李川北，阮陳松杰，吳明波，徐洪森，蘇應(yīng)兵

(1.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434025；2.武漢輕工大學動物科學與營養(yǎng)工程學院，武漢 430023)

黑斑蛙()屬兩棲綱無尾目蛙科側(cè)褶蛙屬，又稱黑斑側(cè)褶蛙，在我國廣泛分布于除海南、云南、西藏、青海和臺灣以外的各地區(qū)。黑斑蛙肉具有低脂肪、低膽固醇、高蛋白的優(yōu)點，有較高的食用和藥用價值，是我國近年來養(yǎng)殖蛙類中的主要品種之一。其養(yǎng)殖具有投入少、產(chǎn)出高、周期短、效益高等特點，近年來我國黑斑蛙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展十分迅猛。然而，隨著黑斑蛙人工養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，養(yǎng)殖環(huán)境出現(xiàn)惡化，加之不成熟的養(yǎng)殖技術(shù)，黑斑蛙的病害也逐年增多，給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟損失。目前，已有致病性洛菲不動桿菌()、嗜水氣單胞菌()、氣單胞菌、肺炎克雷伯菌()、米爾伊麗莎白菌()、腦膜炎膿毒黃桿菌()和腦膜敗血伊麗莎白菌()等感染黑斑蛙后導(dǎo)致其嚴重死亡的報道。

蛙歪頭病，因蛙發(fā)病時頸部歪斜而得名，該病傳染性強，死亡率高，目前尚無穩(wěn)定有效的治療方法，是蛙養(yǎng)殖過程中常見的疾病之一。2019年7月，湖北石首市大垸農(nóng)場養(yǎng)殖黑斑蛙大面積死亡，病蛙出現(xiàn)典型的頭部變歪、單側(cè)或者雙側(cè)眼球渾濁發(fā)白和腹水癥狀，發(fā)病溫度為25～28 ℃，發(fā)病率達80%，死亡率高達90%。對病蛙腦、肝、脾和腎臟進行病原菌分離，并通過病原菌的形態(tài)特征、生理生化特性、16S rRNA基因測序與系統(tǒng)發(fā)育對分離菌株進行鑒定，確定該病原菌的種屬地位；然后通過人工感染試驗和組織病理學分析確定該病原菌的致病性；最后通過藥物敏感試驗分析該病原菌的藥物敏感性，以期為該病的臨床防治用藥提供科學指導(dǎo)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蛙

患病黑斑蛙取自湖北省石首大垸農(nóng)場，采集患有歪頭、單側(cè)或者雙側(cè)眼球渾濁發(fā)白和腹水癥狀的黑斑蛙，共20只，平均體重為(48.0±1.0)g；健康黑斑蛙購自荊州市棗林鋪黑斑蛙養(yǎng)殖基地，平均體重為(50.0±1.0)g，共140只，暫養(yǎng)于長江大學動科學院用于后續(xù)攻毒試驗。

1.1.2 主要試劑

LB固體和液體培養(yǎng)基購自青島海博有限公司，革蘭氏染色液和蘇木精伊紅染色液購自北京索萊寶科技有限公司，API 20E試劑盒購自法國梅里埃生化公司，甲醛、二甲苯、無水乙醇和固體石蠟等購自國藥集團化學試劑有限公司，藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司，Taq酶、dNTPs、細菌基因組提取試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司，PCR擴增引物合成和擴增產(chǎn)物的測序均由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司完成。

1.1.3 主要儀器

光學顯微鏡購自奧林巴斯，PCR儀器購自SensoQuest，生物組織石蠟包埋機購自湖北安立信醫(yī)療實業(yè)有限公司，石蠟切片機購自德國徠卡。

1.2 病原菌分離純化

無菌條件下從病蛙腦、肝、脾和腎等部位，用無菌接種環(huán)取樣后劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，次日挑取平板上優(yōu)勢菌落，LB固體培養(yǎng)基純化培養(yǎng)24 h，取單菌落培養(yǎng)后4 ℃保存?zhèn)溆谩哪X、肝、脾和腎四種組織中均分離到菌落形態(tài)相同的優(yōu)勢菌，選取腦組織中分離菌株為研究對象，暫命名為BSH3。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學分析

