shí)現(xiàn)濃厚味和增味效果的準(zhǔn)確評(píng)估；CaSR 法主要利用γ-谷氨酰肽激活CaSR，而一些細(xì)胞表達(dá)CaSR 受體的能力有限，限制了該法的應(yīng)用。

基于此，本文針對(duì)γ-谷氨酰肽的制備方法、呈味特性與鈣敏感受體的結(jié)合機(jī)制、γ-谷氨酰肽的呈味影響因素以及濃厚味評(píng)價(jià)方法等方面進(jìn)行綜述，分析當(dāng)前的機(jī)遇和挑戰(zhàn)，并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行展望，旨在為食品工業(yè)中應(yīng)用γ-谷氨酰肽進(jìn)行減鹽、增味提供理論參考。

1 γ-谷氨酰肽的制備

天然的γ-谷氨酰肽廣泛存在于細(xì)菌、動(dòng)植物及發(fā)酵食品中，而天然食物中的γ-谷氨酰肽含量較低，且分布差異較大。據(jù)報(bào)道，意大利魚(yú)醬中γ-谷氨酰肽（γ-Glu-Val-Gly）的含量范圍為0.4～12.6 mg/L，醬油中γ-谷氨酰肽的含量范圍為1.5～6.1 mg/L，藍(lán)紋奶酪中所有γ-谷氨酰肽的總量?jī)H為3.59 mmol/kg[4]。由此可見(jiàn)，天然γ-谷氨酰肽因含量或產(chǎn)率低，無(wú)法滿足工業(yè)化的需要，故定向合成方法成為制備濃厚味γ-谷氨酰肽的主要發(fā)展方向。目前，γ-谷氨酰肽的合成方法主要有生物合成法（如酶法、微生物發(fā)酵法等）和化學(xué)合成法。

1.1 酶法

酶法合成是利用酶的催化作用合成γ-谷氨酰肽。目前文獻(xiàn)報(bào)道的具有合成γ-谷氨酰肽能力的蛋白酶主要包括谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT，EC 2.3.2.2）、谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）和谷氨酰半胱氨酸合成酶（E.C.6.3.2.2）。

1.1.1 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-Glutamyl transpeptidase，GGT）廣泛存在于生物體內(nèi)，是谷胱甘肽（GSH）代謝的關(guān)鍵酶之一，可催化3 種類型的反應(yīng)：水解反應(yīng)、轉(zhuǎn)肽反應(yīng)和自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)（圖1）。具體機(jī)制為：1）當(dāng)親核試劑為水分子時(shí)會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)，同時(shí)釋放出游離的谷氨酸；2）如果受體為氨基酸或肽分子時(shí)，將發(fā)生轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，生成γ-谷氨酰肽；3）當(dāng)受體分子同時(shí)作為反應(yīng)中的供體和受體時(shí)，將會(huì)發(fā)生自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。其中，轉(zhuǎn)肽反應(yīng)和自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)都被證明可在體外高濃度的供體（游離谷氨酰胺）基質(zhì)中發(fā)生，生成γ-谷氨酰肽[9]。

圖1 GGT 催化反應(yīng)機(jī)制Fig.1 The catalytic reaction mechanism of GGT

目前研究證實(shí)，GGT 可用于催化生成多種γ-谷氨酰肽[10]。楊娟[11]研究表明，GGT 的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)最優(yōu)條件為37 ℃、pH 10.0、反應(yīng)時(shí)間3 h，最高產(chǎn)率88%。Lin 等[12]對(duì)GGT 的固定化進(jìn)行研究，通過(guò)將地衣芽孢桿菌GGT 固定在石墨烯氧化物納米片上合成γ-Glu-Phe 和γ-Glu-Leu，與未固定的谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶相比，固定化酶表現(xiàn)出明顯更高的活性，并且產(chǎn)物的產(chǎn)率高于31%。由于谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶屬于轉(zhuǎn)移酶而不是合成酶，不消耗ATP 等能量化合物，具有較高的酶活性，因此該方法在食品工業(yè)中具有大規(guī)模生產(chǎn)γ-谷氨酰肽的應(yīng)用前景。然而，目前食品工業(yè)仍缺乏食品級(jí)的高特異性、高活性的γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶，利用合成生物學(xué)手段高效表達(dá)安全的GGT，是食品級(jí)γ-谷氨酰肽制備的發(fā)展方向之一。

