馬 蘭，胡迎春，張 川，胡 林，梁思雪，彭 淼，何 亞，陳睦虎

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部（瀘州 646000）；2.雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)科（雅安 625100）；3.蘆山縣人民醫(yī)院兒科（雅安 625600）

膿毒癥是世界范圍內(nèi)的主要健康問題[1]，是宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)，繼而導(dǎo)致器官功能障礙。病原體觸發(fā)了最初的炎癥-免疫反應(yīng)，導(dǎo)致多種內(nèi)皮、激素、代謝、免疫和其他途徑的激活或抑制，繼而產(chǎn)生循環(huán)和代謝紊亂，從而導(dǎo)致器官功能障礙[2]。膿毒癥病情兇險(xiǎn)，病死率高，大約有9%的膿毒癥患者會(huì)發(fā)生膿毒性休克和多器官功能不全，重癥監(jiān)護(hù)室中一半以上的死亡是由膿毒性休克和多器官功能不全引起的，膿毒癥成為重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)非心臟病人死亡的主要原因[3]。每年有超過75萬人患上敗血癥，其中21.5萬人死于該疾病[4]。目前，對(duì)于膿毒癥的治療，主要給予抗感染、液體復(fù)蘇、多器官的功能維持等綜合治療[5-6]。然而，即使有體外膜肺氧合（ECMO）這樣的高級(jí)支持技術(shù)，膿毒癥的預(yù)后仍然欠佳[7]。盡管近幾年來膿毒癥的研究已經(jīng)廣泛，但是與膿毒癥相關(guān)的發(fā)病率和死亡率仍在增加。早期診斷和早期治療對(duì)膿毒癥患者很重要[8]。因此篩選潛在的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。

RNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步引發(fā)了廣泛的大規(guī)?；虮磉_(dá)研究和海量信使RNA（mRNA）數(shù)據(jù)[9]。準(zhǔn)確、高效的讀取比對(duì)是RNA 序列分析的基本挑戰(zhàn)之一[10]。通過RNA 測(cè)序（RNA-Seq）進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并適當(dāng)結(jié)合生物信息學(xué)方法，可提供一種強(qiáng)大的工具對(duì)基因進(jìn)行鑒定，以促進(jìn)基因組疾病的診斷[11]。本研究通過數(shù)據(jù)集GSE28750 找到了在膿毒癥患者與正常人之間的差異基因，對(duì)差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析并結(jié)合臨床資料，找到了關(guān)鍵基因，并采用生存曲線預(yù)測(cè)關(guān)鍵基因?qū)膊〉挠绊憽１狙芯坑兄趶幕蛩缴钊肓私饽摱景Y，這些找到的關(guān)鍵基因，將可能成為新的藥物靶點(diǎn)或生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE28750 是從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載的，它包含10 個(gè)膿毒癥患者外周血樣本和20 個(gè)正常人外周血樣本。將此數(shù)據(jù)集提交到OmicShare 在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)中，采用小提琴圖來判斷數(shù)據(jù)的均一化水平。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理與差異基因篩選

使用在線軟件GEO2R對(duì)數(shù)據(jù)集GSE28750進(jìn)行差異基因分析，得到膿毒癥樣本和正常樣本之間差異基因，設(shè)置P<0.01，F(xiàn)old Change>2為截取值篩選差異基因，并運(yùn)用Omic Share Tools的火山圖可視化處理差異基因。

1.3 GO和Pathway分析

基因本體論（gene ontology，GO）涉及的基因和基因產(chǎn)物詞匯分為三大類，涵蓋生物學(xué)的生物過程、細(xì)胞組分、分子功能，通過GO 富集分析以了解差異基因主要富集在哪些生物學(xué)功能、途徑和細(xì)胞定位。通過Pathway分析以了解實(shí)驗(yàn)條件下顯著改變的代謝通路。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系統(tǒng)分析基因（及其編碼產(chǎn)物）間關(guān)系、基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，把基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。本研究中，我們把差異基因提交到DAVID（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）中進(jìn)行GO以及信號(hào)通路富集，并設(shè)置P<0.05 且FDR<0.05 為臨界值，篩選出基因富集最顯著10個(gè)功能和通路，其結(jié)果可視化采用OmicShare工具中制作氣泡圖。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫用于搜索已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用，該數(shù)據(jù)庫可應(yīng)用于2031個(gè)物種，包含960萬種蛋白和1380萬種蛋白質(zhì)之間的相互作用。我們將差異基因提交到STRING 中，篩選了所有經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的結(jié)果，并去除在網(wǎng)絡(luò)中沒有聯(lián)系的點(diǎn)，設(shè)置最低要求的互動(dòng)可信度為0.4，得到蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein inter?action network，PPI network）。通過蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)得到關(guān)鍵基因。PPI中核心基因繪制熱圖，很好地展示了所有基因在不同樣本的變化規(guī)律。在熱圖中，基因的表達(dá)量做了歸一化的處理，并且表達(dá)模式相似的基因會(huì)被歸為一類。

