黃成裕，高世科，張家銳，王凌霄，張 碩,2,3

(1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.長(zhǎng)江口水生生物監(jiān)測(cè)與保護(hù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

酶是催化生物反應(yīng)的一類特殊的蛋白質(zhì)，生物體中的化學(xué)反應(yīng)絕大部分都是在催化劑的作用下進(jìn)行。酶的活性可以被調(diào)節(jié)，且與不同能量形式的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。在酶系統(tǒng)中，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)等抗氧化酶具有清除生物體活性氧自由基的功能，對(duì)增強(qiáng)細(xì)胞防御能力、提高生物體免疫力具有重要作用。而溫度是影響抗氧化酶活性高低的重要因素之一，過高或過低的溫度都會(huì)導(dǎo)致酶活性下降。因此，研究急性溫度脅迫下抗氧化酶的變化，可以深入了解生物體對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)。

雙帶隱帶麗魚()隸屬于輻鰭魚綱(Actinopterygii)鱸形目(Perciformes)麗魚科(Cichlidae)。在我國(guó)，雙帶隱帶麗魚具有良好的商業(yè)價(jià)值，近年來隨著生活水平的提高，越來越多人開始嘗試飼養(yǎng)這一體型小、色彩艷麗的魚種，但因其對(duì)繁殖和生長(zhǎng)環(huán)境要求較高，尤其是對(duì)于溫度等環(huán)境因子的適應(yīng)性，國(guó)內(nèi)未能形成規(guī)?；庇虼私^大部分商品魚依靠進(jìn)口，常因水質(zhì)環(huán)境的不適導(dǎo)致較高的運(yùn)輸損耗，因此價(jià)格居高不下，阻礙了該魚種在國(guó)內(nèi)觀賞魚市場(chǎng)的普及和發(fā)展。作為變溫動(dòng)物的魚類廣泛棲息于不同的溫度環(huán)境中，環(huán)境溫度對(duì)其影響更加劇烈。當(dāng)生存水域改變時(shí)，高溫和低溫環(huán)境下都會(huì)導(dǎo)致魚類免疫力下降，容易生病甚至死亡。因此，環(huán)境溫度直接影響到雙帶隱帶麗魚的生長(zhǎng)和生存，并且雙帶隱帶麗魚的人工養(yǎng)殖過程也會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)因季節(jié)更替、氣候變化及人為因素等原因?qū)е滤疁爻霈F(xiàn)節(jié)律性或突發(fā)性的溫度驟變，從而對(duì)其造成一定程度的高溫或低溫脅迫影響。已有研究表明，麗魚科魚類的棲息水溫在22～32 ℃之間，但目前尚無雙帶隱帶麗魚的急性溫度脅迫和免疫應(yīng)答及酶活性方面的研究。

本試驗(yàn)研究了雙帶隱帶麗魚在急性溫度脅迫環(huán)境中的免疫相關(guān)酶活性變化，分析了急性溫度脅迫對(duì)雙帶隱帶麗魚抗氧化及免疫指標(biāo)活性的影響，以期為推動(dòng)和加深雙帶隱帶麗魚的人工養(yǎng)殖技術(shù)，為優(yōu)化雙帶隱帶麗魚的運(yùn)輸技術(shù)提供重要的參考依據(jù)，為后續(xù)深入研究雙帶隱帶麗魚對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚及暫養(yǎng)條件