1.1.2 谷氨酰胺酶 谷氨酰胺酶（Glutaminase）是一種能夠合成γ-谷氨酰肽的重要酶制劑。與谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶不同的是谷氨酰胺酶是一種水解酶，它廣泛分布于細(xì)菌、酵母菌和真菌等微生物中。除水解作用外，谷氨酰胺酶也具有一定的γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶活性[13]。早在20世紀(jì)70年代，銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa）[14]和大腸桿菌屬（Escherichia coli）[15]來(lái)源的谷氨酰胺酶便被報(bào)道可催化γ-谷氨酰基供體與其它小分子物質(zhì)結(jié)合生成γ-谷氨酰物質(zhì)；硝基還原假單胞菌（P.nitroreducens）來(lái)源的谷氨酰胺酶也具有γ-谷氨?；D(zhuǎn)移反應(yīng)活性，在谷氨酰胺和羥胺的反應(yīng)體系中，它能夠催化形成γ-谷氨酰基異羥肟酸[16]。Tomita 等[17]研究表明米曲霉源谷氨酰胺酶的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性，并證實(shí)谷氨酰胺酶可以催化合成多種γ-谷氨酰肽，例如：γ-Glu-Gln、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Val、γ-Glu-Ile 和γ-Glu-Gly。近年來(lái)，也有不少學(xué)者通過(guò)研究更多微生物源谷氨酰胺酶合成多種γ-谷氨酰肽[18]。Yang等[19-20]利用從淀粉芽孢桿菌和米曲霉獲得的谷氨酰胺酶合成了γ-[Glu]（1≤n≤5）-Phe，并指出其最佳反應(yīng)溫度37 ℃，最佳pH 值為10，以及最佳反應(yīng)時(shí)間3 h；研究還發(fā)現(xiàn)，從解淀粉芽孢桿菌中提取的一種谷氨酰胺酶也能催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，它具有合成γ-[Glu]（n=2，3，4）-Val 或γ-[Glu]（n=2，3，4）-Met 的轉(zhuǎn)肽酶活性。本研究團(tuán)隊(duì)利用谷氨酰胺酶分別催化秀珍菇蛋白肽和雞骨蛋白肽合成γ-谷氨酰肽，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件來(lái)提升產(chǎn)率空間仍非常有限，最終產(chǎn)率仍較低（最高僅為39.38%），說(shuō)明谷氨酰胺酶雖可用于生成γ-谷氨酰肽，但其底物特異性差且γ-谷氨?；D(zhuǎn)移活性有限，很難真正用于規(guī)?；a(chǎn)食品級(jí)γ-谷氨酰肽。

1.1.3 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-Glutamyl cysteine synthetase）可催化合成一些γ-谷氨酰肽。Nakayama 等[21]報(bào)道從奇異變形桿菌中純化的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在30 ℃時(shí)可以合成含半胱氨酸的γ-谷氨酰肽，其中包括γ-Glu-Cys、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Ser 和γ-Glu-Hse。然而，此合成酶在催化反應(yīng)過(guò)程中需要消耗ATP，且產(chǎn)量受到ADP 和終產(chǎn)物的反饋抑制的影響[11]，因此在γ-谷氨酰肽的制備中使用率不高。

1.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是在特定環(huán)境下，利用某些微生物代謝途徑產(chǎn)生的蛋白酶來(lái)催化合成γ-谷氨酰肽的一種方法。Hasegawa 等[22]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵產(chǎn)生谷氨酸的過(guò)程中，在γ-谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶的催化作用下可以合成多種γ-谷氨酰肽。Sofyanovich 等[23]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母除了可以產(chǎn)生GSH 外，還可以催化生成γ-Glu-Val 和γ-Glu-Val-Gly，其中γ-Glu-Val-Gly 是酵母多個(gè)重要生理代謝途徑的共有產(chǎn)物，因此它能天然存在于酵母細(xì)胞中。Yan 等[24]探究了γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）在羅伊氏乳桿菌LTH5448 合成γ-谷氨酰二肽中的作用，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌中存在3個(gè)編碼GCL 的基因，其中羅伊氏乳桿菌中的2 個(gè)基因能介導(dǎo)合成γ-Glu-Ile 和γ-Glu-Cys，并利用其合成具有濃厚味γ-谷氨酰肽的發(fā)酵劑培養(yǎng)物，從而改善發(fā)酵食品的風(fēng)味。Yang 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在一些發(fā)酵食品中也存在羅伊氏乳桿菌中的GCL，可以催化合成具有獨(dú)特濃厚味的γ-谷氨酰二肽（γ-Glu-Ile 和γ-Glu-Cys）。對(duì)于發(fā)酵類調(diào)味品，可以通過(guò)引入特定微生物菌種參與發(fā)酵，靶向提升產(chǎn)品中γ-谷氨酰肽含量，進(jìn)而有助于開(kāi)發(fā)富含γ-谷氨酰肽的低鹽增味調(diào)味品。然而，從γ-谷氨酰肽制備的角度，尚缺乏以γ-谷氨酰肽制備為目的的發(fā)酵菌種及其發(fā)酵條件優(yōu)化研究。目前主要使用誘變育種和基因工程手段提高GSH 的產(chǎn)率，雖然發(fā)酵效率有所提高，但是其產(chǎn)率最高也不超過(guò)20%。通過(guò)菌種改造獲得γ-谷氨酰肽高產(chǎn)菌株，可能成為未來(lái)研究需要攻克的難題。

