劉雙龍，楊德潔，牛曉慶，楊福孫，覃偉權(quán)

（1.海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，海口 570228; 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 椰子研究所/海南省院士創(chuàng)新平臺/海南省檳榔產(chǎn)業(yè)工程研究中心，海南文昌，571339）

檳榔(Areca catechuL.)屬于棕櫚科多年生常綠喬木，性喜高溫高濕[1]，是我國四大南藥之一，在我國海南、廣東、臺灣、云南均有種植[2]。隨著檳榔種植面積的逐年增加，病蟲害頻發(fā)，檳榔根腐病為檳榔的典型根部病害，對檳榔的健康生長具有較為嚴重的影響，李增平等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，海南省檳榔主產(chǎn)區(qū)萬寧、陵水等地的部分黃化及枯死檳榔是由根腐病導(dǎo)致的。尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）是檳榔根腐病病原的1種病菌，常侵染檳榔根、莖基部，導(dǎo)致侵染部位壞死腐爛，從而導(dǎo)致檳榔的葉片變黃，整體長勢變差；此侵染在高溫、高濕條件下極易發(fā)生[4]。有文獻表明，可可毛色二孢菌可感染桑樹根部引起桑樹根腐病[5]；奇異根串珠霉菌能侵染檳榔莖干，導(dǎo)致檳榔莖瀉血病[3]。目前對尖孢鐮刀菌、可可毛色二孢菌、奇異根串珠霉菌的防治多集中為化學(xué)藥劑的篩選。戴利銘等[6]通過菌絲生長速率法測定了10種殺菌劑對病原菌的毒力，發(fā)現(xiàn)多菌靈對可可毛色二孢菌的防治效果最好。熊明國[7]采用生長速率法測定了6種藥劑對尖孢鐮刀菌的毒力，發(fā)現(xiàn)甲基硫菌靈對尖孢鐮刀菌的防治最好。余鳳玉等[8]采用生長速率法和孢子萌發(fā)抑制法，測定了10種藥劑對奇異根串珠霉菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)對菌絲和分生孢子芽管生長有較強抑制作用的是多菌靈、異菌脲和甲基硫菌靈。雖然化學(xué)防治具有見效快、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，但其也存在易使致病菌產(chǎn)生抗藥性，易使有益微生物數(shù)量驟減和減弱土壤自身的修復(fù)能力等問題[9]，實施生物防治是解決這些問題的首要選擇，對檳榔產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。關(guān)于尖孢鐮刀菌、可可毛色二孢菌、奇異根串珠霉菌等3種病原菌的生物防治，謝紅輝等[10]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）對可可毛色二孢菌的抑菌率達73.3%；牛曉慶等[11]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淺灰鏈霉菌（Streptomyces griseolus）對奇異根串珠霉菌有較強的抑制作用。王宇鵬等[12]篩選到1株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis），并發(fā)現(xiàn)其對尖孢鐮刀菌具有較強的抑制作用。目前，關(guān)于尖孢鐮刀菌、可可毛色二孢菌、奇異根串珠霉菌等3種病原菌的拮抗菌株大多處于實驗室階段，其中有效生防菌株匱乏。為了豐富檳榔根部尖孢鐮刀菌、可可毛色二孢菌、奇異根串珠霉菌等3種病原菌的生防菌資源，本研究通過對發(fā)病檳榔園的健康檳榔的根內(nèi)生細菌和根部土壤中的細菌（根部土細菌）進行分離，采用平板對峙法進行生防菌株的篩選，并測定生防菌液對尖孢鐮刀菌、可可毛色二孢菌、奇異根串珠霉菌等3種病原菌的抑制作用，同時驗證其對發(fā)病植株的防治效果，最后對生防菌的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以期為檳榔根部病害生防菌劑的開發(fā)提供菌種及防治方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試材料供試樣本采自海南發(fā)病檳榔園健康植株的根和根部土壤，每個樣品3次重復(fù)。并立即用聚乙烯無菌袋密封，用冰盒帶回實驗室進行處理。供試檳榔根部病原菌Q-7-1可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）、F-2 尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和TP-11奇異根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa）由筆者所在的實驗室分離保存。實驗用檳榔苗“熱研1號”來自熱科院椰子研究所基地。

