杜怡芳，朱信超，李賢慧，曲憲成

(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院/上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗教學(xué)示范中心，上海/上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

魚類在脊椎動物中分布最廣且種類最多，與高等脊椎動物相比，魚類性別決定機(jī)制更加復(fù)雜多樣。脊椎動物的性別決定機(jī)制包括基因性別決定機(jī)制(GSD)、環(huán)境性別決定機(jī)制(ESD)和基因-溫度性別決定機(jī)制(GSD+TE)。黃鱔()是由雌性到雄性的自然性逆轉(zhuǎn)的溫帶淡水魚，是性逆轉(zhuǎn)研究機(jī)制的模式物種。相關(guān)研究報道顯示下丘腦—腦垂體系統(tǒng)在誘發(fā)黃鱔性轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著重要的作用，也有學(xué)者在基因表達(dá)水平上對黃鱔性逆轉(zhuǎn)進(jìn)行了研究，如450、45011和1等性別相關(guān)基因表達(dá)量的變化對黃鱔的性逆轉(zhuǎn)起著重要的調(diào)節(jié)作用。黃鱔性逆轉(zhuǎn)的研究不僅對其發(fā)育機(jī)制起著非常重要的作用，也為進(jìn)一步研究脊椎動物性別分化及生物進(jìn)化提供重要的理論依據(jù)。

對于性別發(fā)育相關(guān)基因研究，基因家族一直以來都是重點(diǎn)研究對象之一。1參與許多動物的性別發(fā)育，是繼后發(fā)現(xiàn)的一個與性別決定相關(guān)的重要基因，1在基因調(diào)控系統(tǒng)中扮演著重要角色?；蚣易宄蓡T與性別決定基因和-3具有共同特征，其序列能編碼一個與DNA特異結(jié)合的、且保守的蛋白功能區(qū)域，類似于鋅指結(jié)構(gòu)的保守基序。目前研究表明，基因家族參與了多種動物的性別發(fā)育。對于脊椎動物的相關(guān)報道顯示，在多種脊椎動物中1基因功能的表達(dá)既有相似性又有特異性。HUANG等在黃鱔研究結(jié)果中報道了5個基因，即1，2，3，4和5，并利用黃鱔性腺，通過RACE技術(shù)克隆了黃鱔1的四個亞型，命名為1a，1b，1c和1d。通過實(shí)時熒光定量技術(shù)研究結(jié)果顯示，1的四個亞型是通過不同方式剪接而成的，在性腺各時期都有表達(dá)，這表明1基因在黃鱔性別決定和分化中起著重要作用。

1在進(jìn)化過程中具有高度保守性，有關(guān)報道顯示1位于性別調(diào)控途徑的上游，作為轉(zhuǎn)錄因子在雄性性腺分化、各種組織器官形成和功能維持中發(fā)揮重要調(diào)控作用。JIA等利用亞硫酸氫鈉DNA測序技術(shù)研究了翹嘴鲌()1啟動子在精巢和卵巢中的CpG甲基化模式，發(fā)現(xiàn)1的性別二態(tài)性表達(dá)受DNA甲基化調(diào)控，因此表觀遺傳修飾可能在翹嘴鲌的性腺分化中起關(guān)鍵作用。JEONG等發(fā)現(xiàn)細(xì)棘海豬魚()GATAx和C/EBPa結(jié)合位點(diǎn)可以上調(diào)1基因的表達(dá)，Sox5蛋白可以下調(diào)1的表達(dá)。這些結(jié)果表明1基因在不同物種體內(nèi)的調(diào)控作用機(jī)制會有所不同。

目前，對于黃鱔1基因5′端側(cè)翼序列克隆的研究未見報道。本研究對黃鱔1基因的5′端側(cè)翼序列進(jìn)行克隆，對其進(jìn)行測序分析，將構(gòu)建的pGL3-enhancer-1報告質(zhì)粒與海參熒光素酶內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK用Lipohigh轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染32 h后，檢測啟動子雙熒光素酶的表達(dá)活性，以期為后續(xù)揭示1基因?qū)S鱔性別分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗用魚