2021年4月于遼寧Apisto Family水族工作室購(gòu)進(jìn)規(guī)格為(3.0±0.3)cm、平均體重(1.5±0.5)g的雙帶隱帶麗魚500尾，隨機(jī)挑選體質(zhì)健壯、規(guī)格均勻、體表干凈無病癥且游動(dòng)正常的150尾為試驗(yàn)對(duì)象。在規(guī)格為0.8 m×0.5 m×0.6 m的水槽中暫養(yǎng)1周。暫養(yǎng)條件設(shè)定為：水溫為26 ℃，pH為7.50±0.15，溶解氧含量高于8 mg/L，暫養(yǎng)用水使用曝氣過的自來水(充氣暴曬3 d)，每周換水1/5。暫養(yǎng)期間按每條雙帶隱帶麗魚體重的10%的投喂足量飼料，飼料采用小型慈鯛科專用餌料(德國(guó)莫斯特)，投餌于早上8:00和晚上6:00進(jìn)行，試驗(yàn)開始前24 h停止投喂。光照周期采用12L:12D。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用規(guī)格為0.3 m×0.3 m×0.3 m的方形玻璃水槽，水槽注入25 L預(yù)先曝氣過的自來水，每組水槽放置恒溫設(shè)備和氣動(dòng)式過濾。試驗(yàn)開始前將水槽遮光封閉處理，試驗(yàn)共三組，試驗(yàn)溫度設(shè)置為20、26、32 ℃(由預(yù)實(shí)驗(yàn)可知，26 ℃為魚體最佳生存溫度，當(dāng)雙帶隱帶麗魚處于22 ℃、30 ℃時(shí)，魚體機(jī)能開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，表現(xiàn)為行動(dòng)力下降，日攝食率、日生長(zhǎng)率均開始下降)，其中20 ℃、32 ℃兩組為試驗(yàn)組，26 ℃組為對(duì)照，試驗(yàn)開始后,將暫養(yǎng)的雙帶隱帶麗魚隨機(jī)放入3個(gè)溫度組各50尾，試驗(yàn)組勻速升/降溫至32 ℃、20 ℃，對(duì)照組保持26 ℃水溫，試驗(yàn)期間暫停投喂。本實(shí)驗(yàn)使用自動(dòng)控溫系統(tǒng)對(duì)各水槽升/降溫，速率為1 ℃/h，直至達(dá)到試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)溫度保持1 d后以相同速率降/升溫至26 ℃進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng),分別在升/降溫試驗(yàn)前及試驗(yàn)后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h進(jìn)行采樣，每次每組取6尾,三組共18尾，試驗(yàn)做2次重復(fù)。

1.3 樣品采集與酶活指標(biāo)測(cè)定

將雙帶隱帶麗魚稱重后快速殺死后放入20 mL玻璃勻漿器，按比例加入預(yù)冷的0.65%生理鹽水，冰浴勻漿制成10%的勻漿液，按照試劑盒說明進(jìn)行離心取上清液，最后將其稀釋成不同種酶測(cè)試所需的最適濃度，置于-20 ℃冰箱待測(cè)。

試驗(yàn)采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定，包括免疫球蛋白M(IgM)測(cè)定、酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、SOD、GSH、CAT、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和溶菌酶(Lysozyme,LZM)。其中，組織勻漿酶活性用U/g可溶性蛋白(prot)表示，個(gè)別酶含量單位以試劑盒為準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析，差異的顯著性以<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，運(yùn)用Excel 2020繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 急性溫度脅迫對(duì)雙帶隱帶麗魚抗氧化指標(biāo)的影響

2.1.1 ACP活性

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品ACP活性的變化如圖1所示，可以看出，隨著時(shí)間的變化，在20 ℃和32 ℃處理組的ACP活性出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，26 ℃時(shí)各處理組間差異均不顯著；20 ℃組在試驗(yàn)后0 h ACP含量最低，為0.009 3 U/gport；32 ℃組在脅迫6 h時(shí)ACP含量最低，為0.010 8 U/gport，20 ℃組ACP含量變幅較大。在所有溫度組下，雙帶隱帶麗魚樣品的ACP活性均在48 h后趨于平衡。

圖1 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的ACP活性變化

2.1.2 ALP活性

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品ALP活性的變化如圖2所示。與ALP活性的變化趨勢(shì)一致，在20 ℃和32 ℃處理組的ALP活性出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，26 ℃各處理組差異均不顯著20 ℃組在試驗(yàn)后0 h ALP含量最低，為0.010 4 U/gport；32 ℃組則在脅迫6 h ALP含量最低，為0.003 8 U/gport，32 ℃組ALP變幅較大。但是，在剛開始實(shí)驗(yàn)階段，20 ℃處理組的ALP活性的下降程度不如ACP活性。在所有溫度組下，雙帶隱帶麗魚樣品的ALP活性均在24 h后趨于平衡。

