王偉偉，安馨媛，陳俊菁

（海南大學(xué) 林學(xué)院/海南省熱帶特色花木資源生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228）

火龍果又名紅龍果，屬仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus），是極具發(fā)展前景的熱帶和亞熱帶水果[1]?；瘕埞蚓哂休^高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，集蔬菜、水果、花卉和保健于一體，被譽(yù)為“21世紀(jì)保健食品和果品珍品”， 受到人們的青睞，具有廣闊的國(guó)際、國(guó)內(nèi)市場(chǎng)[2]?；瘕埞?0世紀(jì)80年代才引入我國(guó)臺(tái)灣，雖然在我國(guó)栽培歷史較短，但發(fā)展迅速，目前主要在臺(tái)灣、海南、廣西、廣東、福建、貴州等省區(qū)種植。潰瘍病是近年來(lái)火龍果種植園發(fā)生的嚴(yán)重真菌病害之一，發(fā)病率高達(dá) 60%[3?7]。潰瘍病造成火龍果枝條腐爛，果實(shí)變黑，失去食用價(jià)值，有些果園甚至顆粒無(wú)收。該病害在夏秋季高溫高濕的氣候條件下發(fā)病尤為嚴(yán)重，尤其臺(tái)風(fēng)過(guò)后更容易大面積暴發(fā)，這也是該病在海南地區(qū)盛行的主要原因之一。該病害由新暗色柱節(jié)孢（Neoscytalidium dimidiatum(Penz.) Crous &Slippers）侵染引起的[4?11]，開(kāi)展病原菌的致病機(jī)理研究可以為病害防治所需新藥以及抗性種苗的研發(fā)提供相關(guān)的理論依據(jù)，從而達(dá)到對(duì)病害長(zhǎng)期、有效的防控。病原菌基因功能缺失突變體的構(gòu)建是研究病原菌致病機(jī)理的有效手段，這一方法的關(guān)鍵技術(shù)是建立遺傳轉(zhuǎn)化體系。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（Agrobaeterium tumefaciens-Meidated Transformation）可快速構(gòu)建真菌 T-DNA（transfer DNA）隨機(jī)插入突變體，因其操作簡(jiǎn)單，可轉(zhuǎn)化完整的細(xì)胞，比如分生孢子、菌絲、子實(shí)體等，免去了制備原生質(zhì)體的繁瑣，廣泛應(yīng)用于多種真菌[12]。目前已有100多種真菌使用該方法進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化[13]，比如玉米大斑病菌[14]、稻瘟病菌[15]、尖鐮孢菌[16]、玉米灰斑病菌[17]等。本研究擬建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的火龍果潰瘍病菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為火龍果潰瘍病菌致病機(jī)理的研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料火龍果潰瘍病菌野生型菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。農(nóng)桿菌菌株EHA105由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院陳銀華教授饋贈(zèng)。載體pXEH8279 (KanaR, HygBR)由吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院潘洪玉教授饋贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基IM、IAM[12]。

1.2 火龍果潰瘍病菌對(duì)潮霉素（HygB）最低耐受濃度的確定將火龍果潰瘍病菌野生型菌株接種在PDA培養(yǎng)基上活化，待長(zhǎng)至菌落直徑約5 cm時(shí)，用5 mm打孔器在菌落邊緣打孔取菌餅，并將菌餅轉(zhuǎn)接在加有不同濃度 HygB（0、25、50、100、150 μg·mL?1）的 PDA 培養(yǎng)基上，置于 25 ℃ 培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每處理3重復(fù)，培養(yǎng)7 d后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，確定最佳的HygB篩選濃度。

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化

1.3.1 農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備將攜帶有質(zhì)粒 pXEH8279的農(nóng)桿菌菌株EHA105在盧里亞?貝爾塔尼平板培養(yǎng)基 (LB)[ 利福平 (rif) 10 μg·mL?1,卡那霉素(Kana) 50 μg·mL?1]上劃線，置于 28 ℃ 培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落轉(zhuǎn)移至新的LB平板培養(yǎng)基（rif 10 μg·mL?1, Kana 50 μg·mL?1）上劃線，28 ℃培養(yǎng)48 h后，用滅菌的藥匙刮取農(nóng)桿菌，使其分散在 IM 培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃，200 r·min?1，培養(yǎng) 4～6 h，使其OD600達(dá)到0.5，置于50 mL無(wú)菌管中備用。

1.3.2 火龍果潰瘍病菌分生孢子的準(zhǔn)備將活化的火龍果潰瘍病菌野生型菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d后，吸取0.01%吐溫20于培養(yǎng)基上，用無(wú)菌棉棒將分生孢子輕輕洗下，然后用4層滅菌紗布過(guò)濾，制成分生孢子懸浮液。取適量分生孢子懸浮液于PD培養(yǎng)基中，調(diào)整分生孢子濃度至 5×105個(gè)·mL?1，避光放置在搖床上，轉(zhuǎn)速為150 r·min?1，室溫下萌發(fā) 24 h。