1.3 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法是以氨基酸為原料，通過(guò)對(duì)活性基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)或者屏蔽來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的γ-谷氨酰基化，常用于合成高純度的γ-谷氨酰肽。Amino 等[26]通過(guò)γ-谷氨?；腘-α-苯氧羰基保護(hù)，以Glu、Val 和Gly 殘基為主鏈依次縮合制備γ-Glu-Val-Gly，然而，該方法存在操作復(fù)雜，產(chǎn)物易產(chǎn)生消旋體，分離難度大，產(chǎn)率低，成本高等缺點(diǎn)，而且在制備過(guò)程中需要使用過(guò)量的偶聯(lián)劑和?；噭菀讓?dǎo)致環(huán)境污染。這種方法不適用于食品級(jí)γ-谷氨酰肽工業(yè)化水平的大規(guī)模生產(chǎn)，然而，其可用于γ-谷氨酰肽的構(gòu)效研究，為進(jìn)一步闡明γ-谷氨酰肽呈味機(jī)理提供支撐。

2 γ-谷氨酰肽的呈味分子機(jī)制

γ-谷氨酰肽可以提高基本呈味物質(zhì)的呈味強(qiáng)度，在食物中加入此類肽會(huì)增加食物的鮮咸味及濃厚味[27]，然而，當(dāng)γ-谷氨酰肽的添加量過(guò)高時(shí)又會(huì)引起濃厚味強(qiáng)度的減退[5]。隨著對(duì)γ-谷氨酰肽呈味特性研究的深入，現(xiàn)已證實(shí)γ-谷氨酰肽的濃厚味受體為鈣敏感受體（Calcium sensing receptor，CaSR），且濃厚味的味覺(jué)強(qiáng)度與其激活CaSR的能力呈正相關(guān)[28]，因此從γ-谷氨酰肽與CaSR結(jié)合的角度，深入挖掘濃厚味的呈味機(jī)理，可為γ-谷氨酰肽的呈味分子機(jī)制研究提供理論參考。

2.1 γ-谷氨酰肽與CaSR 的結(jié)合機(jī)制

CaSR 是C 家族G 蛋白偶聯(lián)受體（G-proteincoupled receptor，GPCR）的一種，屬于細(xì)胞外氨基酸傳感器家族。類似于其它C 類G 蛋白偶聯(lián)受體，CaSR 識(shí)別配體的關(guān)鍵位點(diǎn)存在于一個(gè)大的N末端Venus Flytrap 結(jié)構(gòu)域（VFT），此結(jié)構(gòu)域由2個(gè)區(qū)域（LB1 和LB2）組成。此外，CaSR 還包含一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（Cysteine-rich，CR），它將VFT 模塊連接到跨膜區(qū)域，是受體激活所必需的途徑[29]。L 型氨基酸以及γ-谷氨酰肽也都是通過(guò)與VFT 結(jié)合區(qū)域結(jié)合激活CaSR，并通過(guò)T145A/S170T 雙突變體的共同機(jī)制發(fā)揮作用，可能占據(jù)受體VFT 結(jié)構(gòu)域的重疊結(jié)合位點(diǎn)[30]。

2.2 信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制

味覺(jué)受體細(xì)胞（Taste receptor cell，TRC）是味蕾的組成成分，主要分為4 種類型：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型（Ⅳ型細(xì)胞數(shù)量不足2%）。其中，Ⅱ型細(xì)胞中含有G 蛋白偶聯(lián)受體T1Rs 和T2Rs，甜味、苦味和鮮味是由GPCRs 介導(dǎo)的，異二聚體受體T1Rs負(fù)責(zé)鮮味（T1R1/T1R3）和甜味（T1R2/T1R3），而T2Rs 是苦味味覺(jué)受體；CaSR 在Ⅱ、Ⅲ型2 種細(xì)胞中都有表達(dá)，且主要在Ⅲ型細(xì)胞中表達(dá)[31]。如圖2所示，CaSR 主要在II 型細(xì)胞中與腔膜上的T2Rs共同表達(dá)，并對(duì)苦味（例如Ca2+或苯甲地那銨）和濃厚味（L-氨基酸或γ-谷氨酰胺）的轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用。具體而言，激活CaSR 同源二聚體或CaSR/T2R 異源二聚體，會(huì)促使通過(guò)磷脂酶（PLC）依賴性途徑增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，最終促進(jìn)細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)ATP 至細(xì)胞外[28]，而CaSR 激動(dòng)劑可直接激活表達(dá)在味覺(jué)受體細(xì)胞表面的CaSR，進(jìn)而通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）反饋到大腦[27]。

