張美鳳，游瀟瀟，陳 龍，孫正帆，郭 玲

西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科（瀘州 646000）

氟斑牙是由于在牙齒發(fā)育階段長期攝入過量氟化物而導(dǎo)致牙齒結(jié)構(gòu)異常的一種獲得性疾病，表現(xiàn)為不透明、無光澤的白堊色、褐色斑塊甚至實質(zhì)性缺陷[1-2]。目前對氟斑牙的治療主要采用粘接修復(fù)的方式，如貼面、嵌體、髓腔固位冠等[3-4]。以往研究多集中在氟斑牙牙釉質(zhì)粘接，對于牙本質(zhì)粘接的報道較少。事實上，受氟中毒影響的牙本質(zhì)可以顯著地以牙本質(zhì)低礦化和牙本質(zhì)小管紊亂的形式出現(xiàn)，其膠原纖維排列異常導(dǎo)致間隙大小不均，部分牙本質(zhì)小管甚至被礦物鹽阻塞[5-6]。這些變化會阻礙粘接劑向牙本質(zhì)小管和脫礦的膠原纖維網(wǎng)中滲透，影響混合層和樹脂突的形成，最終降低氟斑牙牙本質(zhì)的粘接強度。有文獻報道稱，氟斑牙牙本質(zhì)的粘結(jié)強度較正常牙本質(zhì)粘接強度更低[3，7-10]。

牙本質(zhì)粘接技術(shù)發(fā)展至今，全酸蝕粘接仍被視為評價牙本質(zhì)界面粘接有效性的“金標準”。這種粘接方式可達到更大的脫礦深度，通過粘接劑充分滲透到脫礦區(qū)域可獲得良好的粘接效果。然而，因粘接劑滲透深度小于脫礦深度，混合層底部留下大量未被樹脂包裹的裸露的膠原纖維，在水的參與下極易被內(nèi)源性酶降解[11]。近年提出的二甲基亞砜（dimethl sulfoxide，DMSO）粘接技術(shù)有望解決這一問題[12-15]。DMSO[分子式（CH3）2SO]是一種極性非質(zhì)子溶劑，可溶解極性和非極性化合物。高濃度DMSO 能夠可逆地將牙本質(zhì)基質(zhì)中高度交聯(lián)的膠原蛋白解離成疏松多孔的膠原纖維網(wǎng)絡(luò)[16]。有文獻報道，DMSO預(yù)處理使混合層底部膠原纖維裸露程度降低85.3%[17]。膠原纖維間距增大很可能促進粘接劑向更深處的脫礦區(qū)域滲透，從而減少混合層底部膠原纖維暴露。此外，DMSO可以破壞水的自蒂合趨勢[18-19]。雖然水作為功能介質(zhì)，積極參與混合層的形成，但多余的水也造成了粘接界面的降解。而DMSO可能會阻止水在膠原分子表面的聚集，暴露出膠原上更多樹脂功能單體的結(jié)合位點[20-21]。

根據(jù)DMSO 的這些特性，本研究將DMSO 應(yīng)用于氟斑牙上，分別研究DMSO 預(yù)處理在不同程度氟斑牙牙本質(zhì)干燥和濕潤狀態(tài)對粘接強度和界面形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 準備

1.1.1 材料與儀器 Adper Single Bond2 牙本質(zhì)粘接劑，F(xiàn)iltek Z350 復(fù)合樹脂，35%磷酸酸蝕劑，二甲基亞砜（≥99.95%），超聲蕩洗機，萬能材料試驗機（WDW-20，中國濟南伊諾），場發(fā)射電子顯微鏡（Inspect F50，美國FEI），激光共聚焦顯微鏡（TSC SP8，德國Leica）常規(guī)口腔治療器械等。

1.1.2 樣本收集 選取四川省瀘州市古藺、敘永縣口腔科門診因牙周病或正畸治療拔除的120 顆氟斑牙。納入標準：①牙體發(fā)育完全，根尖孔已閉合；②無牙體缺損，未行充填治療或根管治療；③前磨牙或磨牙。排除標準：①牙體發(fā)育不全，根尖孔未閉合；②牙體缺損，已行充填治療或根管治療；③非前磨牙或磨牙。