1.3.3 共培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的農(nóng)桿菌與萌發(fā)的分生孢子懸浮液等體積混合后，于 25 ℃，80 r·min?1，搖培 20～30 min。吸取 100 μL 混合液，涂布在共培養(yǎng)培養(yǎng)基（IAM, Induced Agar Medium）上，置于 25 ℃黑暗培養(yǎng)。共培養(yǎng) 48 h后，在IAM上倒篩選培養(yǎng)基，置于25 ℃培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)基即加有潮霉素（HygB，50 μg·mL?1）、頭孢霉素（Cef, 200 μg·mL?1）、氨芐青霉素（Amp, 200 μg·mL?1）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。培養(yǎng)5～6 d后即可見(jiàn)有單菌落長(zhǎng)出。

1.4 不同因素對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響根據(jù)以上遺傳轉(zhuǎn)化方法，依次驗(yàn)證以下因子對(duì)火龍果潰瘍病菌遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，包括農(nóng)桿菌濃度OD600（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8）、分生孢子萌發(fā)時(shí)間（0、6、12、24、36、48 h）以及共培養(yǎng)溫度（20、25、28、30、35 ℃），采用單因素試驗(yàn)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5 轉(zhuǎn)化子的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒定隨機(jī)挑選8株轉(zhuǎn)化子以及野生型菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 d后，用無(wú)菌槍頭分別刮取培養(yǎng)基中的菌絲，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。分別向裝有菌絲的離心管加入液氮，并用無(wú)菌塑料研磨棒迅速將菌絲研磨成粉狀，利用 CTAB（Hexadecyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨）法提取轉(zhuǎn)化子及野生型菌株基因組DNA。以HygB抗性基因片段為模板設(shè)計(jì)引物 hygF (5′-gaagaatctcgtgctttcag-3′)和 hygR(5′-gtacttctacacagccatcg-3′)，通過(guò) PCR 方法驗(yàn)證 TDNA片段是否插入，目標(biāo)片段長(zhǎng)度880 bp。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 40 s，56 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min。

1.6 轉(zhuǎn)化子篩選

1.6.1 轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)觀察及產(chǎn)孢能力比較將隨機(jī)選取的200株轉(zhuǎn)化子以及野生型菌株接種在PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃ 培養(yǎng) 4 d 后，用 5 mm 打孔器分別在菌落邊緣取菌餅，并將菌餅轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7 d，觀察菌落形態(tài)特征并拍照后，收集分生孢子，計(jì)算每皿產(chǎn)生的分生孢子數(shù)量。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6.2 轉(zhuǎn)化子致病力采用田間接種方法，篩選致病力降低的轉(zhuǎn)化子。具體操作如下：將轉(zhuǎn)化子及野生型菌株分別接種在PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 d 后，用 5 mm 打孔器分別取菌落邊緣菌餅；在海南大學(xué)儋州校區(qū)農(nóng)科基地火龍果種植園選取健康的火龍果植株，用無(wú)菌刀片在莖上劃出5 mm左右傷口，將菌餅轉(zhuǎn)移至傷口處，并用保鮮膜包裹以保持濕度[（28±2)℃，RH80%]。3 d后觀察發(fā)病情況并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果潰瘍病菌對(duì)HygB的最低耐受濃度當(dāng) HygB 濃度為 50 μg·mL?1時(shí)該菌完全不能生長(zhǎng)（圖1），故選取該濃度為火龍果潰瘍病菌對(duì)HygB的最低耐受濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)化子的篩選。

2.2 火龍果潰瘍病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立當(dāng)農(nóng)桿菌濃度OD600為0.5時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，與其他處理差異顯著（圖2-A）；當(dāng)分生孢子萌發(fā)時(shí)間為24 h時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，與萌發(fā)時(shí)間為36 h時(shí)差異不顯著，而與其他處理差異顯著（圖2-B），但分生孢子萌發(fā)36 h實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，且菌絲萌發(fā)造成實(shí)驗(yàn)操作難度加大，故選取分生孢子萌發(fā)24 h作為最優(yōu)；當(dāng)共培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，且與其他處理差異顯著（圖2-C）。通過(guò)以上研究，農(nóng)桿菌濃度OD600=0.5、分生孢子萌發(fā)時(shí)間24 h、共培養(yǎng)溫度25℃時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到833個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)分生孢子。

