于永慧，段長(zhǎng)松，焦俊，趙月峨，周冬生，溫博海，歐陽譞，熊小路

軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

黑龍江立克次體(Rickettsia heilongjiangensis)是遠(yuǎn)東斑點(diǎn)熱(far eastern spotted fever，F(xiàn)ESF)的病原體，屬于斑點(diǎn)熱群立克次體(spotted fever group rickettsiae，SFGR)，1983年由我國科學(xué)家分離并鑒定，是我國主要的斑點(diǎn)熱流行株[1]。黑龍江立克次體為革蘭陰性專性胞內(nèi)寄生菌，在自然界中通過蜱叮咬感染人。人感染后，普遍出現(xiàn)多器官病灶炎性損傷、炎性浸潤及脾大等。脾臟作為立克次體感染的主要靶器官，是人體最大的外周免疫器官及成熟淋巴細(xì)胞聚集區(qū)，也是發(fā)生免疫應(yīng)答的重要器官。機(jī)體感染病原體后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答分為即刻天然免疫應(yīng)答(0～4 h)、早期誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答(4～96 h)及獲得性免疫應(yīng)答(>96 h)3個(gè)階段。有研究對(duì)恙蟲病立克次體感染內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，感染早期(1～3 h)有40個(gè)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生明顯變化，其中在感染3 h后白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、趨化因子CCL2(C-C motif chemokine ligand 2，CCL2)、IL-10等因子的表達(dá)明顯上調(diào)[2]。在康氏立克次體(Rickettsia conorii)感染小鼠3 d的肺部轉(zhuǎn)錄組研究中，有206個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)明顯上調(diào)、277個(gè)明顯下調(diào)。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T-lymphocyte，CTL)能夠通過識(shí)別被感染細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(major histocompatibility complex class I，MHC-Ⅰ)分子，分泌γ干擾素(IFN-γ)，以增強(qiáng)宿主抵抗澳大利亞立克次體(Rickettsia australis)感染的能力[3]。本研究分析了黑龍江立克次體感染后小鼠免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化，旨在明確機(jī)體抵抗黑龍江立克次體感染的免疫調(diào)控過程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與細(xì)胞株 黑龍江立克次體054株(Rickettsia heilongjiangensisstr. 054，ATCC VR-1524)為本實(shí)驗(yàn)室保存。非洲綠猴腎細(xì)胞E6株(Vero-E6)購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5周齡SPF級(jí)雌性C3H/HeN小鼠20只，體重14～15 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠在軍事醫(yī)學(xué)研究院豐臺(tái)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均符合軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

1.1.3 主要試劑及儀器 Trizol(15596-062)購自美國Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基(SH3022.01B)、胎牛血清(SH30070.03)、胰蛋白酶(SH30042.02)、磷酸鹽緩沖液(P BS，SH 3 0 2 5 6.0 1 B)購自美國Hyclone公司；復(fù)方泛影葡胺注射液(國藥準(zhǔn)字H31021607)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；異丙醇(80109218)、無水乙醇(10009218)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DEPC處理水(R1600)、去離子水(F0025)購自北京索萊寶科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱、超低溫冰箱購自日本Sanyo公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司；生物安全柜Ⅱ購自美國Nuaire公司；高速冷凍離心機(jī)購自美國Beckman公司；微量分光光度計(jì)購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 黑龍江立克次體培養(yǎng)及純化 復(fù)蘇Vero-E6細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，接種于T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶(每瓶約2×107個(gè))，置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞單層。按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=20將立克次體懸液加到預(yù)先培養(yǎng)好的Vero-E6細(xì)胞單層上，33 ℃吸附4 h。補(bǔ)充含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于33 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)感染黑龍江立克次體的Vero-E6細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的空斑樣脫落時(shí)富集細(xì)胞。富集的細(xì)胞經(jīng)玻璃珠破碎后，以400×g離心20 min，收集上清，采用泛影葡胺密度梯度離心法純化黑龍江立克次體[4]，菌體沉淀用PBS重懸，保存于–80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黑龍江立克次體感染小鼠 采用隨機(jī)抽樣法將20只小鼠分為未感染組(0 hpi)、感染3 h組(3 hpi)、感染3 d組(3 dpi)和感染6 d組(6 dpi)，每組5只。在Ⅲ級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，將5×106個(gè)菌落形成單位(CFU)的黑龍江立克次體自尾靜脈注射感染小鼠。在4個(gè)時(shí)相點(diǎn)解剖該組5只小鼠取脾，每個(gè)脾剪碎后稱取100 mg，立即置入裝有1 ml Trizol溶液的EP管中。使用手動(dòng)研磨器將脾臟研磨均勻，室溫靜置15 min后置于–20 ℃冰箱凍存，2 h后轉(zhuǎn)移至–80 ℃冰箱保存，待所有樣品收集完后提取總RNA。