圖2 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的ALP活性變化

2.1.3 CAT活性

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品CAT活性的變化如圖3所示。不同于ALP和ACP活性，CAT活性在20 ℃處理組出現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，在32 ℃處理組出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，26 ℃各處理組差異均不顯著；20、32 ℃組CAT最低值均在脅迫6 h時(shí)出現(xiàn)，分別為0.329 4 U/gport、0.968 0 U/gport，32 ℃組恢復(fù)水平相對(duì)較差。而在所有溫度組下，雙帶隱帶麗魚樣品的CAT活性均是在48 h后趨于平衡。

圖3 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的CAT活性變化

2.1.4 SOD活性

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品SOD活性的變化如圖4所示。SOD活性在20 ℃處理組和32 ℃處理組的變化趨勢(shì)一致，均是出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，26 ℃各處理組差異均不顯著；試驗(yàn)后0 h、6 h、12 h時(shí)20 ℃與32 ℃ SOD含量較低。在所有溫度組下，雙帶隱帶麗魚樣品的SOD活性在48 h后趨于平衡，但均出現(xiàn)潛在上升的趨勢(shì)。

圖4 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的SOD活性變化

2.1.5 GSH含量

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品GSH含量的變化如圖5所示。與MDA含量的變化趨勢(shì)一致，GSH含量在20 ℃處理組和32 ℃處理組出現(xiàn)先上升到12 h達(dá)到最高值，而后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)；在26 ℃時(shí)，試驗(yàn)前后0 h及6～72 h GSH含量變化較為平緩，各處理組差異均不顯著；在脅迫6 h后20 ℃與32 ℃組GSH含量均達(dá)到峰值且相近，分別為63.57 U/gport、60.42 U/gport，隨后隨時(shí)間逐步恢復(fù)。在所有溫度組下，雙帶隱帶麗魚樣品的GSH含量均可能在48 h甚至72 h后趨于平衡。

圖5 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的GSH含量變化

2.1.6 MDA含量

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品MDA含量的變化如圖6所示。與酶活性的趨勢(shì)不同，MDA含量在20 ℃處理組和32 ℃處理組出現(xiàn)脅迫6 h時(shí)先上升到達(dá)到最高值，而后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，兩溫度組峰值分別為28.15 U/gport、23.16 U/gport；26 ℃各處理組差異均不顯著。在所有溫度組下，雙帶隱帶麗魚樣品的MDA含量均是在48 h后趨于平衡。

圖6 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的MDA含量變化

2.2 急性溫度脅迫對(duì)雙帶隱帶麗魚免疫能力的影響

2.2.1 LZM活性

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品LZM活性的變化如圖7所示。與MDA含量的變化趨勢(shì)一致，LZM活性在20 ℃處理組出現(xiàn)脅迫6 h時(shí)先上升到達(dá)到最高值而后下降的趨勢(shì)，峰值為20.35 U/gport，在32 ℃處理組最高值出現(xiàn)在脅迫6 h時(shí)，然后呈下降的趨勢(shì)，峰值為18.34 U/gport，26 ℃各處理組差異均不顯著。在所有溫度組下，LZM活性均是在24 h后趨于平衡。

圖7 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的LZM活性變化

2.2.2 IgM含量

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品IgM含量的變化如圖8所示。在26 ℃處理組下，IgM含量隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而在20 ℃處理組和32 ℃處理組下IgM含量在脅迫溫度達(dá)到目標(biāo)溫度后隨時(shí)間呈先下降后上升的趨勢(shì)。3個(gè)溫度組的IgM含量隨時(shí)間增加，IgM含量趨于集中，在48 h后均有上升趨勢(shì)。