實(shí)驗黃鱔購自于上海市臨港新蘆苑農(nóng)貿(mào)市場，取黃鱔，切斷頸椎將其處死，打開腹腔，每管收集約100 mg的肌肉組織，-80 ℃保存?zhèn)溆?。由上海海洋大學(xué)實(shí)驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒、增強(qiáng)型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒等購自天根生化科技(北京)有限公司；DH5細(xì)胞購于天根生化(上海)有限公司；DNA聚合酶、I、I酶等購自Takara工程(上海皓嘉)有限公司；Lipohigh脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購于生工生物工程(上海)有限公司；DMEM和Opti-MEM培養(yǎng)基購于賽默飛科技(中國)有限公司；雙熒光檢測試劑盒購于翊圣生物(上海)有限公司；pGL3-enhancer報告基因載體、pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒及HEK293細(xì)胞由上海海洋大學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗室張慶華教授惠贈；本次實(shí)驗所有的引物合成及測序在生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行。

1.3 黃鱔Dmrt1基因5′端側(cè)翼序列的克隆

運(yùn)用基因組DNA提取試劑盒對黃鱔肌肉組織進(jìn)行DNA提取，并根據(jù)黃鱔1基因組序列設(shè)計引物：上游5′-3′引物GGGGTACCATTAGAATATCGTGGACAAAAATTATTTC；下游5′-3′引物GCGAGCTCAGTCCAGCACCTGCTTGCGCTGCTTGTC。以黃鱔基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：模板DNA，1 μL；10×擴(kuò)增緩沖液，5 μL；dNTP MIX，1 μL；上、下游引物，各2 μL；DNA聚合酶，1 μL；補(bǔ)加無菌去離子水至50 L。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；經(jīng)94 ℃ 15 s，退火60 ℃ 30 s，72 ℃延伸4 min，共40個循環(huán)；72 ℃徹底延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后目標(biāo)片段經(jīng)增強(qiáng)型DNA回收試劑盒進(jìn)行割膠純化。

1.4 黃鱔Dmrt1基因5′端側(cè)翼序列中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測分析

利用TESS-Transcription Element Search System在線數(shù)據(jù)庫：https://www.cbil.upenn.edu/tess對黃鱔15′端側(cè)翼序列進(jìn)行預(yù)測分析5′端側(cè)翼序列中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.5 黃鱔Dmrt1基因5′端側(cè)翼序列構(gòu)建到pGL3-enhancer載體

將回收純化的1 PCR產(chǎn)物和報告載體pGL3-enhancer同時進(jìn)行雙酶切，兩個酶切位點(diǎn)分別是Kpn I和Sac I。對酶切產(chǎn)物和pGL3-enhancer載體進(jìn)行割膠回收，利用T4 Ligase連接酶對回收的PCR產(chǎn)物和報告載體pGL3-enhancer酶切產(chǎn)物進(jìn)行16 ℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5中37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定后篩選陽性克隆送至上海生工生物公司測序，將測序正確的菌液經(jīng)質(zhì)粒提取得到pGL3-enhancer-1重組質(zhì)粒，最后對其雙酶切鑒定。

1.6 雙熒光素酶報告基因檢測

HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS-DMEM培養(yǎng)基，設(shè)置培養(yǎng)箱內(nèi)的參數(shù)為37 ℃，5% CO，每兩天傳代1次。在轉(zhuǎn)染前的24 h左右，將細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度約為1×10/孔，匯合率達(dá)到80%～90%即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過程參照Lipohigh脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑說明書，每孔中的比例為DNA∶Lipo=1∶3，將100 ng目標(biāo)質(zhì)粒(pGL3-enhancer和pGL3-enhancer-1)和10 ng內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染32 h后，進(jìn)行啟動子報告基因雙熒光素酶活性鑒定，計算出Firefly Luciferase與Renilla Luciferase的比值。轉(zhuǎn)染時細(xì)胞處理分為空白對照組pGL3-enhancer質(zhì)粒和實(shí)驗組pGL3-enhancer-1重組質(zhì)粒。每次實(shí)驗設(shè)3個復(fù)孔，每組實(shí)驗重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad Prism5軟件分析數(shù)據(jù)，單因素方差檢驗數(shù)據(jù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Means±SEM)表示。當(dāng)<0.001時，表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Dmrt1 5′端側(cè)翼序列的克隆

以黃鱔基因組DNA為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的1基因組序列設(shè)計引物，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，擴(kuò)增的條帶與目標(biāo)條帶大小一致。1 5′端側(cè)翼序列中的大小為1 500 bp左右(圖1)。

圖1 Dmrt1基因5′端側(cè)翼序列擴(kuò)增片段

2.2 黃鱔Dmrt1 5′端側(cè)翼序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

利用TESS-Transcription Element Search System在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步對潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析顯示：克隆所獲得的1 519 bp黃鱔1基因5′端側(cè)翼序列中存在多個轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)元件，如Oct-1、GATA-1、Sp1、Pit-1a和TBP等結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。其中，GATA-1、SRY、Oct-1和SP1家族蛋白和C/EBPalp的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)頻率較高。這些轉(zhuǎn)錄因子可能對黃鱔1基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。