將BSH3菌株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細菌菌落形態(tài)特征與顏色，測量菌落直徑大小。挑選單菌落用革蘭氏染色液進行革蘭氏染色后，顯微鏡觀察細菌染色特征。

1.3.2 生理生化特性分析

菌株BSH3的生理生化指標使用API 20E試劑盒進行檢測，操作方法詳見該試劑盒說明書，通過APIweb鑒定軟件判讀試驗結(jié)果，并參照伯杰氏細菌鑒定手冊中細菌生理生化指標進行確認。

1.3.3 分子生物學鑒定

將菌株從LB培養(yǎng)基上用蒸餾水洗脫下來，8 000離心10 min收集菌體。按細菌DNA提取試劑盒說明書抽提細菌基因組DNA，提取的總DNA即作為PCR擴增模板。用細菌通用性引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′進行16S rRNA基因PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物送至武漢擎科生物科技有限公司測序，通過GenBank中的BLAST程序進行序列同源性分析。下載GenBank中相關(guān)細菌16S rRNA 基因序列，通過Clustal X軟件進行多重比對，用MEGA 6.0 軟件中鄰接法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 組織病理學觀察

取自然發(fā)病黑斑蛙的腦、肝、脾和腎組織(0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm)，置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h后，進行常規(guī)石蠟切片和HE染色，Olympus顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.5 人工感染試驗

健康黑斑蛙試驗前在50 cm×40 cm×30 cm的塑料筐中暫養(yǎng)2周，每框20只，共7框?？蛑屑尤肫貧馑蛊溲瓦^黑斑蛙背部，并放入一塊泡沫板。暫養(yǎng)和試驗期間水溫保持在25～28 ℃，定期換水。暫養(yǎng)前進行抽樣檢測，確定試驗用蛙不攜帶病原菌。

將分離純化的菌株BSH3接種于LB液體培養(yǎng)基28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，8 000離心10 min沉淀菌體，去上清后用無菌PBS稀釋成濃度為1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10CFU/mL的菌液。將黑斑蛙隨機分為6個感染組和1個陰性對照組，每組20只。采用大腿注射法進行人工感染，試驗組每只注射0.2 mL不同濃度菌懸液，對照組注射等體積的PBS。連續(xù)觀察8 d，每日早上9點和下午5點記錄試驗蛙的臨床癥狀及死亡情況，并將剛死亡蛙的腦組織再次進行細菌分離與鑒定。采用寇氏法計算菌株BSH3的半致死濃度(LC)。

1.6 藥物敏感試驗

采用紙片瓊脂擴散法檢測菌株BSH3藥物敏感性。首先將BSH3菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，8 000離心10 min沉淀菌體，用無菌PBS稀釋菌體至0.5個麥氏濃度，取20 μL菌懸液均勻涂布于LB固體平板上，待菌液被吸收后，向培養(yǎng)基貼不同抗生素藥敏紙片，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，并參照產(chǎn)品說明書判斷標準來判定結(jié)果。按相同方法每種藥敏紙片重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 患病黑斑蛙臨床癥狀

患病蛙的頭部出現(xiàn)向一側(cè)嚴重傾斜的癥狀(圖1a)，有些病蛙不僅具有歪頭癥狀同時也出現(xiàn)了單側(cè)或者雙側(cè)眼球渾濁發(fā)白的癥狀(圖1b、c)，另外部分病蛙出現(xiàn)腹部膨脹的癥狀(圖1d)，解剖發(fā)現(xiàn)蛙腹內(nèi)有大量淺黃色腹水，肝臟充血腫大呈黃紅相間的花斑肝(圖e)，病蛙腸道內(nèi)無食物，充滿透明狀液體(圖f)。