圖8 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的IgM含量變化

3 討論

3.1 急性溫度脅迫對(duì)雙帶隱帶麗魚抗氧化指標(biāo)的影響

溫度與魚類的各項(xiàng)生理活動(dòng)密不可分，水溫變化會(huì)對(duì)魚類的行為、抗氧化防御系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生間接或直接影響。有研究表明水溫的突變(驟增或驟降)對(duì)雙帶隱帶麗魚產(chǎn)生了較強(qiáng)的脅迫作用，打破了魚體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS)，進(jìn)而對(duì)魚體造成一定程度的損傷。

SOD和CAT是抗氧化酶防御體系中非常重要的功能酶，聯(lián)合起來擁有清除ROS的能力，其酶活性下降意味著機(jī)體清除ROS的能力下降。在本研究中，20 ℃處理組下SOD和CAT活性隨時(shí)間的變化趨勢(shì)與32 ℃處理組基本相同，且恢復(fù)至正常狀態(tài)所需時(shí)間也基本一致，說明與正常溫度的溫差越大，對(duì)雙帶隱帶麗魚SOD和CAT活性的影響越大。強(qiáng)俊等在研究溫度與鹽度對(duì)吉富品系尼羅羅非魚幼魚生長(zhǎng)和肝臟抗氧化酶活性的協(xié)同影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，溫度高于29 ℃時(shí)，吉富品系尼羅羅非魚幼魚SOD和CAT活性明顯下降；在溫度16 ℃時(shí)，SOD和CAT活性最低，與本研究結(jié)果一致。在試驗(yàn)后0-24 h這個(gè)階段，20 ℃和32 ℃處理組的SOD和CAT活性顯著低于26 ℃處理組，因此魚體可以通過提高SOD和CAT活性來應(yīng)對(duì)急性溫度變化產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)對(duì)魚體的影響。但是在12-24 h這個(gè)時(shí)間段中，32 ℃處理組的CAT活性上升的幅度比SOD活性更大，說明高溫脅迫下雙帶隱帶麗魚體內(nèi)的CAT活性調(diào)控機(jī)制可能比SOD活性更快速。

GSH是一種低分子自由基清除劑，是清除ROS非常重要的非酶抗氧化物質(zhì)，其與SOD和CAT的作用機(jī)理一致，都是清除細(xì)胞中ROS和過氧化氫(HO)。在本實(shí)驗(yàn)雙帶隱帶麗魚在20 ℃和32 ℃處理組的GSH含量的變化趨勢(shì)一致，說明高、低脅迫溫度使得雙帶隱帶麗魚處于應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體產(chǎn)生越多的ROS，SOD和CAT活性會(huì)下降，使得底物GSH的含量上升，但與SOD和CAT活性的變化趨勢(shì)不同點(diǎn)在于，GSH含量是在48h后才達(dá)到平衡。這可能是由于SOD將機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的ROS分解成過多的HO，而CAT未完全將HO分解為氧分子和水，導(dǎo)致GSH作為底物繼續(xù)被GSH-Px消耗，以此清除剩余的HO。

MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用的產(chǎn)物之一，它能加劇細(xì)胞膜的損傷，反映組織細(xì)胞受ROS攻擊的程度，從而間接反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱。盡管MDA在20 ℃和32 ℃處理組的GSH含量的變化趨勢(shì)一致，但試驗(yàn)后6～24 h內(nèi)，20 ℃處理組的MDA含量顯著高于32 ℃處理組，說明低溫脅迫對(duì)雙帶隱帶麗魚造成的氧化損傷高于高溫脅迫，由此生成大量的SOD和CAT來抵抗過量的ROS。這與謝明媚等和管敏等的研究急性溫度脅迫對(duì)銀鯧()幼魚和史氏鱘()幼魚抗氧化和免疫指標(biāo)中的MDA變化趨勢(shì)均不同，這可能與魚類的物種、年齡及應(yīng)激時(shí)間等不同有關(guān)。