鮮味物質(zhì)谷氨酸鈉和濃厚味物質(zhì)GSH 可分別與II 型細(xì)胞膜上的T1Rs 和CaSR 結(jié)合，通過(guò)相似途徑增強(qiáng)Ca2+的釋放，提高細(xì)胞動(dòng)作電位并促進(jìn)ATP 的釋放，以實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)鮮味的效果。在III 型細(xì)胞中（圖2），γ-谷氨酰肽激活頂端的CaSR 后，通過(guò)PLC 依賴的信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，同時(shí)III 型細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加與5-羥色胺（5-HT）的釋放有關(guān)，而5-HT 會(huì)抑制II 型細(xì)胞中ATP 的釋放，它們所產(chǎn)生的味覺(jué)信號(hào)互有影響。表達(dá)CaSR 的味覺(jué)受體細(xì)胞可以作為濃厚味的評(píng)價(jià)模型，在鮮味物質(zhì)存在的情況下，γ-谷氨酰肽的鮮味增強(qiáng)作用是否依賴于CaSR 的激活而發(fā)生，目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究[32]。

圖2 CaSR 在味覺(jué)細(xì)胞中的作用途徑[28]Fig.2 The role of CaSR in taste cells[28]

3 濃厚味γ-谷氨酰肽的呈味影響因素

γ-谷氨酰肽的濃厚味特性其實(shí)在很大程度上受不同因素的影響，如N 端氨基酸殘基的差異會(huì)使γ-谷氨酰肽呈現(xiàn)出不同的濃厚味特性，濃度和pH 值等環(huán)境因素也會(huì)影響呈味效果。因此，原料來(lái)源、應(yīng)用的食品體系以及γ-谷氨酰肽濃度閾值不同，均會(huì)造成濃厚味產(chǎn)生較大差異。本節(jié)針對(duì)影響γ-谷氨酰肽濃厚味的因素進(jìn)行綜述，為γ-谷氨酰肽在不同食品體系中的科學(xué)應(yīng)用提供理論參考。

3.1 呈味構(gòu)效

γ-谷氨酰肽的結(jié)構(gòu)與其對(duì)CaSR 的激活能力密切相關(guān)，而γ-谷氨酰肽激活CaSR 的能力與濃厚味強(qiáng)度呈正相關(guān)[33]。明確γ-谷氨酰肽的呈味構(gòu)效關(guān)系有助于厘清不同γ-谷氨酰肽的濃厚味呈味特點(diǎn)，進(jìn)而篩選適合在不同食品體系中應(yīng)用γ-谷氨酰肽。Amino 等[34]報(bào)道，具有以下結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的γ-谷氨酰肽能夠有效激活CaSR：1）在N 末端存在1 個(gè)γ-L-谷氨酰殘基；2）當(dāng)?shù)? 個(gè)殘基為中等分子量，含有1～3 個(gè)C 或者含有2 個(gè)C 和1 個(gè)O 或S 原子的脂肪族中性取代基（如Val、Leu 等），并且為L(zhǎng) 構(gòu)型；3）第3 個(gè)殘基的存在，特別是存在C末端的羧酸且沒(méi)有側(cè)鏈的殘基（如Gly），將會(huì)呈現(xiàn)出較強(qiáng)CaSR 的激活能力，許多研究結(jié)果也證明了以上構(gòu)效規(guī)律。Ohsu 等[27]研究表明，γ-Glu-Val-Gly、γ-Glu-Cys 和GSH（γ-Glu-Cys-Gly）均具有激活CaSR 的能力。此外，Amino 等[34]研究發(fā)現(xiàn)多種含硫氨基酸的γ-谷氨酰肽也具有激活CaSR 的能力，且具有較強(qiáng)的濃厚味。如表1所示，γ-L-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酰甘氨酸的CaSR 激活能力，而該結(jié)構(gòu)也滿足上述對(duì)于表現(xiàn)強(qiáng)效的CaSR 激活能力的結(jié)構(gòu)要求。相反，γ-L-谷氨酰-L-蛋氨酸、γ-L-谷氨酰-S-（正丙基）-L-半胱氨酸、γ-L-谷氨酰-S-（2-丙烯基）-L-半胱氨酸和γ-L-谷氨酰-S-（2-丙烯基）-L-半胱氨酸亞砜擁有分子量更大的側(cè)鏈基團(tuán)，然而，在CaSR 活性評(píng)價(jià)中未展現(xiàn)其活性。由此可以推測(cè)γ-谷氨酰肽和CaSR 相互結(jié)合以表達(dá)活性時(shí)，對(duì)于γ-谷氨酰肽的空間結(jié)構(gòu)要求十分嚴(yán)格。Amino 等[35]還發(fā)現(xiàn)若將硫化物轉(zhuǎn)化為極性官能團(tuán)，如亞砜基團(tuán)，會(huì)阻礙γ-谷氨酰肽和CaSR 的相互作用，并且發(fā)現(xiàn)α-L-谷氨酰肽不能激活CaSR 受體，進(jìn)一步佐證了γ-L-谷氨酰殘基對(duì)于呈現(xiàn)強(qiáng)效CaSR 激活能力的結(jié)構(gòu)依賴性。