1.2.3 總RNA提取及測(cè)序 每組取出凍存的樣品1 ml，在室溫解凍后采用Trizol法提取總RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)總RNA濃度、RIN值、28S/18S及片段大小。利用Oligo-dT磁珠純化mRNA，經(jīng)片段化處理后，進(jìn)行cDNA合成及磁珠純化，純化后的cDNA經(jīng)A堿基及Adapter連接并行磁珠純化，利用PCR反應(yīng)及磁珠純化獲得文庫檢測(cè)樣本。采用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行文庫檢測(cè)，測(cè)序由Illumina Solexa HiSeq 2000平臺(tái)完成，采用100 bp雙端測(cè)序，文庫使用插入片段330 bp的鏈特異性文庫，每個(gè)樣品設(shè)計(jì)測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出為40 M reads，數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為每個(gè)樣品8 GB。

1.2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析 采用Cut adapt(v1.15)對(duì)測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行過濾，得到純凈序列(clean reads)用于后續(xù)分析。采用TopHat2 v2.0.4軟件[5]將clean reads回貼至小鼠基因組(mm9)。采用軟件Cufflinks 2.0分析4個(gè)測(cè)序樣本回貼至基因組后的比對(duì)結(jié)果，重新構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本。單個(gè)樣本構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄本集合并不完全，或者可能并未構(gòu)建出全長(zhǎng)，因此用軟件Cuffcompare 2.0將4個(gè)樣本中鑒定到的所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行差補(bǔ)、均一化合并成統(tǒng)一的轉(zhuǎn)錄本矩陣(同一轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)多次采用最高的讀數(shù)作為該轉(zhuǎn)錄本的定量信息)[6]。采用軟件Cuffdiff 2.0計(jì)算4個(gè)測(cè)序樣本的JS散度(Jensen Shannon score，JS score)。

1.2.5 免疫相關(guān)特異性轉(zhuǎn)錄基因篩選 對(duì)小鼠基因進(jìn)行功能注釋分析，按照GO功能分類的天然免疫(GO:0045087)、獲得性免疫(GO:0002250)及炎癥反應(yīng)(GO:0006954)，將特異性轉(zhuǎn)錄基因中免疫相關(guān)基因提取出來。采用軟件Cuffdiff 2.0定量分析免疫相關(guān)基因的表達(dá)，篩選免疫相關(guān)顯著的特異性轉(zhuǎn)錄基因。篩選條件為：與感染前(0 hpi)相比，感染后3個(gè)時(shí)相免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄差異倍數(shù)|log2(Fold change)|>1。

1.2.6 功能富集分析 利用R包ClusterProfiler對(duì)黑龍江立克次體感染小鼠后轉(zhuǎn)錄差異基因進(jìn)行功能富集分析?；谌斯づ凶x文獻(xiàn)及基因注釋，選取天然免疫相關(guān)基因、獲得性免疫相關(guān)基因、炎癥反應(yīng)相關(guān)基因并進(jìn)行分析。KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)這3類基因顯著富集于參與感染相關(guān)過程的通路。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 轉(zhuǎn)錄差異基因通過JS score分析，用于度量?jī)蓚€(gè)概率分布的相似度，其取值為0～1間的連續(xù)變量，隨基因表達(dá)特異性增強(qiáng)而增大[7]，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值以JS score>0.9作為各時(shí)相特異性轉(zhuǎn)錄基因的篩選條件。GO與KEGG以轉(zhuǎn)錄組差異基因變化倍數(shù)|log2(倍數(shù))|>1為具有顯著性差異；免疫功能轉(zhuǎn)錄差異基因R語言功能富集以–log10(qvalue) >1.3為具有顯著性差異。P<0.05為顯著性富集。