1.1.2 供試培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（LB）、牛肉膏酵母葡萄糖培養(yǎng)基（NYBD）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、豆芽汁培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基按常規(guī)方法配置[13?14]。

1.2 拮抗菌的分離、篩選及鑒定

1.2.1 樣品細菌的分離純化采用平板稀釋梯度培養(yǎng)法[15]和組織勻漿法[16]分別對根部土細菌及根內(nèi)生細菌進行分離、純化。

1.2.2 拮抗細菌的篩選采用平板對峙法進行拮抗細菌篩選。拮抗細菌使用NA培養(yǎng)基培養(yǎng)，對峙實驗及病原菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基。以不放置細菌菌塊的 PDA 平板為對照，于 28 ℃ 培養(yǎng) 2 d后測量細菌及病原菌2個接種點連線上病原菌的菌落半徑（mm），計算抑菌率[17?18]。初篩以可可毛色二孢菌為靶標，對初篩具有較好拮抗作用的菌株，以尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌為靶標進行驗證，以期得到對尖孢鐮刀菌、可可毛色二孢菌、奇異根串珠霉菌等3種根腐病菌綜合拮抗作用最好的生防菌株。

1.2.3 拮抗菌種子液的制備及其對3種病原菌的抑制作用挑取拮抗菌株單菌落于裝有100 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫搖床中，28 ℃、180 r·min?1振蕩培養(yǎng) 24 h 作為種子液備用，并測量菌液在波長為 600 nm 時的OD值。采用濾紙片抑菌測定法進行菌液抑菌作用測定。具體操作：在超凈工作臺中將無菌濾紙片在拮抗菌液中浸泡 30 s。用無菌鑷子夾取濾紙片，淋掉多余液體，使濾紙片與培養(yǎng)基密切接觸。每個培養(yǎng)基上均勻放置3張濾紙片，以只接LB的濾紙片培養(yǎng)基為對照，進行對峙實驗（方法同1.2.2）。

1.3 拮抗細菌的鑒定對檳榔根腐病具有拮抗作用的菌株，接種于NA平板培養(yǎng)基上，32 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、邊緣、透明度等形態(tài)特征，并采用青島海博生物有限公司生產(chǎn)的生化試驗配套試劑進行菌株的生理生化特性檢測，檢測方法參照說明書進行，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[19]從形態(tài)特征對菌株進行生物學(xué)鑒定；再結(jié)合 16S rDNA基因進行分子學(xué)鑒定，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌的DNA，以拮抗菌株的基因組DNA為模板，采用細菌通用引物27F： 5 ′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′/1492R：5 ′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'進 行 PCR 擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序；對測序結(jié)果進行BLAST同源性比對，并從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)菌株的 16S rDNA 序列，在MEGA7.0 上用Neighbor?joining分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹[20]。

1.4 拮抗菌最佳培養(yǎng)基組分的配比對碳源、氮源及無機鹽的篩選參照何明川[13]楊亞男[14]的方法以豆芽汁為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入 2%的麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉進行最佳碳源的篩選；分別加入1%的氯化銨、酵母浸粉、牛肉膏、甘氨酸和蛋白胨進行最佳氮源的篩選；分別加入0.3%的七水合硫酸鎂（MgSO4· 7H2O）、碳酸鈣（CaCO3）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）和磷酸氫二鉀（K2HPO4）進行最佳無機鹽的篩選。每組 3次重復(fù)，測量菌液在波長為 600 nm 時的OD值。根據(jù)上述碳源、氮源及無機鹽的單因素試驗結(jié)果，設(shè)置3因素3水平正交試驗，對其最佳用量進行優(yōu)化，以確定最佳培養(yǎng)基組分配方。

1.5 室內(nèi)防效測定

1.5.1 拮抗菌株懸浮液的制備挑取拮抗菌株單菌落于裝有 100 mL NYBD 液體培養(yǎng)基的 250 mL錐形瓶中，置于恒溫搖床中，28 ℃、180 r·min?1振蕩培養(yǎng) 24 h后得到拮抗菌菌懸液，調(diào)節(jié)濃度至約為 109CFU·mL?1。