表1 含硫氨基酸的γ-谷氨酰肽的CaSR 激活能力[35]Table 1 CaSR activity of sulfur amino acid-containing γ-glutamyl peptides[35]

3.2 其它因素

γ-谷氨酰肽的結(jié)構(gòu)決定其濃厚味的效果，不同食品體系下呈味物質(zhì)組成、pH 值等因素會(huì)影響γ-谷氨酰肽對(duì)CaSR 的激活效果等，造成γ-谷氨酰肽在實(shí)際食品應(yīng)用中呈現(xiàn)出的濃厚味不同。對(duì)于濃厚味γ-谷氨酰肽的產(chǎn)生，一些呈味物質(zhì)具有協(xié)同作用，將γ-谷氨酰肽添加到如氯化鈉、谷氨酸鈉或雞湯等風(fēng)味基質(zhì)中，γ-谷氨酰肽的濃厚味檢測(cè)閾值顯著降低，并且顯著增強(qiáng)了風(fēng)味基質(zhì)的復(fù)雜口感、滿口感和持續(xù)口感。Dunkel 等[36]通過(guò)感官評(píng)價(jià)法發(fā)現(xiàn)在雞湯溶液中，γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Cys-β-Ala、γ-Glu-Cys-Gly 的濃厚味（復(fù)雜口感、滿口感、延綿感）閾值分別為0.8，0.4，0.2，0.2 mmol/L，并發(fā)現(xiàn)γ-Glu-Cys-β-Ala 加入谷氨酸和氯化鈉的混合溶液后，閾值下降約32倍，在加入低脂花生醬、低脂奶油凍中也會(huì)產(chǎn)生類似的效果[37]。此外，γ-谷氨酰肽加入基質(zhì)的pH 值也會(huì)影響濃厚味的強(qiáng)度。Simone 等[38]利用感官評(píng)價(jià)法鑒定γ-谷氨酰肽在pH 值分別為4.7，5.7，6.7，7.7 時(shí)的濃厚味強(qiáng)度；當(dāng)pH 值為6.7 時(shí)，γ-谷氨酰肽的濃厚味強(qiáng)度最強(qiáng)，當(dāng)pH 值為5.7 時(shí)強(qiáng)度次之，然而，在較低pH 值（4.7）和較高的pH 值（7.7）下均未觀察到明顯的濃厚味，這表明γ-谷氨酰肽呈現(xiàn)的濃厚味強(qiáng)度強(qiáng)烈依賴于pH 值。由于γ-谷氨酰肽本身不具有基本味，只有在含有呈味物質(zhì)的體系中才能體現(xiàn)出呈味效果，因此γ-谷氨酰肽呈現(xiàn)濃厚味的能力不僅受自身結(jié)構(gòu)和濃度的影響，還與其應(yīng)用的食品體系環(huán)境有關(guān)，環(huán)境因素對(duì)γ-谷氨酰肽呈味特性的影響規(guī)律有待進(jìn)一步研究。

4 γ-谷氨酰肽濃厚味的評(píng)價(jià)方法

由于γ-谷氨酰肽不僅賦予食物醇厚、持續(xù)的味覺(jué)感受特性，還增強(qiáng)基本呈味物質(zhì)的呈味強(qiáng)度，因此判斷和評(píng)價(jià)濃厚味強(qiáng)度是研究γ-谷氨酰肽的必要前提。目前，評(píng)價(jià)γ-谷氨酰肽及其增味效果的方法主要有感官評(píng)價(jià)法、CaSR 法和電子舌法，如表2所示。加強(qiáng)對(duì)γ-谷氨酰肽的濃厚味的評(píng)價(jià)研究并制定科學(xué)有效的評(píng)價(jià)方法，對(duì)于γ-谷氨酰肽的高效制備及食品工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

表2 濃厚味γ-谷氨酰肽及其增味效果的評(píng)價(jià)方法Table 2 Methods for assessing kokumi γ-glutamyl peptides and their taste-enhancing effects