圖2 黃鱔Dmrt1基因5′端側(cè)翼序列及功能反應(yīng)元件

2.3 黃鱔pGL3-enhancer-Dmrt1 5′端側(cè)翼序列雙酶切鑒定

pGL3-enhancer-1 5′端側(cè)翼序列經(jīng)Kpn I和Sac I雙酶切后電泳，分別得到5 000 bp左右載體片段和1 500 bp左右目的片段。其大小與預(yù)期條帶一致。經(jīng)測序證實(shí)，黃鱔1 5′端側(cè)翼序列正確，亦證明了構(gòu)建的雙熒光素酶重組報告質(zhì)粒正確(圖3)。

圖3 重組質(zhì)粒pGL3-enhancer-Dmrt1雙酶切鑒定

2.4 黃鱔pGL3-enhancer-Dmrt1 5′端側(cè)翼序列雙熒光素酶的檢測

將pGL3-enhancer質(zhì)粒和構(gòu)建的pGL3-enhancer-1重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，雙熒光素酶檢測實(shí)驗結(jié)果顯示，pGL3-enhancer-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗組的相對熒光素酶活性表達(dá)極顯著高于對照組pGL3-enhancer質(zhì)粒的活性表達(dá)(圖4)。表明構(gòu)建的pGL3-enhancer-1報告基因載體具有強(qiáng)啟動活性。

圖4 重組質(zhì)粒pGL3-enhancer-Dmrt1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后熒光素酶相對表達(dá)量

3 討論

為解析黃鱔性別分化相關(guān)作用機(jī)制，眾多學(xué)者在黃鱔性別決定和性別分化的關(guān)鍵基因方面作了許多的研究。有研究顯示，將1基因?qū)霂в行匀旧wXX的雌性青鳉()，可以使遺傳雌性體表現(xiàn)出雄性特征，誘導(dǎo)雌性發(fā)生性轉(zhuǎn)化。1基因在魚類中的表達(dá)也具有組織特異性，如黑鯛()1基因只在精巢中表達(dá)，在成熟精巢中表達(dá)水平較高；與黑鯛一樣，半滑舌鰨()中1基因僅在成熟雄性的精巢中特異表達(dá)，而在其它組織中不表達(dá)；大口黑鱸()1基因在成熟魚的精巢中表達(dá)量高，而在心臟、肝臟、大腦等其他組織中表達(dá)量弱，并在不同時期的雌雄性腺中表現(xiàn)出性別二態(tài)性，且在雌魚中表達(dá)量很低，隨著卵巢成熟逐漸降低。對半滑舌鰨的研究結(jié)果顯示1轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶能有效地誘導(dǎo)該基因的突變，通過構(gòu)建1-TALEN質(zhì)粒，并顯微注射半滑舌鰨胚胎，誘導(dǎo)了1基因突變，導(dǎo)致半滑舌鰨精巢嚴(yán)重退化，出現(xiàn)卵巢樣結(jié)構(gòu)。在尼羅羅非魚()中，1基因僅在雄性輸精管支持細(xì)胞和上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，而雌性個體中不表達(dá)，雄激素用于誘導(dǎo)XX尼羅羅非魚性逆轉(zhuǎn)時，生殖細(xì)胞周圍細(xì)胞中1基因的表達(dá)增加。其他魚類在雄性和雌性個體中也有1基因表達(dá)，如斑馬魚的1基因在精巢和卵巢中表達(dá)，經(jīng)過組織切片和原位雜交發(fā)現(xiàn)1基因在精巢和卵巢的生殖細(xì)胞中表達(dá)，表明1基因不僅參與斑馬魚的精巢發(fā)育，也可能參與斑馬魚的卵巢分化；大西洋鱈()1基因在精巢的生殖細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)水平在精子發(fā)生過程中最高；虹鱒()1基因的表達(dá)水平在已分化的精巢中較高，但在卵巢中也有表達(dá)。因此，對于雌雄異體的魚類中，1基因的表達(dá)與雄性性腺發(fā)育和性別分化密切相關(guān)。雌雄同體魚類1基因表達(dá)水平的變化與精巢的發(fā)育有關(guān)，相關(guān)研究顯示，黃鱔的1基因在精巢發(fā)育與精子形成過程中起著重要作用。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因功能不僅需要通過實(shí)驗進(jìn)行驗證，還需要通過生物信息數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，通過各種生物信息學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測。不同的預(yù)測軟件基于不同算法的基礎(chǔ)，每個軟件由于條件有限，都有一定的局限性，因此，需要使用各種合適的分析和預(yù)測軟件，整合各軟件獲得的數(shù)據(jù)，提高數(shù)據(jù)預(yù)測的正確性，為進(jìn)一步的實(shí)驗奠定堅實(shí)的基礎(chǔ)?；虻?′端側(cè)翼序列中存在作為基因表達(dá)調(diào)控中重要的順式作用元件，在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有大量信息，需要對基因5′端側(cè)翼序列的結(jié)構(gòu)有一定的認(rèn)識，基因5′端側(cè)翼序列中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)會影響基因的轉(zhuǎn)錄活性，因此，對基因5′端側(cè)翼序列的分析、結(jié)合位點(diǎn)的識別及不同物種基因5′端側(cè)翼序列差異性的研究對于基因調(diào)控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。而pGL3-enhancer是一種不含啟動子的表達(dá)載體，具有氨芐抗性和雙熒光素酶(螢火蟲熒光及海腎熒光)，且具有靈敏度高，易檢測等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于硬骨魚類基因5′端側(cè)翼序列活性分析的研究。當(dāng)啟動子片段插入載體后，經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后進(jìn)行表達(dá)檢測，當(dāng)啟動子片段表達(dá)轉(zhuǎn)錄活性時，它將驅(qū)使雙熒光素酶報告基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生不同于正常值的熒光。眾多學(xué)者利用該方法檢測基因啟動子的活性。