1.5 生存曲線

數(shù)據(jù)集GSE65682有800 余例血液樣本數(shù)據(jù)，其中包括400 余例膿毒血癥患者外周血的樣本，每個(gè)樣本都有具體的生存時(shí)間與預(yù)后狀態(tài)。為了進(jìn)一步研究上述關(guān)鍵的基因?qū)δ摱狙Y休克患者預(yù)后的影響，我們應(yīng)用GraphPad Prism 7.0 制作生存曲線，進(jìn)而推測(cè)該基因?qū)膊〉挠绊憽?/p>

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選

獲得預(yù)處理的GSE28750數(shù)據(jù)集后，此數(shù)據(jù)集中各個(gè)樣本的中位數(shù)基本位于一條直線上，即樣本之間有可比性（圖1）。根據(jù)P<0.01 和|logFC|>2，獲得295 個(gè)差異基因，包括188個(gè)上調(diào)基因和107個(gè)下調(diào)基因（圖2）。

圖1 樣本基因表達(dá)豐度小提琴圖Figure 1 Violin map of gene expression abundance in samples

圖2 差異表達(dá)基因的火山圖Figure 2 Volcanic map of DEGs

2.2 GO及Pathway分析

篩選出的差異基因富集最顯著20個(gè)功能是：免疫反應(yīng)、小分子代謝過程、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、先天免疫反應(yīng)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、凝血（圖3）等。最顯著的20 個(gè)信號(hào)通路包括：造血細(xì)胞譜系、HTLV-I 感染、代謝途徑、核糖體、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、抗原加工和呈遞、金黃色葡萄球菌感染（圖4）等。

圖3 GO分析氣泡圖Figure 3 GO analysis

圖4 信號(hào)通路富集氣泡圖Figure 4 Signal pathway enrichment

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖是根據(jù)既往研究蛋白與蛋白之間的作用，從而推斷哪些基因可能更重要。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)間的連線表示預(yù)測(cè)的功能關(guān)聯(lián)。理論上說，連線越多越靠近中央?yún)^(qū)域，這些基因就越可能更重要，即所謂的核心基因。同時(shí)我們結(jié)合不同的GO 分析（不同顏色代表不同功能），還能初步了解這些核心基因的功能。該網(wǎng)絡(luò)中CD247、LCK連線多且顏色多，說明相比之下，它們是具有更多的相互作用且更多功能的蛋白質(zhì)，被我們篩選為核心基因（圖5）。我們通過熱圖進(jìn)一步查看這些核心區(qū)域的基因表達(dá)情況（圖6）。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 PPI Network Diagram

圖6 核心基因熱圖Figure 6 Heat map of core genes

2.4 生存曲線

本研究以P<0.05 為截取值，對(duì)關(guān)鍵基因CD247、LCK進(jìn)行生存曲線分析，得出它們均與患者預(yù)后呈現(xiàn)正相關(guān)，即其中兩者表達(dá)值越高，生存的時(shí)間越長(zhǎng)（圖7A-B），我們推測(cè)這些核心基因可能促進(jìn)了膿毒癥患者的免疫功能。