2 結(jié) 果

2.1 黑龍江立克次體感染小鼠脾臟組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)樣品所有reads (讀長(zhǎng))的4種堿基分布均勻(圖1A)，且測(cè)序質(zhì)量>20(圖1B)，得到219 930個(gè)轉(zhuǎn)錄本(表1)，0 hpi、3 hpi、3 dpi、6 dpi 4個(gè)時(shí)相分別篩選出特異性轉(zhuǎn)錄基因164、152、90、122個(gè)。

圖1 miRNA測(cè)序reads質(zhì)量評(píng)估Fig. 1 Quality control of obtained sequencing reads

表1 清除冗余reads后的轉(zhuǎn)錄本及多外顯子數(shù)目Tab. 1 The number of transcripts and multi-exon after clearing redundant reads

2.2 時(shí)相轉(zhuǎn)錄差異基因GO富集分析 在顯著上調(diào)的前30個(gè)GO富集通路中，0 hpi時(shí)，小鼠脾臟MAPK信號(hào)通路、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、肌纖維組裝等基礎(chǔ)生理功能明顯上調(diào)(P<0.05)(圖2A)；3 hpi時(shí)，脾臟細(xì)胞中趨化因子受體結(jié)合、趨化因子活性、巨噬細(xì)胞等天然免疫反應(yīng)通路明顯上調(diào)(P<0.05)(圖2B)；3 dpi時(shí)，鳥苷酸激酶/L型鈣通道區(qū)域、蛋白酪氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶活性等明顯上調(diào)(P<0.05)(圖2C)；6 dpi時(shí)，抗生素、2Fe-2S鐵氧還蛋白、鐵硫蛋白結(jié)合位點(diǎn)、黃嘌呤脫氫酶等明顯上調(diào)(P<0.05)(圖2D)。

圖2 時(shí)相轉(zhuǎn)錄差異基因GO富集分析Fig. 2 GO enrichment analysis of phase transcription difference gene

2.3 免疫功能轉(zhuǎn)錄差異基因分析 GO注釋分析結(jié)果顯示，分別有35個(gè)天然免疫相關(guān)基因(圖3A)、31個(gè)獲得性免疫相關(guān)基因(圖3B)及41個(gè)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因(圖3C)轉(zhuǎn)錄發(fā)生顯著性變化(P<0.05)。維恩分析顯示，免疫相關(guān)特異性轉(zhuǎn)錄基因具有時(shí)相差異性及共同性，其中感染后3個(gè)時(shí)相(3 hpi、3 dpi、6 dpi)分別有7、6、6個(gè)基因特異性轉(zhuǎn)錄，有37個(gè)共同基因特異性轉(zhuǎn)錄(圖3D)。在天然免疫相關(guān)基因中，顯著特異性轉(zhuǎn)錄基因有irg1、ccl2、il12b、cd14、ubd、gbp10；在獲得性免疫相關(guān)基因中，顯著特異性轉(zhuǎn)錄基因有g(shù)zmb、batf、irf7、fcgr1、il18bp、cr2、c4b；在炎癥反應(yīng)相關(guān)基因中，顯著特異性轉(zhuǎn)錄基因有il27、nos2、cxcl11、cxcl10、cxcl9、il10。

圖3 小鼠感染黑龍江立克次體后3個(gè)時(shí)相免疫相關(guān)特異性轉(zhuǎn)錄基因分析Fig. 3 Immune-related specific transcription genes in 3 phases after mice infection of Reckettsia helongjinggensis

2.4 免疫功能轉(zhuǎn)錄差異基因R語言功能富集分析結(jié)果 早期激活信號(hào)受體通路、中期激活胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路、晚期激活細(xì)胞凋亡通路及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路貫穿黑龍江立克次體感染全過程，且在早期感染階段炎癥反應(yīng)相關(guān)基因顯著性富集(P<0.05) (圖4)。

圖4 免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄差異基因的R語言富集分析Fig. 4 R language enrichment analysis of immune-related transcriptional differential genes

