蔡文啟，唐 佳，吳川良，張開(kāi)典，周 智

（1.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，?？?570228; 2.三亞珊瑚礁生態(tài)研究所，三亞 572000）

珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)擁有較高的初級(jí)生產(chǎn)力和生物多樣性，為人類提供了極具價(jià)值的生態(tài)服務(wù)功能，比如豐富的漁業(yè)和旅游資源[1?2]。作為珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的主要框架生物，造礁石珊瑚的生長(zhǎng)得益于共生蟲(chóng)黃藻提供的光合作用產(chǎn)物，其能滿足珊瑚的大部分能量需求。作為交換，造礁石珊瑚能為共生蟲(chóng)黃藻提供光合作用所需的二氧化碳（CO2）、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)和穩(wěn)定的環(huán)境。但是，近年來(lái)表層海水升溫和海洋環(huán)境污染威脅著造礁石珊瑚與蟲(chóng)黃藻的共生關(guān)系，共生關(guān)系的破裂將進(jìn)一步導(dǎo)致珊瑚白化或死亡，珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)呈不斷退化趨勢(shì)[3?5]。隨著人類對(duì)海岸帶的開(kāi)發(fā)日益加劇，海水懸浮物（Suspended solid）已經(jīng)成為近岸珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的主要脅迫因子之一。大量陸源顆粒物質(zhì)隨地表徑流輸入珊瑚礁區(qū)，造成海水懸浮物濃度顯著升高，同時(shí)水體濁度也明顯增加。海水懸浮物會(huì)產(chǎn)生遮蔽效應(yīng)，降低共生蟲(chóng)黃藻的光合效率[6?7]。懸浮物還會(huì)緩慢釋放出氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)水體中其他藻類的爆發(fā)生長(zhǎng)，進(jìn)一步加劇該遮蔽效應(yīng)。海水懸浮物濃度的升高能對(duì)造礁石珊瑚的生存產(chǎn)生諸多消極影響，從而不利于珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，但相關(guān)了解仍然十分有限。

本研究于2020年5?9月期間調(diào)查了3個(gè)礁區(qū)（崖州灣、鳳凰島和西島）的海水懸浮物質(zhì)量濃度，并測(cè)定了礁區(qū)中普哥濱珊瑚（Porites pukoensis）的共生蟲(chóng)黃藻密度、葉綠素a+c2含量，以及共生雙方的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST）、一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）和酚氧化物酶（Phenoloxidase，PO）的活力，進(jìn)而分析礁區(qū)懸浮物質(zhì)量濃度差異對(duì)普哥濱珊瑚生理活性的影響，以期揭示造礁石珊瑚對(duì)高濃度懸浮物的的生理適應(yīng)機(jī)制。此外，本研究還挑選了敏感生物標(biāo)志物構(gòu)建綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，旨在用以評(píng)估懸浮物對(duì)普哥濱珊瑚的影響程度。

1 材料與方法

1.1 礁區(qū)取樣于 2020 年 5?9 月期間，每月在三亞崖州灣（18°19′13″N，109°8′47″E）、鳳凰島（18°14′27″N，109°29′05″E）和西島（18°14′28″N，109°21′54″E）3 個(gè)礁區(qū)進(jìn)行取樣。每次每個(gè)站點(diǎn)用采水器取5份1.5 L表層海水，同時(shí)潛水員下潛至水下3 m左右，用錘子和鑿子鑿取5塊不同親本的普哥濱珊瑚樣品。海水裝在卡蓋式采樣瓶?jī)?nèi)低溫避光保存，珊瑚立即置于鋁箔袋并在干冰中保存。海水和珊瑚樣品均于當(dāng)日運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取樣位置見(jiàn)圖1。