1.2 分組

將120 顆氟斑牙按照Thylstrup-Fejerskov 指數(shù)（TFI）分為3 個大組：輕度組（TFI=1-3）、中度組（TFI=4-5）和重度組（TFI=6-9）。每個大組下又隨機分為4 個亞組（共12 組），即干粘接組、DMSO 干粘接組、濕粘接組和DMSO濕粘接組。

1.3 實驗步驟

1.3.1 樣本處理 在清理軟組織和牙結(jié)石后，所有樣本保存在4°C，1%的氯胺溶液中備用。樣本包埋固定在超硬石膏，用低速切割機將其截斷至釉牙本質(zhì)界下約2 mm，得到新鮮平坦的牙本質(zhì)面。暴露的牙本質(zhì)用600目碳化硅砂紙濕拋光1 min，得到標準的玷污層。在蒸餾水中超聲蕩洗5 min后，按照表1分組進行操作。

表1 不同分組的操作步驟Table 1 Operating steps for different groups

1.3.2 粘接強度測試96 個樣本按照氟斑牙嚴重程度和干預(yù)措施分為12個組（n=8）。分組進行酸蝕和預(yù)處理后，將打有孔徑為1 mm的雙面膠帶覆蓋于牙本質(zhì)面上。Single Bond2牙本質(zhì)粘接劑均勻涂抹于牙本質(zhì)表面（壓力約10 N），無水無油氣流輕吹5 s 后，光固化燈照射10 s至粘接劑固化。對應(yīng)每個小孔處放置內(nèi)徑為1 mm、高度為2 mm的透明聚乙烯模具，將Filtek Z350復(fù)合樹脂填充到模具中，光固化20 s，制成圓柱形樹脂柱，去除模具、膠帶和多余粘接劑。然后，將每個樣本固定在萬能試驗機上，用直徑0.2 mm的正畸鋼絲纏繞在每個樹脂微柱的底座上，鋼絲加力的方向與界面平行，進行微剪切粘接強度測試。以牙齒為統(tǒng)計學(xué)單位，用SPSS 25.0行雙因素方差分析得到結(jié)果，如表2所示。

1.3.3 掃描電鏡觀察 12 個樣本截除冠部牙釉質(zhì)后，將其切成約1 mm 厚的牙本質(zhì)盤（每個樣本至少可切4片），蒸餾水超聲蕩洗5 min。按照不同分組對牙本質(zhì)盤進行酸蝕和預(yù)處理，用2.5% 戊二醛0.1 mol/L，pH 7.2磷酸鹽緩沖液固定4 h。樣本在酒精梯度脫水和表面噴金后，在掃描電鏡下觀察樣本表面，如圖1所示。

1.3.4 激光共聚焦觀察 12 個樣本截除冠部牙釉質(zhì)后，將其切成約1 mm 厚的牙本質(zhì)盤。按照不同分組對牙本質(zhì)盤進行酸蝕和預(yù)處理，用Filtek Z350 復(fù)合樹脂制作形成4 mm×4 mm×3 mm 樹脂塊，再用含0.1%羅丹明B 染料的粘合劑將樹脂塊粘固。所有的樣本都按照垂直粘接面的方向切片，并用碳化硅砂紙拋光至透亮，蒸餾水超聲蕩洗5 min。最后使用激光共聚焦顯微鏡觀察切片的粘結(jié)界面形態(tài)，如圖2所示。本研究經(jīng)醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會審核批準。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用±s表示，對氟斑牙嚴重程度和粘接方式的影響進行雙因素方差分析，兩兩比較采用HSD 法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 粘接強度

雙因素方差分析結(jié)果顯示：氟斑牙嚴重程度（F=89.87，P<0.05）、粘接方式（F=200.29，P<0.05）均對粘接強度造成顯著性影響，且嚴重程度和粘接方式之間存在交互作用（F=3.17，P<0.05）。統(tǒng)計分析結(jié)果見表2。

表2 不同程度氟斑牙的微剪切粘接強度值（±s，MPa）Table 2 Microshear bond strength of dental fluorosis with different severity（±s，MPa）

表2 不同程度氟斑牙的微剪切粘接強度值（±s，MPa）Table 2 Microshear bond strength of dental fluorosis with different severity（±s，MPa）