2.5 免疫功能轉(zhuǎn)錄差異基因KEGG可視化功能分析結(jié)果 在黑龍江立克次體感染早期，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路中有21個(gè)基因顯著性富集，主要包含16個(gè)趨化因子家族基因，其中CC子集包含ccl3、ccl4、ccl8、ccl11、ccl12、ccr7、ccr3、ccr5共8個(gè)基因，CXC子集包含cxcl1、cxcl2、cxcl5、cxcl9、cxcl10、cxcl13、cxcl11、cxcr3共8個(gè)基因(圖5)。

圖5 細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路的KEGG可視化功能分析Fig. 5 KEGG visual function analysis of cytokine-cytokine receptor interaction signaling pathway

3 討 論

在自然界，立克次體通過節(jié)肢動(dòng)物的叮咬進(jìn)入宿主血液，沿血行擴(kuò)散到身體其他部位。有研究發(fā)現(xiàn)，Balb/c小鼠感染黑龍江立克次體后，出現(xiàn)類似人感染立克次體的特征，包括血源散布性、多器官病灶炎性損傷及炎性浸潤、脾大等[4]。本研究選用對(duì)斑點(diǎn)熱立克次體敏感的C3H/HeN小鼠作為模型鼠，采用尾靜脈注射的方法模擬節(jié)肢動(dòng)物叮咬，使黑龍江立克次體直接進(jìn)入小鼠血液循環(huán)系統(tǒng)引起感染。

在天然免疫進(jìn)程中，IFN-γ可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，使其對(duì)胞內(nèi)病原菌的殺傷作用顯著增強(qiáng)[8]，并具有誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1(T-helper 1，Th1)亞群分化、促進(jìn)CTL分化并增強(qiáng)其殺傷功能等多種免疫活性，是哺乳動(dòng)物對(duì)抗胞內(nèi)寄生菌入侵發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染黑龍江立克次體3 h后，與IFN-γ相關(guān)的gbp10、irg1、ccl2、ubd基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高；感染3 d后其表達(dá)量逐漸下降，但仍維持較高的水平，提示小鼠感染黑龍江立克次體后脾臟細(xì)胞對(duì)IFN-γ的應(yīng)答活躍。IL-12b是IL-12的一個(gè)亞基，IL-12由活化的巨噬細(xì)胞分泌，主要作用于T細(xì)胞及自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞，促進(jìn)其分泌IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α等細(xì)胞因子[10]。本研究結(jié)果顯示，小鼠感染黑龍江立克次體3 h后，IL-12b轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，提示NK細(xì)胞數(shù)量增加，IFN-γ大量產(chǎn)生，機(jī)體啟動(dòng)了抗立克次體天然免疫。CD14是革蘭陰性菌脂多糖(LPS)及LPS結(jié)合蛋白復(fù)合物的高親和力受體，能介導(dǎo)LPS對(duì)細(xì)胞的刺激作用，通過激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)兩條通路促進(jìn)IL-1、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的釋放[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染黑龍江立克次體3 h后，CD14基因轉(zhuǎn)錄水平升高約30倍，隨后逐漸下降，但仍維持在較高水平，提示黑龍江立克次體的LPS具有刺激CD14+免疫細(xì)胞增殖的作用。