1.2 實(shí) 驗(yàn) 試 劑磷 酸 鹽 緩 沖 溶 液 （PBS, 377 mmol·L?1NaCl， 2.7 mmol·L?1KCl， 8.09 mmol·L?1Na2HPO4， 1.47 mmol·L?1KH2PO4 ，pH7.4 ） ，100%丙酮，4% 甲醛，10 mmol·L?1左旋多巴（L-DOPA）溶液，總SOD測(cè)定試劑盒（A001-1-1，南京建成生物工程研究所有限公司），CAT測(cè)定試劑盒（A007-1-1，南京建成生物工程研究所有限公司），GST測(cè)定試劑盒（A004-1-1，南京建成生物工程研究所有限公司），總NOS測(cè)定試劑盒（A014-2-2，南京建成生物工程研究所有限公司），BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒（C503021-0500，上海生工生物工程股份有限公司）。

1.3 海水懸浮物濃度的測(cè)定海水中的懸浮物濃度的測(cè)定嚴(yán)格按照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》（GB 17378.4－2007）[8]第4部分進(jìn)行。先將0.45 μm孔徑的濾膜（TJMF60，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）放置于50 ℃恒溫干燥箱中6～8 h烘干至恒重，然后用電子分析天平（BSA224S-CW，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）稱重，并放入硅膠干燥器中保存。過(guò)濾時(shí)，用不銹鋼鑷子將烘干濾膜取出，放置在搭配有隔膜真空泵（GM-0.5A，天津市滕津?qū)嶒?yàn)設(shè)備有限公司）的濾器內(nèi)。過(guò)濾1 L表層海水后，將濾膜置于50 ℃恒溫干燥箱中充分干燥，再用電子分析天平稱量濾膜質(zhì)量。海水懸浮物質(zhì)量濃度計(jì)算公式：

1.4 共生蟲(chóng)黃藻的密度測(cè)定使用裝有過(guò)濾海水（經(jīng)0.22 μm孔徑的濾膜過(guò)濾）的Waterpik洗牙器（WP-462EC，潔碧有限公司）沖洗普哥濱珊瑚的表面組織。取 1 mL 沖洗液，7 204 r·min?14 ℃ 離心 10 min，將共生蟲(chóng)黃藻沉淀重懸于 0.2 mL 4%甲醛溶液中，在光學(xué)生物顯微鏡（E100，尼康儀器有限公司）下使用Sedgwick-Rafter計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)[9]。采用鋁箔紙包裹法[10]計(jì)算被沖洗的珊瑚骨骼表面積。共生蟲(chóng)黃藻密度計(jì)算公式：

1.5 共生蟲(chóng)黃藻的葉綠素含量測(cè)定取上述 2 mL沖洗液，7 204 r·min?14 ℃ 離心 10 min，然后用 PBS清洗共生蟲(chóng)黃藻沉淀，重復(fù)離心清洗直至鏡檢無(wú)珊瑚組織碎屑。向共生蟲(chóng)黃藻沉淀中加入2 mL 100% 丙酮溶液，4 ℃ 下萃取 24 h。最后，11 617 r·min?1離心 15 min，采用可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1100，上海美譜達(dá)儀器有限公司）分別在630 nm和663nm處測(cè)量萃取液的吸光值[11]。葉綠素a+c2的總含量參照J(rèn)EFFREY等[12]的方程計(jì)算，每個(gè)共生蟲(chóng)黃藻的葉綠素含量表示為 pg·cell?1[13]。