1.5.2 盆栽實驗選取長勢基本一致的“熱研1號”檳榔苗，移栽至裝有1∶1的滅菌土和蛭石的花盆中，緩苗15 d左右，采用傷根灌注法[21]，向?qū)嶒灲M和對照組每盆分別接種孢子濃度為107CFU·mL?1的可可毛色二孢菌孢子液200 mL，接種病原菌10 d后，選擇對峙實驗結(jié)果中拮抗效果最好的菌株進行灌根處理，每株苗接種拮抗菌液200 mL，菌液濃度為 109CFU·mL?1，同時對照組每株淋入無菌NYBD培養(yǎng)基200 mL。每組5個重復(fù)。定期觀察檳榔幼苗感病與生長情況，計算幼苗發(fā)病率[22]。

1.6 數(shù)據(jù)分析采用 IBM SPSS Statistics Version 22.0進行單因素方差分析，并且使用Duncan法進行顯著性檢驗（P＜0.05），使用 GraphPad prim 完成實驗數(shù)據(jù)作圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 樣本拮抗菌的分離、篩選結(jié)果從各樣本中共分離到 247 株細菌。通過平板對峙實驗篩選到6株細菌對可可毛色二孢菌具有拮抗作用，且 6株拮抗菌的抑菌率均達到 60%以上（表1）。從中選取3株拮抗效果好的菌株brj-21、qrj-2-6和wrb-2-4。從這3株拮抗菌中篩選出對檳榔其他2種根腐病原菌也具有較強抑制作用的菌株，得到菌株brj-21對可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌拮抗效果均較好，抑菌率分別為73.66%、68.00%和74.33%，抑菌帶寬分別為6.50 、4.83 、5.83 mm；并發(fā)現(xiàn) brj-21 菌液（OD600值為2.84）也對檳榔3種病原均有較強的抑菌能力。這表明brj-21菌株對3種檳榔根部病原菌的防治有較好的生防潛力（表2、3，圖1）。

表1 對可可毛色二孢菌具有抑菌作用的菌株

表2 3株生防菌對尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌的抑菌作用

表3 brj-21 菌液對病原真菌的抑菌作用

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 生物學(xué)鑒定將菌株 brj-21 接種至 NA 培養(yǎng)基上，32 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后生長良好，菌落初期成乳白色，邊緣較為規(guī)則，表面平滑、干燥，菌株為革蘭氏陰性菌（圖2）。不能水解明膠、淀粉，不能利用甘露醇、硫化氫，硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性等，對照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步將此菌株歸為產(chǎn)堿菌屬Alcaligenes sp.（表4）。

表4 生防菌株 brj-21 的生理生化特性

2.2.2 分子學(xué)鑒定由 16S rDNA 測序表明，擴增后的菌株brj-21序列長度為1 440 bp，經(jīng)過與NCBI的 GenBank 數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)與糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis，登錄號是 MH 106702.1）的相似度達到 99%，此外下載8個產(chǎn)堿屬不同種的菌株序列，并選擇腸桿菌（Escherichia coli，登錄號是NZ FAVL01000094）作為外群菌株，通過 MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。發(fā)現(xiàn)菌株brj-21與糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis，登錄號是MH 106702.1）處于同一分支上，并綜合菌株形態(tài)和生理生化特征，鑒定 brj-21 菌株為Alcaligenes faecalis（圖3、4）。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 不同碳源對菌株brj-21生長的影響菌株brj-21在5種碳源中皆可以生長，但當以葡萄糖為菌株brj-21碳源時，拮抗菌生長最佳，菌液OD值高達2.95。故菌株brj-21的最佳碳源是葡萄糖（圖5）。

2.3.2 不同氮源對菌株brj-21生長的影響菌株brj-21在5種氮源中皆可以生長，當以酵母浸粉為菌株brj-21氮源時，拮抗菌的生長最佳，菌液OD值高達2.79。故選擇酵母浸粉為菌株最佳氮源（圖6）。

2.3.3 不同無機鹽對菌株brj-21生長的影響菌株brj-21在4種無機鹽中均可以生長，當以七水合硫酸鎂為菌株brj-21無機鹽時，拮抗菌的生長最佳，菌液OD值高達2.92。故選擇七水合硫酸鎂作為菌株最佳無機鹽（圖7）。