圖1 患病黑斑蛙病變特征

2.2 細菌形態(tài)特征

BSH3菌株在LB平板上28 ℃培養(yǎng)24 h后，可形成灰白色、圓形至橢圓形不等、中央微凸起、表面光滑、邊緣整齊，直徑在1～2 mm的小菌落(圖2a)。革蘭氏染色為革蘭氏陰性短桿菌，長1.0～2.0 μm，寬0.5～0.8 μm(圖2b)。

圖2 BSH3株形態(tài)學觀察

2.3 16S rRNA基因序列分析

通過PCR擴增和克隆測序獲得BSH3菌株的16S rRNA基因片段長度約為1 500 bp。將菌株基因序列在NCBI上進行BLAST在線對比，結(jié)果顯示，菌株BSH3與米爾伊麗莎白菌16S rRNA基因序列(登錄號：KY930330.1)的同源性達99.93%。下載GenBank中相關(guān)細菌16S rRNA基因序列，通過Clustal X軟件進行多重比對，用MEGA 6.0軟件中鄰接法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示，菌株BSH3與米爾伊麗莎白菌處于一個進化分支上。

圖3 基于16S rRNA基因構(gòu)建的菌株BSH3系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 細菌生化鑒定

生理生化結(jié)果顯示菌株BSH3能夠利用脲素、Kohn明膠、山梨醇、麥芽糖、乳糖、葡萄糖和甘露醇，不能利用鄰硝基苯-半乳糖苷、賴氨酸、鳥氨酸、檸檬酸鈉、硫代硫酸鈉、色氨酸、丙酮酸鹽、肌醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖和木糖(表1)。

表1 病原菌BSH3的生理生化特性

2.5 組織病理學

患病黑斑蛙肝臟組織出現(xiàn)大量褐色色素沉積，發(fā)生空泡變性和纖維素樣變性(圖4a)；腎小管和腎小囊出現(xiàn)玻璃樣變形，有大量炎性細胞浸潤和出血現(xiàn)象(圖4b)；脾臟組織中發(fā)生空泡變性和玻璃樣變形，并伴有炎性細胞浸潤(圖4c)；腦基質(zhì)水腫，膠質(zhì)細胞增多，神經(jīng)元細胞、膠質(zhì)細胞周圍空隙變大，基質(zhì)中存在空泡，伴有出血現(xiàn)象(圖4d)。

圖4 患病黑斑蛙組織病理學觀察

2.6 人工回歸感染試驗

菌株BSH3人工感染黑斑蛙后，蛙體出現(xiàn)不攝食，歪頭、白內(nèi)障、失去定向運動能力等神經(jīng)性損傷癥狀。菌株濃度為1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10CFU/mL時，黑斑蛙的累計死亡率分別為100%、95%、85%、65%和25%。而注射濃度為1.0×10CFU/mL或PBS時，黑斑蛙在試驗期間沒有出現(xiàn)死亡。對病死蛙腦、肝、脾和腎等組織進一步進行細菌分離鑒定，經(jīng)鑒定為米爾伊麗莎白菌()，與自然患病蛙細菌分離鑒定結(jié)果一致，表明米爾伊麗莎白菌是造成此次黑斑蛙歪頭病的病原菌。采用寇氏法計算該菌株對黑斑蛙的半數(shù)致死量(LC)為6.3×10CFU/mL(表2)。

表2 不同濃度分離菌株BSH3感染黑斑蛙死亡結(jié)果

2.7 藥敏試驗

菌株BSH3對23種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表3，結(jié)果表明分離菌株對米諾環(huán)素、氟苯尼考、利福平和萬古霉素敏感，對氧哌嗪青霉素、羧芐西林、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、恩洛沙星和萘啶酸中度敏感，對青霉素G、阿莫西林、氨芐青霉素、頭孢氨芐、頭孢他啶、頭孢克洛、氨曲南、吡哌酸、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、丁胺卡那、新霉素和多粘菌素B等多種藥物耐藥。