1.6 普哥濱珊瑚及其共生蟲(chóng)黃藻的酶活指標(biāo)測(cè)定用裝有預(yù)冷 PBS（4 ℃）的洗牙器沖洗普哥濱珊瑚的表面組織，取 6 mL 沖洗液于 7 204 r·min?14 ℃ 離心 10 min，取上清液用于珊瑚酶活的檢測(cè)。然后用2 mL PBS重懸共生蟲(chóng)黃藻沉淀，重復(fù)離心清洗直至鏡檢無(wú)珊瑚組織碎屑。加入0.5 g氧化鋯破碎珠（0.5 mm 粒徑，11079105z，上海睿鉑賽生物科技有限公司）和1 mL預(yù)冷PBS，用生物樣品均質(zhì)儀（Bioprep-24，杭州奧盛儀器有限公司）徹底破碎共生蟲(chóng)黃藻細(xì)胞，參數(shù)為振幅 6 m·s?1，每破碎 1 min 冰浴 3 min。最后，7 204 r·min?14 ℃離心10 min，取上清液用于共生蟲(chóng)黃藻酶活的檢測(cè)。使用SOD、CAT、NOS和GST檢測(cè)試劑盒測(cè)定上述上清液中的總酶活力。珊瑚的PO總活性測(cè)定參考PALMER[14]描述的方法，將珊瑚上清液與L-DOPA溶液反應(yīng)后于490 nm處測(cè)定吸光值用以表示其總酶活力。最后，采用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清液中的總蛋白濃度。將普哥濱珊瑚及其共生蟲(chóng)黃藻的總酶活力除以蛋白濃度，計(jì)算得出相應(yīng)的酶比活力（U·mg?1或 ΔOD490mg?1·min?1）。

1.7 數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用雙因素方差分析不同站點(diǎn)的海水懸浮物濃度差異。采用PCA分析普哥濱珊瑚及其共生蟲(chóng)黃藻的各項(xiàng)生理活性指標(biāo)主效應(yīng)，采用Spearman秩方法分析海水懸浮物濃度與各生理指標(biāo)之間的相關(guān)性。綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)（Integrated Biomarker Response）指數(shù)分析參照文獻(xiàn)[15]的方法。統(tǒng)計(jì)分析的顯著差異定義為P＜ 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 個(gè)礁區(qū)的海水懸浮物質(zhì)量濃度2020 年 5?9月，崖州灣礁區(qū)的海水懸浮物月平均質(zhì)量濃度為 13.7～19.4 mg·L?1，總平均質(zhì)量濃度為 16.3 mg·L?1；鳳凰島礁區(qū)的海水懸浮物月平均質(zhì)量濃度為 1.9～8.8 mg·L?1，總平均質(zhì)量濃度為 5.3 mg·L?1；西島礁區(qū)的海水懸浮物質(zhì)量濃度最低，月平均質(zhì)量濃度為 0.7～5.3 mg·L?1，總平均質(zhì)量濃度為 2.6 mg·L?1。雙因素方差分析結(jié)果顯示，崖州灣的海水懸浮物質(zhì)量濃度顯著高于鳳凰島和西島（P＜ 0.05）（圖2）。

2.2 普哥濱珊瑚和共生蟲(chóng)黃藻的生理活性指標(biāo)從表1可見(jiàn)，普哥濱珊瑚SOD、CAT、NOS、GST和PO活力的平均值分別為111.60、119.83、9.46、253.99 U·mg?1和 0.087 ΔOD490mg?1·min?1，SOD、NOS和PO活力的最高月平均值均來(lái)自6月份崖州灣，而CAT和GST活力的最高月平均值分別來(lái)自8月份西島和5月份崖州灣。共生蟲(chóng)黃藻的平均密度為 2.97×106cells·cm?2，葉綠素 a+c2的平均含量為 5.87 pg·cell?1，兩者的最高月平均值都在7月份崖州灣。此外，共生蟲(chóng)黃藻SOD、CAT、NOS和GST活力的平均值分別為205.69、141.89、20.50 和 939.58 U·mg?1，SOD 與 NOS 活力的最高月平均值均見(jiàn)于6月份鳳凰島，而CAT和GST活力的最高月平均值分別見(jiàn)于8月份鳳凰島和5月份西島。

表1 3個(gè)礁區(qū)普哥濱珊瑚和共生蟲(chóng)黃藻生理指標(biāo)結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