4.1 感官評(píng)價(jià)法

感官評(píng)價(jià)是通過(guò)視覺(jué)、嗅覺(jué)、觸覺(jué)、味覺(jué)和聽(tīng)覺(jué)感知來(lái)測(cè)定和分析待測(cè)樣品的分析方法[39]，是一種常見(jiàn)的評(píng)定γ-谷氨酰肽賦予食物濃厚味的方法。早在1997年，Ueda 等[40]首次提出γ-谷氨酰肽——GSH 的感官評(píng)價(jià)方法，他們測(cè)定了水和鮮味溶液中GSH 的閾值及其對(duì)基本味覺(jué)（酸、甜、苦、咸、鮮）的調(diào)節(jié)能力。隨后，該法又經(jīng)研究學(xué)者的補(bǔ)充和完善，被廣泛應(yīng)用于濃厚味物質(zhì)的評(píng)價(jià)中。

評(píng)價(jià)過(guò)程如下[41]：1）感官鑒評(píng)訓(xùn)練，通過(guò)讓感官鑒評(píng)人員品嘗一系列代表酸、甜、苦、咸、鮮和濃厚味的基礎(chǔ)溶液，使他們對(duì)這些味覺(jué)具有準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)，并用描述性語(yǔ)言進(jìn)行表達(dá)。2）鑒評(píng)試驗(yàn)，將不同濃度的待測(cè)物質(zhì)溶解于含有2 種以上的呈味物質(zhì)體系中（可采用空白雞湯或肉湯），讓鑒評(píng)人員品嘗并通過(guò)評(píng)分法（0～10 分依次表示味覺(jué)強(qiáng)度從無(wú)到非常強(qiáng)烈），從酸、甜、苦、咸、鮮和濃厚味等方面對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行打分。3）匯總品嘗相同溶液鑒評(píng)人員的結(jié)果并采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，給出描述性感官評(píng)價(jià)結(jié)果。

探究γ-谷氨酰肽的閾值濃度也可采用感官評(píng)價(jià)法。味覺(jué)閾值濃度主要通過(guò)味覺(jué)濃度或稀釋分析的三角形試驗(yàn)來(lái)確定[10]。感官評(píng)鑒小組需在其它2 個(gè)空白樣品之外正確識(shí)別出待測(cè)樣品，并以評(píng)鑒人員能夠區(qū)分該差異的最小濃度作為待測(cè)物質(zhì)的味覺(jué)閾值。例如，Liu 等[42]利用該法測(cè)定γ-Glu-Val-Gly 的味覺(jué)識(shí)別閾值濃度為1.55 μmol/L。此外，一些研究學(xué)者也通過(guò)感官評(píng)價(jià)法來(lái)評(píng)價(jià)γ-谷氨酰肽基礎(chǔ)味的調(diào)節(jié)能力，即在基礎(chǔ)味溶液中考察額外添加的濃厚味肽改變基礎(chǔ)味的強(qiáng)度（例如氯化鈉溶液中的咸味）[43]。

4.2 CaSR 法

目前，常用卵母細(xì)胞或人胚腎細(xì)胞HEK-293作為CaSR 受體細(xì)胞模型來(lái)評(píng)估γ-谷氨酰肽的受體激活情況。Amino 等[34]采用卵母細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法如下：從非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵巢中制備卵母細(xì)胞，然后將人源CaSR 的互補(bǔ)RNA（cRNA）轉(zhuǎn)導(dǎo)至卵母細(xì)胞中。當(dāng)卵母細(xì)胞中表達(dá)的CaSR 被激活時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間Ca2+增加，激活內(nèi)源性鈣離子依賴性Na+通道并產(chǎn)生電流。在含有CaSR 激活劑的緩沖液中培養(yǎng)卵母細(xì)胞時(shí)，可通過(guò)細(xì)胞兩極的電流來(lái)表征激活劑的激活效果，記錄的電流峰值與CaSR 被激活的強(qiáng)度相關(guān)[34]。HEK-293 細(xì)胞法則將人源CaSR 的cDNA 構(gòu)建于表達(dá)載體pcDNA3.1 上，并迅速轉(zhuǎn)染到HEK-293 細(xì)胞中，在含有待測(cè)物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，用鈣離子指示劑或鈣離子染料染色。當(dāng)HEK-293 細(xì)胞中表達(dá)的CaSR 被激活后，細(xì)胞間Ca2+濃度會(huì)增加，此時(shí)，鈣離子染料會(huì)與游離的Ca2+結(jié)合，從而導(dǎo)致染料熒光強(qiáng)度增加，因此可通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度評(píng)估各種待測(cè)樣品的CaSR 激活能力及其濃度依賴性[27]。Broadhead 等[30]在表達(dá)CaSR 的HEK-293 細(xì)胞中評(píng)價(jià)了γ-谷氨酰肽對(duì)鈣離子依賴的細(xì)胞內(nèi)的鈣調(diào)動(dòng)的影響，研究發(fā)現(xiàn)S-甲基谷胱甘肽、谷胱甘肽（γ-Glu-Cys-Gly）、γ-L-谷?；?L-丙氨酸（γ-Glu-Ala）和γ-L-谷?；?L-半胱氨酸（γ-Glu-Cys）都是非常有效的CaSR 正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，可以顯著促進(jìn)鈣離子依賴的鈣調(diào)動(dòng)，它們的EC50值分別為1.7，3.9，4.7，4.8 μmol/L，且促進(jìn)鈣激活的能力排序?yàn)镾-甲基谷胱甘肽＞γ-Glu-Cys-Gly＞γ-Glu-Ala＞γ-Glu-Cys。該結(jié)果再次表明γ-谷氨酰肽的結(jié)構(gòu)、肽序列及肽鏈長(zhǎng)度對(duì)CaSR 的激活能力以及濃厚味強(qiáng)度都有影響，然而，其確切的構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步闡明。