注：不同的上標大寫字母表示每一列中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；不同的上標小寫字母表示每一行中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）

2.2 電鏡掃描

各組的牙本質(zhì)粘接面掃描電鏡觀察如圖1 所示。干粘接組可明顯看到牙本質(zhì)小管內(nèi)的裂紋，在輕中度組中呈條狀向小管深處延伸，重度組中條狀裂紋密集呈片狀分布，而管壁上有規(guī)律而緊密排列的膠原纖維。DMSO 干粘接組同樣有小管壁的裂紋，但裂紋數(shù)量和寬度均較干粘接組少。濕粘接組中牙本質(zhì)小管壁完整無明顯裂紋，管壁內(nèi)的膠原纖維蓬松交織分布，小管深處可見三維立體分布的膠原纖維網(wǎng)。DMSO 濕粘接中蓬松的膠原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)則更加明顯，占據(jù)了整個牙本質(zhì)小管，并向小管深處蔓延。

圖1 牙本質(zhì)表面的掃描電鏡圖（×50 000）Figure 1 Scanning electron microscope images of the dentin surfaces（×50 000）

2.3 激光共聚焦成像

各組縱切面的激光共聚焦觀察如圖2 所示。由于粘接劑中的羅丹明B能在特定波長的激光下發(fā)出紅色熒光，從而可以直觀地觀察到粘接界面的被染色的樹脂突微觀形貌。在干粘接組中可見從粘接面混合層向牙本質(zhì)中滲透的樹脂突，樹脂突密集分布，但長度較短。而濕粘接組樹脂突長度明顯增長，混合層厚度增加。DMSO干粘接組相對于干粘接組，樹脂突長度和密度增加，但相較于濕粘接組和DMSO 濕粘接組仍有差距。DMSO 濕粘接組在所有組別中樹脂突最長、最密集，混合層厚度也與濕粘接組相當。

圖2 樣本縱切面的激光共聚焦圖片（× 200）Figure 2 Confocal laser scanning microscopy images of longitudinal section of the samples（×200）

3 討論

氟斑牙是一種全球性的地方性疾病，我國更是全世界發(fā)病最嚴重的國家之一，其發(fā)生不僅損害了牙齒健康和美觀，還會給患者心理造成一定的負擔[3-4，22]。而臨床對氟斑牙的治療，如瓷貼面、嵌體、全瓷冠等，都離不開粘接修復(fù)[23]。因此粘接力的強弱對氟斑牙的治療顯得尤為重要。而氟斑牙牙釉質(zhì)的粘接力低，易被磨耗，在重度氟斑牙中牙釉質(zhì)甚至呈片狀剝脫，因此其可提供的粘接力有限。這種情況下，研究如何提高氟斑牙牙本質(zhì)粘接力就顯得尤為重要。有研究發(fā)現(xiàn)，無論是采用自酸蝕或者全酸蝕方式，氟斑牙牙本質(zhì)的粘接力始終低于正常牙本質(zhì)[8]。所以本實驗致力于尋找一種有效方案來提高氟斑牙牙本質(zhì)的粘接強度。

本研究發(fā)現(xiàn)，重度氟斑牙的牙本質(zhì)粘結(jié)強度始終低于輕度氟斑牙，而中度氟斑牙則介于兩者之間，與前人的研究結(jié)果一致[7，24]。尤其是重度的氟斑牙，其牙本質(zhì)粘接強度大幅減少，這可能與牙體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和成分的不規(guī)則有關(guān)。在牙齒發(fā)育過程中，高濃度氟化物會影響牙本質(zhì)磷蛋白、酪蛋白激酶II 和堿性磷酸酶的代謝[25-27]。磷酸化的減少降低了結(jié)合礦物的能力和晶體的啟動，從而導(dǎo)致礦物沉積的減少[28]。這種低礦化會表現(xiàn)為氟斑牙牙本質(zhì)小管形成不良和礦化不佳，進一步影響粘接效果。