2.3 海水懸浮物濃度與生理活性指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析采用主成分分析方法（PCA）探索普哥濱珊瑚及其共生蟲(chóng)黃藻的各項(xiàng)生理活性指標(biāo)的主效應(yīng)。如圖3所示，PC1占20.2%，PC2占15.3%，兩者總和為35.5%，主效應(yīng)不顯著。同時(shí)，對(duì)各礁區(qū)海水懸浮物質(zhì)量濃度與普哥濱珊瑚及其共生蟲(chóng)黃藻的各項(xiàng)生理活性指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海水懸浮物質(zhì)量濃度與共生蟲(chóng)黃藻的密度和NOS活力均呈顯著性正相關(guān)（R= 0.27，P＜ 0.05；R= 0.27，P＜ 0.05），而與共生蟲(chóng)黃藻的 GST 活力呈顯著負(fù)相關(guān)（R= ?0.26，P＜ 0.05）（圖4）。

2.4 普哥濱珊瑚的 IBR 指數(shù)分析選與海水懸浮物質(zhì)量濃度相關(guān)性相對(duì)高（R≥ 0.1 或R≤ ?0.1）的生理活性指標(biāo)（普哥濱珊瑚的SOD和GST活力，以及共生蟲(chóng)黃藻的密度、SOD、NOS和GST活力），計(jì)算和分析3個(gè)礁區(qū)（崖州灣、鳳凰島和西島）普哥濱珊瑚的綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)，繪制了生物標(biāo)志物星狀圖。崖州灣普哥濱珊瑚的綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)值最高，為0.060 5，鳳凰島為 0.021 3，西島僅為 0.017 4（圖5）。

3 討 論

近年來(lái)，隨著人類對(duì)濱海的不斷開(kāi)發(fā)與利用，近海礁區(qū)水質(zhì)明顯下降，已嚴(yán)重威脅到珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的健康和安全[16?17]。有研究表明，海水懸浮物濃度的升高是近岸珊瑚礁不斷退化的原因之一[18?19]，也有研究表明，在懸浮物濃度較高的海區(qū)一些珊瑚可以長(zhǎng)時(shí)間生存[20]。為了揭示自然礁區(qū)中海水懸浮物對(duì)造礁石珊瑚的生理影響，本研究在三亞選取海水懸浮物濃度存在顯著差異的3個(gè)礁區(qū)（崖州灣、鳳凰島和西島），調(diào)查了海水懸浮物濃度的月際變化規(guī)律，檢測(cè)了在3個(gè)礁區(qū)均分布的普哥濱珊瑚的生理活性，以期闡明造礁石珊瑚對(duì)高濃度懸浮物環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制。

筆者在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，崖州灣礁區(qū)的海水懸浮物質(zhì)量濃度長(zhǎng)期高于 10 mg·L?1，超過(guò)了一類海水的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[21]。崖州灣附近分布著大量水產(chǎn)養(yǎng)殖高位池，養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的殘餌、排泄物、死亡生物和漁民生活污水等直接流入附近的珊瑚礁區(qū)；灣內(nèi)南山港碼頭是三亞市的主要貨運(yùn)碼頭，來(lái)往大型貨運(yùn)船經(jīng)常卷起底部沉積物，兩者可能共同導(dǎo)致了崖州灣礁區(qū)海水懸浮物質(zhì)量濃度的較高水平。鳳凰島毗鄰臨春河入?？?，有城市污水的不斷輸入[22]，這可能導(dǎo)致了鳳凰島礁區(qū)海水懸浮物質(zhì)量濃度略高于西島。因此，海水懸浮物污染已成為或?qū)⒊蔀槿齺喗渡汉鹘傅耐{因素之一。