2.3 轉(zhuǎn)化子的 PCR鑒定提取轉(zhuǎn)化子基因組 DNA，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增T-DNA片段上HygB抗性基因，結(jié)果顯示，8株轉(zhuǎn)化子均能擴(kuò)增出HygB抗性基因片段（880 bp），初步可以確定T-DNA成功插入以上轉(zhuǎn)化子基因組中（圖3）。

2.4 轉(zhuǎn)化子篩選結(jié)果野生型菌株氣生菌絲旺盛，直立，后期顏色為灰黑色；通過(guò)與野生型菌落形態(tài)比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子0-3-1和3-3-1菌落形態(tài)差異較大，氣生菌絲濃密，呈白色，且轉(zhuǎn)化子3-3-1不產(chǎn)生分生孢子；轉(zhuǎn)化子24-3-2氣生菌絲稀疏，顏色變淡（圖4-A）。轉(zhuǎn)化子與野生型菌株產(chǎn)孢能力比較，發(fā)現(xiàn)4株產(chǎn)孢量減少的菌株分別為3-1-2、3-1-3、3-2-3和 3-7-1，其中，3-1-3、3-2-3與野生型差異顯著（P＜0.05）， 3-1-2、3-7-1 與野生型差異極顯著（P＜0.01）；發(fā)現(xiàn)5株產(chǎn)孢量增加的菌株分別為3-6-2、3-4-1、3-4-2、3-3-1和 0-3-1，其中，0-3-1與野生型差異顯著（P＜0.05），其余4株與野生型差異極顯著（P＜0.01）（圖4-B）。通過(guò)接種實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) 6 株致病力下降的菌株分別為0-3、3-3-1、3-6-1、3-7-1、24-2-1、24-3-2（圖4-C）。以上轉(zhuǎn)化子可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 討 論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，影響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素有很多，比如根癌農(nóng)桿菌菌株的選擇、農(nóng)桿菌濃度、真菌分生孢子濃度、共培養(yǎng)時(shí)間及共培養(yǎng)溫度等[12]。有研究表明，不同根癌農(nóng)桿菌菌株對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響很大，已報(bào)道的用于絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株有AGL-1、EHA105、LBA1100、LBA4404 等，本研究選用EHA105菌株，實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以成功轉(zhuǎn)化。乙酰丁香酮（As）是該體系能否轉(zhuǎn)化成功的決定性因素，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多數(shù)絲狀真菌在As濃度為200 μmol·L?1時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化效率最高[18]，本研究中 As選用該濃度。轉(zhuǎn)化受體的細(xì)胞濃度對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率亦有影響，受體孢子濃度較高，轉(zhuǎn)化效率也較高，本研究中發(fā)現(xiàn)分生孢子濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致真菌過(guò)量生長(zhǎng)而無(wú)法挑出轉(zhuǎn)化子，設(shè)置分生孢子濃度為5×105可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，共培養(yǎng)時(shí)間以48 h轉(zhuǎn)化效率最高[19]，共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而會(huì)導(dǎo)致遺傳轉(zhuǎn)化效率降低，本研究選取共培養(yǎng)48 h。

本實(shí)驗(yàn)主要研究了農(nóng)桿菌濃度、分生孢子萌發(fā)時(shí)間及共培養(yǎng)溫度對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。理論上，農(nóng)桿菌濃度越高，受體細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)化的概率越高，遺傳轉(zhuǎn)化效率越高，然而事實(shí)上，當(dāng)農(nóng)桿菌濃度過(guò)高時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化效率反而降低，本研究中，當(dāng)農(nóng)桿菌OD600為0.5時(shí)火龍果潰瘍病菌的遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，高于0.5則遺傳轉(zhuǎn)化效率降低。有研究表明，未萌發(fā)的分生孢子作為受體不能夠成功轉(zhuǎn)化[14,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)分生孢子萌發(fā) 24 h時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，證實(shí)分生孢子受體的形態(tài)對(duì)火龍果潰瘍病菌的遺傳轉(zhuǎn)化效率影響很大。研究者對(duì)20 ~37 ℃內(nèi)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)22～25 ℃是最適的共培養(yǎng)溫度[21]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，25 ℃是火龍果潰瘍病菌遺傳轉(zhuǎn)化的最適共培養(yǎng)溫度。

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化構(gòu)建病原真菌的T-DNA 隨機(jī)插入突變體庫(kù)，從中篩選致病力降低的突變體，并獲得T-DNA側(cè)翼序列，從而獲得致病相關(guān)基因，這是目前研究病原真菌致病機(jī)制的主要方法之一。本研究通過(guò)建立的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得T-DNA插入轉(zhuǎn)化子，并從中篩選致病力降低的轉(zhuǎn)化子，這些轉(zhuǎn)化子可用于后續(xù)研究中，以獲得致病相關(guān)的基因，通過(guò)致病相關(guān)基因功能研究，以闡明火龍果潰瘍病菌的致病機(jī)理。