2.3.4 菌株brj-21培養(yǎng)基組分正交試驗結(jié)果以葡萄糖、酵母浸粉和七水合硫酸鎂為因素的正交試驗結(jié)果見表5。由表5中R的大小排列得出，影響菌株brj-21生長的最主要因素是葡萄糖，其次是酵母浸粉，影響最小的是七水合硫酸鎂。根據(jù)表5中K值的大小，得出最佳培養(yǎng)基水平組合為2.5%的葡萄糖、1%的酵母浸粉、0.4%的七水合硫酸鎂，即優(yōu)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖2.5 g、酵母浸粉 1 g、七水合硫酸鎂 0.4 g，水 100 mL。

表5 brj-21 正交試驗分析

2.4 盆栽實驗通過對盆栽檳榔苗生長發(fā)病的情況進行觀察記錄，根據(jù)40 d后的發(fā)病情況發(fā)現(xiàn)，對照組有3株植株葉片葉尖首先發(fā)黃隨后干枯，主根維管束發(fā)黑腐爛，長勢普遍較弱，最后整株枯死，發(fā)病率為60%。實驗組幼苗整體長勢較好，對照組和實驗組植株差異較大。說明菌株brj-21對可可毛色二孢菌引起的根腐病具有較好防病效果（圖8）。

3 討 論

本實驗篩選到的生防菌株brj-21為檳榔根內(nèi)生菌。內(nèi)生菌（Endophyte）是指其生活史的一定階段或全部階段定殖于植物器官、組織內(nèi)部以及細胞間隙的微生物[23]。內(nèi)生菌與植物的生長息息相關(guān)，其作為潛在生防資源和外援基因載體在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用具有廣闊的前景，已成為農(nóng)業(yè)專家研究的焦點[24]。檳榔根腐病是檳榔極易發(fā)生的病害，主要以葉尖變黃、根莖腐爛變色為主，是由多種病原等引起的真菌性病害[3]。生物防治具有不污染環(huán)境，不易使病害產(chǎn)生抗藥性及對非靶標生物安全等優(yōu)點，以被廣泛應(yīng)用[25]。常見的生防菌株有放線菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等。關(guān)于糞產(chǎn)堿菌為生防菌株的報道較少，但已有報道糞產(chǎn)堿菌可產(chǎn)生羥胺類物質(zhì)而抑制成團泛菌和多種植物病原真菌的生長及降解多種有毒有害物質(zhì)如苯酚、氰化物、亞砷酸鹽、硫化氫等[26]。高之蕾等[27]的研究結(jié)果表明，糞產(chǎn)堿菌51-A和51-B對桃樹根癌病具有較強的抑制作用。Yuen等[28]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 該菌在與尖孢鐮刀菌 (F.oxysporum) 作用過程中可以產(chǎn)生一種鐵螯合劑，能夠抑制尖孢鐮刀菌的生長。本研究從健康檳榔根中分離、篩選到的內(nèi)生糞產(chǎn)堿菌brj-21對可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌均具有較強的抑菌作用，說明brj-21可作為生防菌株。

在外界營養(yǎng)和發(fā)酵均適宜的條件下，brj-21產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)一般更豐富。有研究[29]表明由糞產(chǎn)堿菌的毒理學(xué)試驗結(jié)果得出該菌株是安全的，可以作為微生物肥料生產(chǎn)用的菌種，那么，對菌株進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化顯得愈發(fā)重要。本實驗采用單因素與正交實驗得出菌株brj-21優(yōu)化培養(yǎng)基配方為酵母浸粉 2.5 g、葡萄糖 1 g、七水合硫酸鎂 0.4 g、水100 mL。蔣樟麗等[30]對糞產(chǎn)堿菌AF01的優(yōu)化中，菌株AF01生長的最佳碳源是蔗糖。2株菌碳源的差異可能是由于菌株用途、來源、生境等不同造成的，后續(xù)應(yīng)再次驗證。本研究只對拮抗菌株的室內(nèi)實驗做了初步探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株brj-21對由可可毛色二孢菌導(dǎo)致的根腐病有較好的防病效果。驗證菌株brj-21對尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌導(dǎo)致的檳榔根腐病的防病效果及大田實驗有待后續(xù)重點研究。

本研究篩選到的菌株brj-21對檳榔根腐病的尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）和奇異根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa）3種病原均具有較強的抑制作用。brj-21經(jīng)鑒定為糞產(chǎn)堿菌，并對其最適培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，以期為利用菌株brj-21對檳榔根部病害的生物防治提供菌種及理論指導(dǎo)。