表3 菌株BSH3的藥敏試驗結(jié)果

3 討論

3.1 歪頭病病原及主要癥狀

歪頭病是蛙類養(yǎng)殖過程中危害較大的疾病之一，通常還伴有白內(nèi)障、腹水等并發(fā)癥。不同患病個體表現(xiàn)出來的具體癥狀也有所不同，急性患病個體只表現(xiàn)出歪頭癥狀，不表現(xiàn)白內(nèi)障和腹水等癥狀；而在慢性患病個體中，歪頭、白內(nèi)障和腹水三種癥狀均可表現(xiàn)出來。導(dǎo)致病蛙出現(xiàn)急性和慢性感染的主要原因是細菌感染的部位不同，在急性歪頭病蛙中只能從腦部分離到大量病菌，而在出現(xiàn)三種癥狀的慢性病蛙可以同時從眼、腦、肝、腎和腹水等部位分離到相同致病菌。本實驗中，患病黑斑蛙臨床特征主要表現(xiàn)為食欲減退，歪頭，白內(nèi)障和腹水等，這與Hu等報道的米爾伊麗莎白菌引起黑斑蛙歪頭病的結(jié)果一致。其中，歪頭和白內(nèi)障具有代表性，可以作為臨床上診斷該病的重要依據(jù)。

在魚類和蛙養(yǎng)殖過程中均有白內(nèi)障病的報道，但引起兩者出現(xiàn)白內(nèi)障的病原存在差異。引起魚類眼球表面出現(xiàn)白內(nèi)障的病原為寄生蟲，如復(fù)口吸蟲()的尾蚴和囊蚴等可以引起魚類白內(nèi)障病。目前，已報道的棘胸蛙()、青蛙()、黑斑蛙()、棘腹蛙()、牛蛙()、虎紋蛙()、刺蛙()等蛙類白內(nèi)障(歪頭)則均是由細菌引起。其中，主要是由伊麗莎白菌屬(spp.)的腦膜敗血伊麗莎白菌()所引起。

3.2 米爾伊麗莎白菌的致病性

米爾伊麗莎白菌為革蘭氏陰性桿菌，隸屬于黃桿菌科()伊麗莎白菌屬，廣泛分布于淡水和土壤中。2003年該菌首次從和平空間站冷凝水中被分離到。此后，研究發(fā)現(xiàn)該菌可引起人類腹膜炎、肺炎、腦膜炎、蜂窩組織炎、敗血癥和眼部感染等癥狀。米爾伊麗莎白菌可感染多種無尾類動物，在黑斑蛙、刺蛙、豹蛙()、樹蛙()和微蹼鈴蟾()等中均有發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)歪頭、白內(nèi)障和腹水等癥狀，并導(dǎo)致大量患病死亡。本研究中，人工回歸感染試驗表明米爾伊麗莎白菌BSH3的半數(shù)致死量為6.3 × 10CFU/mL，具有較強的致病性。然而，Huang等研究中，米爾伊麗莎白菌的致死率相對偏低，說明不同分離株的致病力存在差異。