圖7 A-B CD247（A）與LCK（B）的生存曲線Figure 7 A-B Survival Curve of CD247（A）and LCK（B）

3 討論

膿毒癥是感染引起的炎癥反應(yīng)失調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[12]，其導(dǎo)致死亡并消耗大量醫(yī)療資源。盡管技術(shù)上取得了進(jìn)步，病理生理學(xué)的知識(shí)不斷提高，但對(duì)疾病的機(jī)制仍知之甚少[13]。臨床上，盡管進(jìn)行了強(qiáng)有力的抗感染治療，但仍有一些膿毒癥患者死亡，尤其是在合并膿毒癥休克時(shí)。膿毒癥是病原體與宿主免疫系統(tǒng)之間的一場(chǎng)死亡競(jìng)賽，促炎癥系統(tǒng)與抗炎癥系統(tǒng)之間的平衡決定了患者的命運(yùn)，膿毒癥死亡患者T細(xì)胞、B 細(xì)胞、DC細(xì)胞以及KCs細(xì)胞出現(xiàn)功能衰竭[14]。有大量證據(jù)表明膿毒癥導(dǎo)致中性粒細(xì)胞功能改變，而中性粒細(xì)胞通過其產(chǎn)生H2O2是先天免疫的第一道防線[15]。但目前沒有理想的抗菌療法和藥物治療，治療膿毒癥已經(jīng)達(dá)到了一個(gè)瓶頸。在臨床實(shí)踐中，決定患者預(yù)后的關(guān)鍵因素及其潛在機(jī)制值得我們進(jìn)行深入研究。我們從基因水平出發(fā)，利用生物信息學(xué)方法，通過基因芯片分析，找到了關(guān)于膿毒癥的兩個(gè)關(guān)鍵基因，這兩個(gè)關(guān)鍵基因有望成為膿毒癥新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。我們從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫GEO中下載表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE28750，并通過生物信息學(xué)技術(shù)篩選出多個(gè)核心基因[16]，同時(shí)結(jié)合臨床預(yù)后數(shù)據(jù)，最終確定CD247、LCK與膿毒癥患者的預(yù)后呈現(xiàn)正相關(guān)。因此，我們推測(cè)這兩個(gè)基因?yàn)槟摱景Y潛在的核心基因，為后期的研究靶點(diǎn)。

CD247是T細(xì)胞抗原受體（TCR）復(fù)合物的重要接頭和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它與NK 細(xì)胞激活受體如NKp46、NKp30 和CD16A（FcγRIII）偶聯(lián)。其表達(dá)的非編碼序列的多態(tài)性和變異是一個(gè)嚴(yán)格調(diào)控的過程，與多種健康狀況下的免疫反應(yīng)改變有關(guān)[17]。目前，已經(jīng)有研究證明，CD247表達(dá)量與器官衰竭負(fù)相關(guān)[18]，胸腺瘤患者獲得的胸腺細(xì)胞群中觀察到CD247的存在減少[19]。有研究表明系統(tǒng)紅斑狼瘡與CD247的缺失有關(guān)[20]，而它是T細(xì)胞受體（TCR）CD3 復(fù)合體的一個(gè)組成部分，進(jìn)而影響免疫應(yīng)答[21]。

LCK 是一種Src 相關(guān)蛋白酪氨酸激酶，與CD4 和CD8 分子結(jié)合，對(duì)T 細(xì)胞發(fā)育和T 細(xì)胞活化至關(guān)重要，已經(jīng)成為治療癌癥和神經(jīng)元疾病的新型藥物靶向分子[22-23]。LCK 作為一種56KDa 的蛋白質(zhì)，可磷酸化各種蛋白質(zhì)（例如ZAP-70，ITK 和蛋白激酶C）的酪氨酸殘基，其表達(dá)和活性的改變可能導(dǎo)致各種疾病，例如癌癥，哮喘，糖尿病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，炎癥性腸?。ɡ缈肆_恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎）[24]。LCK 是一種通過T細(xì)胞抗原受體進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的非受體蛋白酪氨酸激酶[25]，在T細(xì)胞發(fā)育的幾個(gè)階段需要基于TCR的信號(hào)傳導(dǎo)，每個(gè)基于T 細(xì)胞抗原受體的信號(hào)都需要Src 家族激酶，而LCK 起主要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)LCK與小鼠膿毒癥預(yù)后呈正相關(guān)[26]。而我們的GO分析結(jié)果顯示T 細(xì)胞受體通路確實(shí)被激活，這也再次支持了我們的推測(cè)。

4 結(jié)論

CD247，LCK等核心基因可能通過T細(xì)胞受體通路促進(jìn)膿毒癥患者的免疫功能，從而達(dá)到殺滅病原微生物的作用，影響患者的預(yù)后。研究與膿毒癥相關(guān)的CD247，LCK核心基因生物學(xué)功能和代謝途徑，有利于從基因水平尋找早期診斷膿毒癥的生物學(xué)標(biāo)志物和治療膿毒癥的藥物靶點(diǎn)，但這些核心基因在膿毒癥中的相關(guān)作用，仍需進(jìn)一步研究和證實(shí)。

（利益沖突：無）