3.2 急性溫度脅迫對(duì)雙帶隱帶麗魚磷酸酶活性的影響

ACP和ALP是兩種參與免疫防御系統(tǒng)的重要水解酶，普遍存在于生物體內(nèi)，可催化各種含磷化合物的水解過程，在生物體抵抗疾病、免疫反應(yīng)和細(xì)胞損傷與修復(fù)過程中起著重要的作用。ACP和ALP活性的降低表明生物體可能在低溫脅迫下機(jī)體生命代謝能力減弱或免疫調(diào)節(jié)功能下降。本研究中，隨著脅迫溫度的變化和時(shí)間的遷移，20 ℃和32 ℃處理組雙帶隱帶麗魚的ACP和ALP活性均呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)，這與白海文等研究溫度對(duì)史氏鱘以及金一春等研究濕度對(duì)白斑狗魚()免疫功能影響的變化趨勢(shì)一致。這表明短時(shí)間內(nèi)(24 h)的高溫或低溫脅迫會(huì)顯著抑制雙帶隱帶麗魚體內(nèi)的ACP和ALP活性，出現(xiàn)免疫疲勞，降低機(jī)體的免疫防御能力，而經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的高、低溫脅迫，雙帶隱帶麗魚的ACP和ALP活性變化趨于與26 ℃處理組一致，說明雙帶隱帶麗魚很有可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫防御能力，使其能夠盡快適應(yīng)這種極端的溫度環(huán)境變化，但這是否對(duì)該種魚類之后的行為、生理或代謝水平產(chǎn)生不良影響，有待進(jìn)一步研究。

3.3 急性溫度脅迫對(duì)雙帶隱帶麗魚免疫指標(biāo)的影響

LZM是魚體非常重要的免疫因子，它可以破壞革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，從而瓦解細(xì)菌細(xì)胞，其活性與水溫、鹽度等環(huán)境因子密切相關(guān)。本研究中LZM活性在20 ℃和32 ℃處理組的變化趨勢(shì)一致，但在試驗(yàn)后0～24 h內(nèi)，20 ℃處理組的LZM活性顯著高于32 ℃處理組，說明低溫脅迫比高溫脅迫更能促使雙帶隱帶麗魚產(chǎn)生更多的LZM，從而形成保護(hù)機(jī)制，對(duì)機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生了顯著的抑制作用。這與管敏等和童燕等的研究結(jié)果類似，即隨著溫度和鹽度的增加，史氏鱘血清中的LZM活性先上升后下降。但是，這一保護(hù)機(jī)制也可能與魚種以及脅迫強(qiáng)度有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

IgM是魚體內(nèi)一種重要的免疫球蛋白，是機(jī)體受抗原刺激后最先產(chǎn)生的抗體，其在血液中的含量是評(píng)價(jià)魚體免疫應(yīng)答反應(yīng)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本研究中，26 ℃組雙帶隱帶麗魚的IgM含量變化無規(guī)律性，但數(shù)值變動(dòng)較大，可能是由于應(yīng)激反應(yīng)造成的結(jié)果，20 ℃、32 ℃組呈先降低后升高的趨勢(shì)，且隨時(shí)間變化，IgM含量趨于集中，20 ℃處理組的變化幅度更大一些，表明高溫脅迫的作用較為明顯，而低溫脅迫可能會(huì)對(duì)雙帶隱帶麗魚的免疫功能產(chǎn)生抑制作用。這與謝明媚等、管敏等、何杰等的研究結(jié)果相同。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究表明，高溫或是低溫脅迫下，雙帶隱帶麗魚的ACP、ALP、CAT和SOD顯著降低，GSH、LZM和MDA含量顯著增加，在恢復(fù)培養(yǎng)過程中逐步趨于與對(duì)照組相近，環(huán)境變動(dòng)會(huì)影響魚體的抗氧化防御系統(tǒng)和免疫機(jī)能。因此，在24 h之內(nèi)，養(yǎng)殖過程中遇到急性溫度變化時(shí)作出補(bǔ)救措施是著實(shí)有效的，運(yùn)輸過程中保持26 ℃左右的水溫有助于保護(hù)魚類的身體機(jī)能，避免造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。