與感官評(píng)定法相比，CaSR 法的時(shí)間和人力消耗少，由于CaSR 法基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，此方法不需要對(duì)檢測(cè)樣本設(shè)定嚴(yán)格的食品級(jí)原料要求，因此比較適用于大規(guī)模檢測(cè)。然而，CaSR 法的結(jié)果需進(jìn)一步通過(guò)感官評(píng)定法驗(yàn)證。由于許多CaSR 激活劑并不是濃厚味物質(zhì)[32]，并且細(xì)胞有限的表達(dá)能力和復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境都對(duì)CaSR 法的大規(guī)模應(yīng)用形成限制[7]，因此，目前CaSR 法一般用于對(duì)待測(cè)物質(zhì)的初步篩選[41]。

4.3 電子舌

電子舌（Electronic tongue）是通過(guò)模仿人體味覺(jué)機(jī)理制成的新型分析儀器，目前被廣泛應(yīng)用于食品、調(diào)味品、中藥及中成藥等領(lǐng)域。與人工的感官評(píng)價(jià)相比，電子舌更客觀、靈敏、不易疲勞，可同時(shí)用于多種樣本的測(cè)定。然而，對(duì)于濃厚味這種特征性味道，其復(fù)雜的呈味特性超出了電子舌檢測(cè)的能力。目前，主要使用電子舌結(jié)合人工感官方法評(píng)價(jià)厚味肽對(duì)于基礎(chǔ)溶液的增咸、增鮮效果。Yan等[44]對(duì)具有濃厚味的豌豆蛋白肽進(jìn)行電子舌及感官分析，發(fā)現(xiàn)在0.5%NaCl 溶液中加入肽產(chǎn)物后，咸度及鮮味響應(yīng)值均顯著增加，說(shuō)明這些小肽不僅具有濃厚感特征的醇厚、圓潤(rùn)的感覺(jué)，還可能對(duì)咸味和鮮味起到增強(qiáng)作用。Zhang 等[45]也利用電子舌、人工感官等方法對(duì)河豚中的關(guān)鍵味覺(jué)活性成分通過(guò)味覺(jué)重構(gòu)、遺漏和添加試驗(yàn)確定其中的關(guān)鍵物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)兩種味覺(jué)活性肽Pro-Val-Ala-Arg-Met-CysArg（PR-7）和Tyr-Gly-Gly-Thr-Pro-Pro-Phe-Val（YV-8） 是引起典型濃厚味的關(guān)鍵化合物，并在接近中性pH（6.5～8.0）時(shí)，具有顯著鮮味增強(qiáng)作用[46]。除此之外，有學(xué)者通過(guò)感官分析和電子舌技術(shù)驗(yàn)證了典型的濃厚味γ-谷氨酰肽的鮮味增強(qiáng)作用[47-48]。綜上所述，感官評(píng)價(jià)法、CaSR 法和電子舌可為濃厚味的特征和定量測(cè)定提供一定評(píng)價(jià)依據(jù)，然而，每種方法單獨(dú)用于濃厚味評(píng)價(jià)都不足以獲得有說(shuō)服力的結(jié)論，尚需采用幾種方法聯(lián)合評(píng)價(jià)，方能得到相對(duì)客觀的結(jié)果。

5 挑戰(zhàn)與展望

目前，高鈉鹽攝入是我國(guó)居民膳食方面潛在風(fēng)險(xiǎn)之一。γ-谷氨酰肽不僅能夠增強(qiáng)食品的呈味強(qiáng)度，具有潛在的生理調(diào)節(jié)功能，而且在工業(yè)化食品減鹽領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，目前γ-谷氨酰肽的研究還存在如下挑戰(zhàn)：