趙美霞等[23]的調(diào)查結(jié)果表明，普哥濱珊瑚正逐漸成為三亞近岸珊瑚礁中的優(yōu)勢(shì)種，在海水懸浮物濃度較高的崖州灣礁區(qū)更是唯一幸存的珊瑚種。為了深入解析海水懸浮物對(duì)造礁石珊瑚的生理影響，本研究檢測(cè)了3個(gè)礁區(qū)中普哥濱珊瑚的共生蟲(chóng)黃藻密度和葉綠素a+c2含量，以及珊瑚宿主和共生蟲(chóng)黃藻中環(huán)境脅迫相關(guān)酶（SOD、CAT、GST、NOS和PO）的活力。PCA分析發(fā)現(xiàn)，普哥濱珊瑚及其共生蟲(chóng)黃藻中多項(xiàng)生理活性指標(biāo)的主效應(yīng)并不顯著。相關(guān)性分析表明，海水懸浮物質(zhì)量濃度與共生蟲(chóng)黃藻的密度和NOS活力顯著正相關(guān)，而與共生蟲(chóng)黃藻的GST活力顯著負(fù)相關(guān)。與海水懸浮物質(zhì)量濃度顯著相關(guān)的指標(biāo)均是共生蟲(chóng)黃藻的生理指標(biāo)，表明普哥濱珊瑚通過(guò)調(diào)控共生蟲(chóng)黃藻的生理活性來(lái)適應(yīng)高海水懸浮物濃度的礁區(qū)環(huán)境。三亞礁區(qū)海水懸浮物濃度（0.7～19.4 mg·L?1）的升高誘導(dǎo)了普哥濱珊瑚共生蟲(chóng)黃藻密度的增加，這與JONES等[24]的研究結(jié)果一致。這種誘導(dǎo)作用可歸因于懸浮物對(duì)普哥濱珊瑚的遮蔭效應(yīng)，海水懸浮物質(zhì)量濃度越高，共生蟲(chóng)黃藻獲得的光照越不足，隨之導(dǎo)致其光合作用產(chǎn)物減少。因此，普哥濱珊瑚能通過(guò)增加共生蟲(chóng)黃藻的密度來(lái)滿足自身的能量需求，從而適應(yīng)高海水懸浮物質(zhì)量濃度環(huán)境。此外，海水懸浮物質(zhì)量濃度的升高增加了共生蟲(chóng)黃藻的NOS活力，但抑制了其GST活力。因?yàn)楣采x(chóng)黃藻的SOD和CAT活力與海水懸浮物質(zhì)量濃度未呈顯著相關(guān)性，NOS活力的上升可能并未導(dǎo)致胞內(nèi)的過(guò)氧化水平，而是經(jīng)由NO通路調(diào)節(jié)藻體的生理活性[25]。GST活性的下降可能會(huì)抑制共生蟲(chóng)黃藻的解毒水平，這可能是普哥濱珊瑚宿主降低共生蟲(chóng)黃藻的解毒耗能，而增加其對(duì)自身的能量供應(yīng)[26]。因此，普哥濱珊瑚可能通過(guò)增加共生蟲(chóng)黃藻的密度和NOS活性，而降低其GST活力來(lái)適應(yīng)高海水懸浮物質(zhì)量濃度的崖州灣礁區(qū)環(huán)境。這種對(duì)不同海水懸浮物質(zhì)量濃度的適應(yīng)性調(diào)節(jié)與普哥濱珊瑚的綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)相一致，崖州灣的普哥濱珊瑚指數(shù)值＞ 鳳凰島 ＞ 西島。綜上所述，普哥濱珊瑚能生存于較高海水懸浮物質(zhì)量濃度環(huán)境的機(jī)制在于對(duì)共生蟲(chóng)黃藻生理的調(diào)控，包括對(duì)其密度和NOS活力的誘導(dǎo)，以及對(duì)GST活力的抑制。

筆者比較了三亞3個(gè)礁區(qū)的海水懸浮物濃度，分析了海水懸浮物濃度與普哥濱珊瑚及其共生蟲(chóng)黃藻的各項(xiàng)生理指標(biāo)間的關(guān)系，并構(gòu)建了3個(gè)礁區(qū)普哥濱珊瑚的綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)，發(fā)現(xiàn)崖州灣礁區(qū)海水懸浮物濃度最高，普哥濱珊瑚可能通過(guò)誘導(dǎo)共生蟲(chóng)黃藻的密度和NOS活力以及抑制共生蟲(chóng)黃藻的GST活力，來(lái)適應(yīng)崖州灣礁區(qū)的較高懸浮物環(huán)境。此外，本研究構(gòu)建的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)能夠評(píng)估懸浮物對(duì)普哥濱珊瑚的影響程度，以期為珊瑚礁生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論基礎(chǔ)。