實驗對患病蛙腦、肝、脾和腎臟進行組織病理觀察，發(fā)現(xiàn)米爾伊麗莎白菌感染黑斑蛙后可引起蛙這些組織損傷。尤其是蛙腦基質(zhì)輕度水腫，膠質(zhì)細胞明顯增多，膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞周圍空隙增大，基質(zhì)中有空泡。這與伊麗莎白菌引起蛙類腦部病理觀察結(jié)果是一致的。當蛙體質(zhì)下降并受到病原侵害時，病原躲過了蛙體的免疫防御，在蛙體內(nèi)定植并不斷繁殖，沿著某種路徑侵入大腦，造成大腦的各類炎癥和機能障礙，出現(xiàn)了歪頭、旋游、定向能力失調(diào)的癥狀。另外，病蛙肝、脾和腎臟出現(xiàn)變性、壞死和炎癥細胞浸潤等病變。由此可見，患病的黑斑蛙病灶并不僅僅局限于腦部，其他內(nèi)臟器官也不同程度受到感染且更加嚴重，多器官壞死、衰竭最終加速了病蛙的死亡。本實驗中從病蛙的腦、肝、脾、腎組織中均分離到致病菌株，暗示病原菌是導(dǎo)致蛙組織損傷的原因。胡瑞雪從患病蛙腦組織分離到一株米爾伊麗莎白菌FL160902，該菌可引起蛙肝、脾、腎、腦不同程度的損傷，其中以腦部病變最為明顯。此外，秦振陽從湖南岳陽發(fā)生歪頭病的黑斑蛙腦部、眼球、肝臟、卵巢等多處組織器官分離到一株米爾伊麗莎白菌分離株HNW1681，可以引起蛙心臟、肝臟、腦、眼等不同程度的病理變化。這些研究表明米爾伊麗莎白菌對黑斑蛙的感染是呈全身性的，并且引起蛙全身性組織損傷。

3.3 黑斑蛙歪頭病的防控建議

本實驗藥敏試驗結(jié)果顯示，米爾伊麗莎白菌BSH3僅對米諾環(huán)素、氟苯尼考、利福平和萬古霉素四種藥物敏感。然而，利福平和萬古霉素這兩種藥在水產(chǎn)上是禁用藥，所以在黑斑蛙患歪頭病時應(yīng)禁止使用。米諾環(huán)素和氟苯尼考是農(nóng)業(yè)部批準使用的水產(chǎn)藥物，生產(chǎn)中可用鹽酸米諾環(huán)素粉劑100 g拌料1 000 kg，連用5～7 d或每kg體重拌飼投喂15～20 mg氟苯尼考粉，每天一次，連用3～5 d。但過度使用米諾環(huán)素易使水體污染和對水生生物產(chǎn)生毒性作用，因此生產(chǎn)中盡量不使用米諾環(huán)素治療黑斑蛙歪頭病。吳興鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)五味子、柯子、半枝蓮、五倍子，烏梅等植物性藥物在控制伊麗莎白菌感染時起到了良好的效果，加強植物性藥物的研發(fā)與使用可能是將來有效防治伊麗莎白菌病的重要途徑。此外，米爾伊麗莎白菌能夠侵害蛙的神經(jīng)器官，比如大腦，可以在細胞間基質(zhì)外生存，甚至少數(shù)細菌可以進入細胞質(zhì)。在治療該病時，可以考慮使用一些更容易穿透血腦屏障的脂溶性藥物，如磺胺類藥物。周永燦等研究發(fā)現(xiàn)腦膜炎敗血伊麗莎白菌全菌疫苗能夠在一定程度上預(yù)防虎紋蛙白內(nèi)障疾病的發(fā)生，這為利用免疫學方法防控伊麗莎白菌病提供了理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中需要采用“以防為主，防治結(jié)合”的綜合防治方法?？股氐拈L期使用會導(dǎo)致細菌耐藥性的產(chǎn)生和水體環(huán)境的污染。應(yīng)用疫苗開展疾病的免疫防治不僅可以提高動物自身的免疫水平、增強機體的抗病能力，而且還符合綠色環(huán)保的要求，將是水生動物疾病防治的主流發(fā)展方向。

4 結(jié)論

本研究通過形態(tài)學、生理生化特性分析與分子生物學相結(jié)合的方法，從患歪頭病黑斑蛙體內(nèi)分離到致病菌株米爾伊麗莎白菌，名命為BSH3。病理組織觀察米爾伊麗莎白菌可以引起黑斑蛙全身性組織病理損傷。通過藥物敏感試驗，初步篩選出氟苯尼考可用于黑斑蛙歪頭病的防控。