HE等克隆了四川裂腹魚()1 1 215 bp啟動子，并對其核心調(diào)控區(qū)域進(jìn)行了分析，測序結(jié)果顯示四川裂腹魚1基因啟動子中存在正調(diào)控和負(fù)調(diào)控區(qū)域，同時表明其甲基化水平存在性別差異，另外1的表達(dá)與其啟動子CpG甲基化顯著負(fù)相關(guān)。本試驗通過TESS-Transcription Element Search System在線數(shù)據(jù)庫對潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測顯示，黃鱔1基因啟動子序列中存在的結(jié)合位點(diǎn)，如：AP-1、Oct-1和C/EBPa等真核生物通用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)以及與性別相關(guān)基因的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，如：SRY、Sox3和Sox5等。BOYER等的研究表明，不同物種的1基因5′端側(cè)翼序列具有很大的同源性，通過比較人、豬和小鼠的基因5′端側(cè)翼序列，表明它們在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 000 bp至3 000 bp左右具有多個保守性超過60%的調(diào)控區(qū)。其中，近端調(diào)控區(qū)主要包含Sp1、Sp3和Egr1等一些通用的轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點(diǎn)，遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)包含幾個Gata因子結(jié)合位點(diǎn)。在許氏平鲉()1基因5′端側(cè)翼序列中有許多作用元件與3和9基因相同，如Oct-1、GATA-3、FOXD3和AP-1等轉(zhuǎn)錄激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)，以及與性別相關(guān)基因的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，如：Sox5、Sox9和SRY等，而SRY和Sox5結(jié)合位點(diǎn)與1基因的調(diào)控機(jī)制在魚類中已有報道。此外，在許氏平鲉1基因5′端側(cè)翼序列中，預(yù)測了C/EBPa、STATx和GATAx等結(jié)合位點(diǎn)。GAO等在斑馬魚1基因近端5′端側(cè)翼序列中存在Sox5蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，且證明Sox5蛋白能抑制1的表達(dá)。

本試驗成功克隆了黃鱔1基因5′端側(cè)翼1 519 bp序列，構(gòu)建了1基因5′端側(cè)翼序列報告基因表達(dá)載體，利用雙熒光素酶報告基因檢測實(shí)驗證明了該基因5′端側(cè)翼序列具有極顯著的啟動活性。并通過對黃鱔1基因5′端側(cè)翼序列分析、結(jié)合位點(diǎn)的識別，為進(jìn)一步研究其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控功能奠定理論基礎(chǔ)。而許多功能是通過轉(zhuǎn)錄因子之間相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用的，在今后的試驗研究中，仍需通過構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGL3-enhancer-1報告載體進(jìn)行定點(diǎn)突變、缺失，以及染色質(zhì)免疫沉淀等方法，對預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。