然而，DMSO 預(yù)處理無論是在牙本質(zhì)干燥還是濕潤狀態(tài)下，都顯著提高了氟斑牙牙本質(zhì)粘接強度。以往這種結(jié)果都只在正常牙本質(zhì)中看到，尚未有報道DMSO 同樣可提高氟斑牙牙本質(zhì)粘接強度[29-31]。DMSO作為最佳醫(yī)學(xué)滲透增強劑之一，可能在牙本質(zhì)粘接界面形成中發(fā)揮了重要作用[15，32]。理想狀況下，粘接劑充分均勻地滲入脫礦牙本質(zhì)，置換出其中的水分并完全包裹膠原纖維，形成穩(wěn)定的粘接界面。而粘接界面主要是由粘接劑單體通過牙本質(zhì)小管（管內(nèi)滲透）以及管間牙本質(zhì)的膠原纖維間空隙（管間滲透）向脫礦牙本質(zhì)中滲透而形成。其中，管間滲透（混合層）是主要粘接力來源。膠原纖維間空隙作為粘接劑的滲透通道，是由于酸蝕脫礦后的膠原肽之間形成新的氫鍵而形成。溶劑除非能破壞肽間的氫鍵，否則不能重新膨脹基質(zhì)[33]。常見的能夠抑制肽間氫鍵的溶劑有水和乙醇，所以濕粘接和乙醇濕粘接技術(shù)相繼被提出。由于DMSO 也能抑制膠原纖維之間的肽間氫鍵，使基質(zhì)迅速膨脹，其在正常牙本質(zhì)粘接中的作用才被逐漸發(fā)掘[12]。本研究（圖1）發(fā)現(xiàn)，DMSO 也能夠使氟斑牙牙本質(zhì)中的膠原纖維解離成疏松擴張的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但在牙本質(zhì)干燥狀態(tài)下效果不顯著，可能是氣壓過強導(dǎo)致膠原纖維網(wǎng)皺縮坍塌（在干粘接組中見明顯的裂紋）。這種蓬松多孔的膠原纖維網(wǎng)有利于粘接劑單體的滲透，形成均一穩(wěn)定的混合層，并減少膠原纖維的裸露。這種“混合”的過程產(chǎn)生的微機械固位，可以顯著提高牙本質(zhì)-修復(fù)體粘結(jié)強度及粘結(jié)界面的密封性[34]。一些文獻報道，DMSO 預(yù)處理還可以增加牙本質(zhì)表面的潤濕性，使粘結(jié)劑的親水性成分更好地滲透[12，16，29]。因此，本團隊推測二甲基亞砜和氟斑牙牙本質(zhì)之間可能存在類似的增強作用。

顯微鏡和共聚焦成像技術(shù)的不斷發(fā)展使我們可以直觀地觀察物體表面的微觀形態(tài)[35-36]。本研究利用羅丹明B 熒光劑追蹤和顯示粘接界面，粘接劑單體在牙本質(zhì)小管（管內(nèi)滲透）中的滲透形成了粘接界面上數(shù)目眾多的樹脂突，是粘接力的重要組成部分[37]。共聚焦圖片（圖2）可以觀察到DMSO處理組獲得了明顯更長、更密集的樹脂突，混合層的厚度也有所增加，但在牙本質(zhì)干燥狀態(tài)下的效果較濕潤狀態(tài)下更差。不同程度氟斑牙的牙本質(zhì)之間的粘接界面也有明顯的差異。輕度組樹脂突長而致密，而重度組樹脂突相較之下更為稀疏、細小。本團隊推測氟斑牙的結(jié)構(gòu)和成分異?？赡苁亲璧K粘結(jié)劑滲透的原因。有研究指出，氟斑牙牙本質(zhì)礦化不良，表現(xiàn)為部分牙本質(zhì)小管被礦物鹽所阻塞，牙本質(zhì)小管不規(guī)則或出現(xiàn)彎曲[5-6]。然而，還需要進一步的研究來檢驗這一假設(shè)。

4 結(jié)論

DMSO 可以促進膠原纖維解離為疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加粘接面的樹脂突長度，從而增強氟斑牙牙本質(zhì)粘接強度。其在牙本質(zhì)濕潤狀態(tài)下的增強效果遠大于干燥狀態(tài)下，但粘接強度會隨著氟斑牙嚴重程度的加重而降低。

（利益沖突：無）