獲得性免疫相關(guān)基因中，gzmb基因編碼一種絲氨酸蛋白酶(granzyme B，GZMB)，其主要來自CTL及NK細(xì)胞釋放的細(xì)胞質(zhì)顆粒。CTL在識(shí)別被感染細(xì)胞的膜表面異己成分后，通過釋放GZMB至被感染細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)被感染細(xì)胞凋亡，因此GZMB在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[12]。本研究結(jié)果顯示，gzmb是轉(zhuǎn)錄上調(diào)最顯著的獲得性免疫相關(guān)基因，提示感染6 d后，CTL通過細(xì)胞凋亡途徑高效、特異地殺傷感染立克次體的細(xì)胞?？贵wFc受體fcgr1基因在感染3 d、6 d后均轉(zhuǎn)錄上調(diào)，提示宿主產(chǎn)生抗體依賴的細(xì)胞毒作用，殺傷被立克次體感染的細(xì)胞。C4B補(bǔ)體活化相關(guān)基因在感染3 d后表達(dá)水平上調(diào)，提示補(bǔ)體系統(tǒng)參與了抗立克次體的免疫應(yīng)答。在宿主抗胞內(nèi)病原體感染過程中，Th1型免疫反應(yīng)發(fā)揮了重要作用。Th1型細(xì)胞可通過釋放IFN-γ、IL-12等細(xì)胞因子而活化巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，也可通過直接接觸誘導(dǎo)CTL分化[13]。根據(jù)基因功能注釋，il18bp基因與Th1型免疫反應(yīng)相關(guān)，其轉(zhuǎn)錄水平升高提示黑龍江立克次體感染激活了Th1型免疫反應(yīng)。batf基因編碼一種B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子，控制免疫細(xì)胞特別是Th17細(xì)胞的分化。batf基因在感染后轉(zhuǎn)錄上調(diào)并持續(xù)處于3倍以上的升高水平，提示Th17亦參與了抗立克次體感染的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

對(duì)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，感染后多種基因轉(zhuǎn)錄水平呈先升高后降低的趨勢(shì)，包括趨化因子CCL、CXCL及其相應(yīng)受體基因和白細(xì)胞介素基因等。小鼠感染黑龍江立克次體3 h后，CCL、CXCL等趨化因子轉(zhuǎn)錄水平升高，提示炎癥反應(yīng)啟動(dòng)，多種效應(yīng)細(xì)胞(如單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等)被募集活化參與抗感染免疫。其中轉(zhuǎn)錄上調(diào)明顯的ccl2可趨化單核/巨噬細(xì)胞到炎癥部位，cxcl10可趨化T淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞，介導(dǎo)Th1型炎性反應(yīng)?；罨木奘杉?xì)胞對(duì)胞內(nèi)病原菌具有強(qiáng)大的殺傷破壞作用。一氧化氮合酶(NOS)2是NOS家族3種亞型中的第2類，為誘導(dǎo)型NOS(iNOS)。NOS2能與L-精氨酸及氧發(fā)生作用，產(chǎn)生NO及L-瓜氨酸，其中NO具有殺滅病原體的作用。其轉(zhuǎn)錄水平在感染3 d后升高99倍，感染6 d后下降至30倍，提示感染3 d后免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生的NO較多，殺傷立克次體的活性較強(qiáng)。il27是轉(zhuǎn)錄上調(diào)最明顯的基因，其編碼的IL-27由激活的抗原提呈細(xì)胞分泌，具有促進(jìn)或抑制IFN-γ分泌的雙重作用，能雙向調(diào)節(jié)Th1型免疫反應(yīng)。IL-10是一種免疫抑制因子，可抑制Th1型反應(yīng)。本研究中il10基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，可能是IL-10通過抑制宿主抗立克次體免疫應(yīng)答，起到免疫調(diào)節(jié)、維持宿主免疫平衡的作用[14]。

綜上所述，C3H/HeN小鼠感染黑龍江立克次體后，在抗感染免疫的不同階段，脾臟中多種基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，包括35個(gè)天然免疫相關(guān)基因、31個(gè)獲得性免疫相關(guān)基因及41個(gè)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因。在感染早期，參與IFN-γ信號(hào)通路的irg1、gbp10基因及促炎因子轉(zhuǎn)錄上調(diào)，炎癥反應(yīng)啟動(dòng)；細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體信號(hào)通路中ccl4基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，多種免疫效應(yīng)細(xì)胞被募集活化。在獲得性免疫階段，參與細(xì)胞凋亡通路的gzmb基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，Th1及CTL細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抗立克次體感染中發(fā)揮了重要作用。本研究初步揭示了小鼠在抗黑龍江立克次體感染中的免疫調(diào)控過程，為了解遠(yuǎn)東斑點(diǎn)熱的致病過程及宿主免疫防御機(jī)制提供了依據(jù)。但本研究只是基于RNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，挑選出來的實(shí)際靶點(diǎn)如irg1、gbp10、gzmb、ccl2等關(guān)鍵宿主因子，仍需通過體外相互作用生化實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)敲低/敲除/過表達(dá)細(xì)胞系或小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。