1）目前酶法制備γ-谷氨酰肽的生物酶制劑主要有谷氨酰胺酶和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，然而，由于谷氨酰胺酶受體的轉(zhuǎn)移活性較低，難以用于γ-谷氨酰肽的工業(yè)化生產(chǎn)；谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化合成γ-谷氨酰肽還處于實(shí)驗(yàn)室水平，具有高產(chǎn)量的優(yōu)良菌株還有待開(kāi)發(fā)?？梢越Y(jié)合酶工程修飾與改造技術(shù)建立高效表達(dá)的酶制劑，并結(jié)合固定化酶技術(shù)，增強(qiáng)其特有的催化作用及回收率，篩選出高活性的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，為實(shí)現(xiàn)食品領(lǐng)域中γ-谷氨酰肽低成本、高產(chǎn)量的工業(yè)化生產(chǎn)提供前期基礎(chǔ)。

2）除γ-谷氨酰肽外，CaSR 還有其它已知的激動(dòng)劑，例如：乳酸鈣、魚(yú)精蛋白、聚賴氨酸和L-組氨酸，也可賦予食品濃厚味。然而，目前幾乎未見(jiàn)γ-谷氨酰肽與其它CaSR 激動(dòng)劑之間協(xié)同作用的研究。未來(lái)研究可以探究不同CaSR 激動(dòng)劑結(jié)合所產(chǎn)生的協(xié)同作用，為濃厚味食品更高效、高質(zhì)的生產(chǎn)提供新思路。

3）γ-谷氨酰肽不僅賦予食物濃厚味，還增強(qiáng)基本呈味物質(zhì)的鮮、咸味強(qiáng)度。γ-谷氨酰肽與鈣敏感受體相互作用產(chǎn)生濃厚味的同時(shí)，與II、III 型TRC 產(chǎn)生的味覺(jué)信號(hào)互有影響，這些細(xì)胞間的信號(hào)交流是否影響鮮味與咸味，目前尚不清楚。通過(guò)γ-谷氨酰肽的計(jì)算機(jī)模擬分析，根據(jù)同源性建模、分子動(dòng)力學(xué)等策略，可從分子層面闡明呈味機(jī)制及其與呈味物質(zhì)的相互作用。

4）γ-谷氨酰肽的濃厚味強(qiáng)度隨肽鏈長(zhǎng)度的增加而降低，濃厚味γ-谷氨酰肽大多是由2～5 個(gè)氨基酸組成的小肽，而C 端氨基酸殘基不同的γ-谷氨酰肽，其呈味特性和濃厚味味覺(jué)閾值也存在差異。目前γ-谷氨酰肽的構(gòu)效關(guān)系尚不明確，進(jìn)一步加強(qiáng)γ-谷氨酰肽構(gòu)效方面的研究，可為新型γ-谷氨酰肽的設(shè)計(jì)、制備提供思路。

5）目前檢測(cè)濃厚感的方法復(fù)雜繁瑣，且客觀性和準(zhǔn)確性不足，很難做到對(duì)濃厚感強(qiáng)度的精準(zhǔn)定量評(píng)價(jià)。利用感官評(píng)價(jià)法、分子對(duì)接技術(shù)及CaSR 活性檢測(cè)法3 種方法聯(lián)合評(píng)價(jià)γ-谷氨酰肽與CaSR 受體的相互作用，有望實(shí)現(xiàn)γ-谷氨酰肽的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)和篩選。

6 結(jié)論

作為一種新型的呈味肽，γ-谷氨酰肽逐漸受到關(guān)注。γ-谷氨酰肽賦予食物濃厚味并增強(qiáng)基本呈味物質(zhì)的呈味強(qiáng)度，尤其是在減少食鹽用量的情況下起到增咸、提鮮的效果，有望作為食品工業(yè)減鹽的全新原料。目前人工制備γ-谷氨酰肽主要通過(guò)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和谷氨酰胺酶進(jìn)行酶法催化合成。檢測(cè)γ-谷氨酰肽的濃厚味主要使用感官評(píng)價(jià)法和CaSR 活性檢測(cè)法，其呈味能力與其呈味閾值、樣品中的濃度和γ-谷氨酰肽的空間結(jié)構(gòu)有較大關(guān)系。至今，我國(guó)對(duì)γ-谷氨酰肽的研究開(kāi)發(fā)仍處于初步階段，還需加強(qiáng)對(duì)γ-谷氨酰肽的制備方法、呈味機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系及呈味評(píng)價(jià)等方面的研究。

致謝：

感謝安琪酵母股份有限公司劉政芳對(duì)本文的幫助和建議。